裂解液和核酸提取试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种裂解液和核酸提取试剂盒。

背景技术：

核酸是自然界几乎所有生物的遗传物质，随着时代的发展，以核酸检测为基础的分子诊断技术日益受到人们的关注，如何提高制备的核酸质量和缩短核酸制备的时间是近年来本领域研究工作者的焦点。

目前，核酸提取的方法包括多种，例如：煮沸法、trizol法、磁珠法和离心柱法等。煮沸法操作过程较为简单，但是，得到的核酸杂质较多，对后续的pcr反应存在一定影响。trizol法常应用于提取rna，需要加入有机溶剂如氯仿和异丙醇，对人体健康会造成一定的影响，且该法程序复杂、耗时长、灵敏度较低、重复性较差。磁珠法得到的核酸样品纯度高，但是，该法操作过程复杂，耗费时间长，且需要依赖大型的仪器设备，成本较高。离心柱法提取的核酸纯度高，不依赖大型的仪器设备，操作方便，近年来已逐渐成为核酸分离纯化的主流技术，深受研究者们的青睐。离心柱法提取核酸的原理就是在离心吸附柱内使用一种能够特异性吸附核酸的滤膜，然后通过不断离心，来使滤膜与核酸结合，之后漂洗，再将滤膜上吸附的核酸洗脱下来。然而，离心柱法所需花费的时间较长，仍然不能满足生物分子快速诊断的要求，制约着离心柱法的广泛应用。

zouy等在《nucleicacidpurificationfromplants》一文中提出了利用滤纸片进行核酸提取的方法，虽然该法解决了提取速度的问题，但是其rna提取过程中仍需要使用蛋白酶k，且受限于滤纸片的核酸吸附性能，其提取的核酸更适合进行定性分析。中国专利201810505203.4对zouy的方法做了进一步的改进，但是，其提取的方法仍然更适合提取dna，不能同时高效地提取dna和rna。因而，目前的裂解液在进行核酸提取的过程中，往往需要用到醇类和蛋白酶等物质，只适用提取dna或rna，且所需花费时间较长，平均提取成本较高。因此，亟需一种快速、低成本的裂解液来进行核酸提取，特别是同时适用dna和rna的提取。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种裂解液和核酸提取试剂盒，旨在解决现有技术进行核酸提取时所需提取时间长，且只适用提取dna或rna的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种裂解液，包括：异硫氰酸胍、十二烷基磺酸钠、tritonx-100、正辛酸钠和tris-hcl缓冲液；

所述异硫氰酸胍的工作浓度为5-50mm；

所述十二烷基磺酸钠的工作浓度为1-3mm；

所述tritonx-100的工作浓度为0.1vol％-1vol％；

所述正辛酸钠的工作浓度为0.1-10mm。

本发明提供的裂解液，包括具有特定工作浓度的异硫氰酸胍、十二烷基磺酸钠、tritonx-100、正辛酸钠，异硫氰酸胍、十二烷基磺酸钠、tritonx-100、正辛酸钠协同作用，赋予了本发明裂解液对细胞或病毒良好的裂解功能，可同时适用dna和rna的提取，并能保证核酸一级结构的完整性，且可促进核酸吸附，缩短核酸提取时间，从而实现对核酸的高效、快速提取。

本发明的另一方面，提供了一种核酸提取试剂盒，包括：上述裂解液，以及核酸吸附棒和洗涤液；

所述核酸吸附棒具有吸附部，且所述吸附部具有能够吸附核酸的材料。

本发明提供的核酸提取试剂盒，集核酸提取、核酸吸附和核酸洗涤于一体，核酸提取利用上述裂解液，裂解能力强且可促进核酸吸附，可显著缩短核酸提取时间，促进核酸快速提取，降低提取成本。

