一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用的制作方法

本发明涉及视网膜神经退行性疾病药物制备技术领域，具体涉及一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用。

背景技术：

随着炎性眼病和光学相关眼病逐渐得到有效控制，视网膜神经退行性疾病已成为当今世界不可逆致盲的主要原因，影响着数以千万人的视力健康。如视网膜色素变性(retinitispigmentosa，rp)、年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，amd)及leber氏黑曚(lebercongenitalamaurosis，lca)等。

此类疾病目前尚无有效治疗办法，影响数以千万人的视力健康和生活质量，是导致我国视力残疾和盲的主要因素。因此，迫切需要探索新颖有效的治疗方式，恢复和重建视觉系统的结构与功能。上述疾病中，视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium,rpe)是主要的起始损害因素。rpe是位于神经视网膜与bruch’s膜之间的单层细胞，具有吞噬感光细胞外节、分泌营养因子、参与视循环代谢和形成血—视网膜屏障等功能，对于维持视网膜正常生理功能十分重要。视网膜色素上皮细胞的吞噬功能受损将导致amd、rp及lca等视网膜退行疾病的发生。

gas6蛋白具有改善视网膜微环境，促进基因治疗或细胞治疗发挥作用的治疗潜能。但gas6蛋白在临床转化应用中仍存在以下问题：单次注射的干预方式导致生物效应比较短暂，而反复多次的视网膜下腔注射会带来众多并发症以及患者的依从性问题等。因此，如何实现gas6蛋白的有效临床干预，并在视网膜微环境长期发挥作用，从而上调rpe吞噬等功能，延缓疾病损害，成为本领域着重解决的技术问题。

近年，缓释给药技术及纳米包被技术为蛋白缓释给药提供了较好的技术途径，但在制作过程中蛋白等大分子物质极易受到物理、化学因素影响而失去活性，gas6蛋白并不能实现有效临床干预。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用。本发明所述活性肽具有与gas6全长蛋白相似生物特性，分子量小，不易失活，具有提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的作用。

本发明提供了一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽，所述活性肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。

优选的是，所述活性肽的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的药物，所述药物包括上述技术方案所述活性肽。

优选的是，所述药物还包括mertk。

本发明还提供了上述技术方案所述活性肽在制备预防或治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。

本发明提供了一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽。本发明所述活性肽具有与gas6全长蛋白相似生物特性，具有提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的作用；且同时由于分子量小，具有较好的生物稳定性，更适用于缓释给药材料的包被制作；适用于视网膜退行疾病治疗中长效缓释作用，改善病变微环境，辅助细胞治疗、基因治疗等技术提供治疗效果。

附图说明

图1为本发明提供的用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽的三级结构图；

图2为本发明实施例1提供的gas6不同功能片段活性肽的构建表达结果；

图3为本发明实施例1提供的gas6不同片段活性肽处理rpe细胞后，akt磷酸化水平变化结果；

图4为本发明实施例1提供的rpe吞噬3h后激光共聚焦结果；

图5为本发明实施例1提供的mer^-/-小鼠经不同干预后erg的b波反应结果。

具体实施方式

本发明提供了本发明提供了一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽，所述活性肽的氨基酸序列如seqidno.1所示：dqctpnpcdrkgtqacqdlmgnffclckagwggrlcdkdvnecsqenggclqichnkpgsfhcschsgfelssdgrtcqdidecadseacgearcknlpgsysclcdegfayssqekacrdvdeclqgrceqvcvnspgsytchcdgrgglklsqdmdtcedilpcvpfsvaksvkslylgrmfsgtpvirlrfkrlqptrlvaefdfrtfdpegillfagghqdstwivlalragrlelqlryngvgrvtssgpvinhgmwqtisveelarnlvikvnrdavmkiavagdlfqperglyhlnltvggipfhekdlvqpinprldgcmrswnwlngedttiqetvkvntrmqcfsvtergsfypgsgfafysldymrtpldvgtestwevevvahirpaadtgvlfalwapdlravplsvalvdyhstkklkkqlvvlavehtalalmeikvcdgqehvvtvslrdgeatlevdgtrgqsevsaaqlqerlavlerhlrspvltfagglpdvpvtsapvtafyrgcmtlevnrrlldldeaaykhsditahscppvepaaa。用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽的三级结构图如图1所示。

gas6蛋白在临床转化应用中存在以下问题：单次注射的干预方式导致生物效应比较短暂，而反复多次的视网膜下腔注射会带来众多并发症以及患者的依从性问题等；由于gas6蛋白属于蛋白质大分子，具有脆弱易变的高级结构，在缓释材料包被过程中极易导致蛋白变性失活而不再适用，gas6蛋白并不能实现有效临床干预，并在视网膜微环境长期发挥作用，从而上调rpe吞噬等功能，延缓疾病损害。