附图说明

图1为本发明测试例2中对照组2和实验组2提取的甲流病毒核酸的荧光pcr对比结果，附图中的纵坐标为荧光单位，横坐标为循环数；

图2为本发明测试例3中的hpv分型基因芯片检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了解决现有方法进行核酸提取时所需提取时间长，且只适用提取dna或rna的技术问题，本发明实施例提供了一种裂解液，包括：异硫氰酸胍、十二烷基磺酸钠、tritonx-100、正辛酸钠和tris-hcl缓冲液；

所述异硫氰酸胍的工作浓度为5-50mm；

所述十二烷基磺酸钠的工作浓度为1-3mm；

所述tritonx-100的工作浓度为0.1vol％-1vol％；

所述正辛酸钠的工作浓度为0.1-10mm。

具体的，所述异硫氰酸胍为一种非离子型去污剂，能迅速破碎细胞或病毒释放核酸，并能抑制细胞释放出的核酸酶，保证核酸一级结构的完整性。与盐酸胍等常见的核酸裂解试剂相比，本发明实施例避免了额外添加蛋白酶抑制剂，节省了原料成本。进一步的，所述异硫氰酸胍的工作浓度为5-50mm，更具体地为5、7、10、13、15、16、18、20、23、25、26、30、32、33、37、40、41、45、47、50mm，显著低于现有试剂中异硫氰酸胍的3-7m。

具体的，所述十二烷基磺酸钠(sds)为一种非离子型去污剂，可溶解脂蛋白，解聚核蛋白。在本发明实施例中，sds的加入，可提高裂解液对细胞或病毒的裂解能力，促进核酸的释放，并降低异硫氰酸胍的用量，使得本发明实施例的裂解液在后续漂洗工序时容易被漂洗除去，避免异硫氰酸胍残留影响后续的pcr扩增反应，且能缩短核酸提取的时间，降低提取成本。进一步的，sds的工作浓度为1-3mm，更具体地为1、2、3mm，在该浓度范围下的sds既促进了核酸的释放，又避免了高浓度sds导致的sds残留，以及sds残留引发的一系列问题。在一优选实施例中，sds的工作浓度为1-2mm。

具体的，tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚)是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂)，能溶解脂质，以增加细胞膜对抗体的通透性。在本发明实施例中，加入tritonx-100，一方面，tritonx-100与sds协同作用，可以提高对细胞或包膜病毒表面膜结构的裂解能力，促进核酸释放；另一方面，漂洗后残留的tritonx-100在后续进行的分子诊断过程中，例如pcr扩增，能发挥拮抗残留sds的作用，抑制残留sds对后续过程的影响。进一步的，所述tritonx-100的工作浓度为0.1vol％-1vol％，更具体地为0.1vol％、0.3vol％、0.5vol％、0.6vol％、0.9vol％、1vol％。

具体的，正辛酸钠能够破坏细胞或包膜病毒的膜结构，使细胞或病毒破裂释放dna或rna。在本发明实施例中，正辛酸钠的加入，提高了sds对细胞或包膜病毒表面膜结构的裂解能力，将正辛酸钠与sds联用，可适当减少sds的用量，减小sds可能带来的副作用。进一步的，所述正辛酸钠的工作浓度为0.1-10mm，优选为0.1-1mm，更优选为5-10mm。

具体的，所述tris-hcl缓冲液构成本发明实施例的裂解液的溶液体系，可以理解的是，该溶液体系中含有适量的水。进一步的，在该裂解液中，所述tris-hcl缓冲液的工作浓度为1-50mm，ph为4.0-8.0。

在本发明实施例中，本发明实施例提供的裂解液，包括具有特定重量份配比的异硫氰酸胍、十二烷基磺酸钠、tritonx-100、正辛酸钠，在异硫氰酸胍、十二烷基磺酸钠、tritonx-100、正辛酸钠协同作用下，具有对细胞或病毒良好的裂解功能，可缩短裂解时间。在一实施例中，所述裂解时间可缩短至1min-2min。

在本发明实施例中，所述裂解液用于裂解细胞或病毒的包膜结构，以释放核酸。进一步的，所述裂解液的使用基于离心柱法，在所述裂解液充分裂解待提取样本后，直接在裂解液中采用核酸吸附材料进行核酸吸附，因而，裂解液的成分组成影响着核酸吸附效果，在具有特定重量份配比的异硫氰酸胍、十二烷基磺酸钠、tritonx-100、正辛酸钠协同作用下，不仅使得本发明裂解液具有优异的裂解功能，还能够促进核酸吸附材料吸附核酸，缩短核酸提取过程。

在本发明实施例中，所述裂解液的ph范围影响着核酸吸附效果，所述裂解液的ph优选为4-8，更优选为4-6、5-7或5-6。作为优选的实施方式，所述裂解液的ph为5-6，核酸吸附材料使用硅纤维吸附材料，尤其是玻璃纤维和/或二氧化硅气凝胶，使得所述裂解时间缩短至1min，且核酸吸附的时间缩短至1min。

另一方面，基于上述技术方案，本发明实施例提供了一种核酸提取试剂盒，包括：上述裂解液，以及核酸吸附棒和洗涤液；

所述核酸吸附棒具有吸附部，且所述吸附部具有能够吸附核酸的材料。

本发明提供的核酸提取试剂盒，集核酸提取、核酸吸附和核酸洗涤于一体，核酸提取利用上述裂解液，裂解能力强且可促进核酸吸附，可显著缩短核酸提取时间，促进核酸快速提取，降低提取成本。

具体的，本发明实施例提供的核酸提取试剂盒的使用基于离心柱法原理，在裂解提取核酸时采用裂解液，所述裂解液的成分组成及其作用效果请参阅上文记载的内容，为了节省篇幅，在此不再一一赘述。

具体的，所述核酸吸附棒用于特异性吸附裂解液对细胞或病毒进行裂解后释放的核酸片段。在本发明实施例中，所述核酸吸附棒具有吸附部，且所述吸附部具有能够吸附核酸的材料。可以理解的是，所述能够吸附核酸的材料包括但不限于纤维素滤纸或硅基纤维素材料。

作为优选的实施方式，所述能够吸附核酸的材料为硅纤维材料，更具体的，所述硅纤维材料优选为玻璃纤维和/或二氧化硅气凝胶。

进一步的，所述核酸吸附棒经过冷萃处理，可以理解的是，至少所述吸附棒经过冷萃处理。通过冷萃处理，可增大材料的通透性，从而增加用于吸附的表面积。在一实施例中，所述冷萃处理包括：将所述核酸吸附棒于-80℃-8℃的环境下，存放12-72小时。

作为另一优选的实施方式，所述吸附部为向外膨胀形成的凸起，可以理解的是，所述向外膨胀为所述核酸吸附棒的其中一个用于吸附核酸的端部沿其长度方向和/或其径向向外延伸，所述凸起包括但不限于圆柱形凸起结构、方形凸起结构、反射性结构。在一实施例中，所述向外膨胀形成的凸起为反射性结构，通过将所述核酸吸附棒的其中一个端部裁剪为1mm×2mm×10mm的小条或小型圆柱形并向外分散获得。如此，可进一步地提高吸附部的表面积，增加核酸吸附的表面积。

作为又一优选的实施方式，所述核酸吸附棒为复合层结构，沿其轴心向外，依次包括棒体和核酸吸附材料层，所述核酸吸附材料层包裹所述棒体。

具体的，所述洗涤液为核酸吸附之后用于漂洗核酸吸附棒上杂质的溶液。作为优选，所述洗涤液包括：吐温20和tris-hcl缓冲液，所述吐温20的工作浓度为0.1vol％-1vol％。进一步的，在该洗涤液中，所述tris-hcl缓冲液的浓度为1-5mm，ph为4.0-8.0。

作为一优选的实施方式，所述核酸提取试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液优选为depc水，depc水为采用depc(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的miliq纯水，为无色液体。