本发明根据gas6蛋白功能域，分段克隆，其中egf-lamining功能域序列为主要活性肽序列(命名为gas6-lamining活性肽，g3，即本发明活性肽)，gas6-lamining活性肽与gas6全长蛋白相比，分子量小，但具有相似的作用，都可显著上调akt磷酸化水平，可以促进rpe细胞吞噬功能的发挥，并辅助延缓视网膜退行病变。本发明所述gas6-lamining活性肽在缓释制剂的制备过程中能够保持蛋白的自然形态和生物活性，能够提高药效学特性及给药便捷性。

本发明通过构建分子量相对较小的gas6功能活性肽的体外表达和纯化系统获得本发明所述活性肽。本发明对所述体外表达和纯化方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规蛋白表达和纯化系统即可。

在本发明中，所述活性肽的核苷酸序列如seqidno.2所示：

本发明还提供了一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的药物，所述药物包括上述技术方案所述活性肽。

在本发明中，所述药物优选还包括mertk。本发明所述药物通过将活性肽联合mertk基因治疗，或联合细胞移植替代治疗，进一步协同促进视网膜色素上皮细胞吞噬功能，改善病变。

本发明还提供了上述技术方案所述活性肽在制备预防或治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

根据gas6蛋白功能域，分段克隆，其中egf-lamining功能域序列为主要活性肽序列(g3，命名为gas6-lamining活性肽)。构建gas6基因各功能域序列真核、原核表达系统，进行了体外表达和纯化(gas6不同功能片段活性肽的构建表达结果如图2所示，其中，a:构建的egf质粒在真核细胞的表达，10倍物镜；b:构建的lamining质粒在真核细胞的表达，10倍物镜；c:构建的egf-lamining质粒在真核细胞的表达，10倍物镜；d-f:对应的20倍物镜观察)。由图2可知，构建的几种短肽都能在细胞正常表达。将不同浓度(200ng/ml、800ng/ml)纯化得到的gas6-lamining活性肽处理体外培养的rpe细胞，检测mertk下游akt磷酸化水平(提示细胞吞噬通路的启动)，结果显示gas6-lamining活性肽与gas6全长蛋白具有相似的作用，都可显著上调akt磷酸化水平(gas6不同片段活性肽处理rpe细胞后，akt磷酸化水平变化结果如图3所示，其中，横坐标:c30min:空白对照组(正常培养基处理30分钟)；g3(200)30min：含200ng/ml的gas6-lamining活性肽培养基处理细胞30分钟组；g3(800)30min：含800ng/ml的gas6-lamining活性肽培养基处理细胞30分钟组；g(200)30min：含200ng/ml的gas6全长蛋白培养基处理细胞30分钟组；g(2800)30min：含800ng/ml的gas6全长蛋白培养基处理细胞30分钟组；纵坐标：蛋白印记检测结果，pakt/gapdh(内参)的灰度值相对值)。

在体外rpe细胞吞噬模型中，可见在不同干预后，对照组rpe细胞吞噬能力较强，吞入盘膜较多且完整，mertk/gas6-lamining活性肽联合干预组吞噬的盘膜内容虽少于野生对照组，但多于mertk单独干预组，各组间统计差异显著(p<0.05)(rpe吞噬3h后激光共聚焦结果如图4所示，其中，a-d:对照组，e-h:mertk干预组，i-l:mertk+gas6-lamining活性肽组，绿色的a、e、i：盘膜-fitc，红色的b、f、j：actin，紫色的c、g、k，tublin，蓝色的d、h、l:dapi.bar＝30um)。结果证实：gas6-lamining活性肽具有分子量小，生物性稳定的特点，并与gas6全长蛋白生物学特性相似，具有提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的作用。

连续选取p17mer^-/-小鼠作为实验动物，将外源mertk/gas6lamining活性肽植入视网膜下腔(mertk单独干预组，mertk/gas6lamining活性肽联合干预组以及空白对照组)。术后第八周利用视觉电生理检测视功能的改善能力，各组间对比，分析改变的差异。电生理检查结果显示，代表视杆细胞和rpe功能的b波(暗适应0.01erg)，mertk/gas6lamining活性肽联合移植组和mertk单独移植组波幅都显著高于对照组；且联合干预组提高最为显著(p<0.01，图5为mer^-/-小鼠经不同干预后erg的b波反应(暗适应0.01erg))。证明mertk/gas6lamining活性肽联合干预能够提高mer^-/-小鼠视觉功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>首都医科大学附属北京同仁医院

<120>一种用于提高视网膜色素上皮细胞吞噬功能的活性肽及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>561

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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151015

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<210>3

<211>1683

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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ggcaacttcttctgcctgtgtaaagctggctgggggggccggctctgcgacaaagatgtc120

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