使用本发明实施例的核酸提取试剂盒时，将待提取样本与所述裂解液进行混合，待充分裂解后，将核酸吸附棒的吸附部浸于混合液中，应理解为完全吸附之后，取出该核酸吸附棒，并采用洗涤液清洗，之后将清洗后的核酸吸附棒上吸附的核酸进行洗脱即可。在一实施例中，从将待提取样本与裂解液到洗脱这一过程的总花费时间为6min，仅为现有方法所需时间的1/9。其中，在混合时，待提取样本与裂解液的体积比为1:1；将核酸吸附棒的吸附部浸于混合液中的步骤中，核酸吸附的时间为2min以上；采用洗涤液清洗的步骤中，清洗次数约40次，所述清洗可理解为手动震动清洗，每震动1次为清洗1次。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例一种裂解液和核酸提取试剂盒的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。

实施例1

本实施例提供了一种核酸提取试剂盒，其制备包括以下步骤：

1、裂解液的制备

提供原材料，然后按表1所述配方将各原料进行混合，然后调节ph至6，获得裂解液，之后10ml/瓶进行分装。

表1

2、核酸吸附棒的制备

取玻璃纤维膜和凝胶二氧化硅毛毡，放入-80冰箱，冷冻过夜；然后，将气凝胶二氧化硅毛毡和玻璃纤维膜用胶水固定到棒柄上，干燥过夜，并随后进行超声清洗处理6min。

3、洗涤液的制备

提供原材料，然后按表2所述配方将各原料进行混合，然后调节ph至6.8，获得洗涤剂，之后10ml/瓶进行分装。

表2

4、洗脱液的制备：取depc水作为洗脱液，分装为5ml/瓶。

测试例1

取50例甲型流感咽拭子标本，分别用1ml生理盐水进行简单清洗后，随机分为两组，分别为实验组1和对照组1。实验组1采用实施例1的核酸提取试剂盒进行dna/rna提取(裂解2min，吸附1min，手动震动清洗40次，洗脱2min)；对照组1采用来源于天根生化科技的病毒基因组dna/rna提取试剂盒(dp315)，核酸提取步骤参考其说明书(离心柱法)。

统计实验组1和对照组1的核酸提取的总时间，发现实验组1仅需6min，而对照组1需要45min，说明本发明实施例所提供的核酸提取试剂盒可显著缩短核酸提取的时间。

分别收集实验组1和对照组1获得的核酸，然后用nanodrop分析核酸的纯度，纯度分析结果如表3所示，实验组1和对照组1的260/280比值大于1.8，说明本发明实施例在显著缩短核酸提取的时间下，还能保证较高的纯度。

表3

测试例2

取甲型流感咽拭子标本，采用磁珠法进行核酸提取，作为对照组2；取甲型流感咽拭子标本以及本发明实施例1的核酸提取试剂盒，进行核酸提取，作为实验组2。然后，将对照组2和实验组2提取到的甲流病毒核酸在bio-rad荧光定量pcr仪中扩增。

图1为对照组2和实验组2提取的甲流病毒核酸的荧光pcr对比结果，结果显示，实验组2与对照组2的结果线型以及ct值等无显著差异，一致性良好。

测试例3

取hpv16、hpv18、hpv阴性、hpv52等宫颈采样拭子标本，以及实施例1的核酸提取试剂盒，分别将各hpv分型的宫颈采样拭子标本浸没于裂解液2min，然后，插入核酸吸附棒并使得吸附部完全浸没于裂解液中吸附1min，取出核酸吸附棒插入洗涤液中清洗40次，取出，插入洗脱液中洗脱2min，收集洗脱的核酸样品。

采用中国专利201810971577.5提供的一种用于检测hpv的试剂盒，进行pcr扩增，然后进行hpv分型基因芯片检测，图2为检测结果，hpv16、hpv18、hpv阴性、hpv52等标本的结果符合预期，说明采用本发明实施例的核酸提取试剂盒可进行现场提取和现场检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。