一种漆酶高效降解四环类和磺胺类抗生素的方法与流程

本发明涉及酶工程与技术和发酵技术领域，尤其涉及一株密孔菌发酵产漆酶用于高效降解四环类和磺胺类抗生素的方法

背景技术：

残留在环境中的抗生素(antibiotics)，被认为是一类新兴污染物，给人类的健康和生态系统的稳定造成了极大的风险。近年来，如何去除残留在环境中的抗生素引起了人们的广泛关注。抗生素在医药、水产养殖等行业中广泛地应用，目前已经是世界上用量最大、使用最广泛的药物之一。近年来，漆酶在抗生素的降解中扮演了重要的角色。然而，现有的研究反应时间需要几个小时甚至几天以上，而且国内用于抗生素降解的漆酶主要用的都是进口的商品化漆酶，价格昂贵，降解效果并不理想，很难实现规模化应用，并且我们很难得到自主的知识产权。为了解决这一问题，我们除了对现有菌株进行基因改造、菌种改良等策略外，筛选新型的漆酶菌株、对天然漆酶进行性质及应用研究依然具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服目前全世界暂时都没有找到合适的可高效降解四环类和磺胺类抗生素的酶缺陷，提供一种漆酶高效降解四环类和磺胺类抗生素的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种漆酶高效降解四环类和磺胺类抗生素的方法，包括以下步骤：

s1、采用密孔菌pycnoporussp.sybc-l10发酵产漆酶；

s2、首先将含有四环类抗生素或磺胺类抗生素的废液ph调至3.0-6.0，然后加入s1中得到的漆酶，同时加入小分子介体abts或者丁香醛，静置孵育一段时间即可。

s1中漆酶生产制备工艺可采用如下步骤：

(1)菌的活化：将所述密孔菌pycnoporussp.sybc-l10划线接种于pda斜面培养基，30℃培养3-4d；pda培养基组成：土豆200gl^-1,葡萄糖20gl^-1，琼脂粉20gl^-1，ph自然；

(2)产孢子：将步骤(1)所述斜面培养基上生长的菌种转接至pda平板30℃培养7d，待菌丝长满整个平板，pda培养基组成同步骤(1)，ph自然；

(3)种子培养：用1ml移液枪分10次吸取10ml无菌水从步骤(2)所述平板上将孢子冲洗下来，在装有玻璃珠的250ml三角瓶中摇匀(三角瓶装玻璃珠后纱布牛皮纸包好灭菌后使用)，取1ml接种至种子培养基(即pdb培养基)30℃，200rmin^-1条件下培养2天；pdb培养基组成：土豆200gl^-1,葡萄糖20gl^-1，ph自然；

(4)发酵产漆酶：将步骤(3)所得种子液按体积比10％的接种量(5ml)接种至改良的基础产酶培养基(250ml三角瓶装液量50ml)，30℃，200rmin^-1条件下培养7d，胞外漆酶酶活达到最大值(约为10000ul^-1)，改良的基础产酶培养基组成：葡萄糖15gl^-1，豆粕5gl^-1，柠檬酸氢二铵0.5gl^-1，cuso4·5h2o0.125gl^-1，kcl0.5gl^-1，kh2po41gl^-1，mgso4·7h2o0.5gl^-1，酵母膏1gl^-1，mnso4·h2o0.01gl^-1，初始ph为4.0；

(5)粗酶液的制备：将步骤(4)所得发酵液先用定性滤纸抽滤除去大部分菌体，然后8000g离心20min得到上清液即为粗酶液；

(6)硫酸铵沉淀：将步骤(5)所得粗酶液缓慢加入体积分数为40％硫酸铵，搅拌溶解，4℃冰箱过夜，第二天8000g离心20min，去除沉淀，收集上清液得到除去部分杂蛋白的粗酶液，然后继续缓慢加入硫酸铵达到体积分数为70％，搅拌溶解，4℃冰箱过夜，第二天8000g离心20min，倒掉上清液，用少量体积的柠檬酸盐缓冲液(ph6.0,20mmoll^-1)溶解沉淀得到浓缩粗酶液，透析袋过夜脱盐或脱盐柱脱盐，用于漆酶的进一步纯化；

(7)离子交换层析：采用hitrapqhp(1.6cm×30cm,5ml,gehealthcare,littlechalfont,uk)阴离子交换色谱柱对步骤(6)所得浓缩粗酶液进行漆酶的分离纯化，上样之前先用柠檬酸盐缓冲液(ph6.0,20mmoll^-1)平衡好柱子，每次的上样量为15ml样品，然后用0–1moll^-1nacl柠檬酸盐缓冲液(ph6.0,20mmoll^-1)线性梯度洗脱，流速为5mlmin^-1，收集洗脱液，每管1.5ml，透析袋过夜脱盐或脱盐柱脱盐；

(8)保存：将步骤(7)所得纯酶(sds-page分析显示为一条带)加入部分甘油，每0.5ml一管分装好，-80℃冰箱保存备用；

本发明所提供的密孔菌pycnoporussp.sybc-l10已于2015年保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc#no：m2015020，地址：中国，武汉，武汉大学。

申请人发现密孔菌pycnoporussp.sybc-l10产的漆酶(lac-q)，具有相对较好的冷适应性、热稳定性、金属离子稳定性及有机溶剂稳定性等优点，在酸性范围内(ph3.0-6.0)，无论是在0℃的极端低温条件下还是在70℃的高温条件下漆酶(lac-q)均能高效的降解四环类和磺胺类抗生素，降解速率快(降解50mgl^-1抗生素通常只需要5-10min)，降解后抑菌效果显著降低。

有益效果：本发明提供了一个可以高效降解环境中四环类和磺胺类抗生素的漆酶及方法，比已报道的类似漆酶效果明显快，与传统的物理化学法相比，绿色安全，环境友好，符合可持续发展需求，在未来治理环境中的抗生素应用中具有广阔的应用前景。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是不同条件下的抗生素降解曲线；其中(a)四环素(b)四环素(c)新诺明(d)四环素和新诺明。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

本发明实施例所涉及实验材料如下：

菌株

密孔菌pycnoporussp.sybc-l10已于2015年保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc#no：m2015020，地址：中国，武汉，武汉大学。

培养基

pda培养基组成：土豆200gl^-1,葡萄糖20gl^-1，琼脂粉20gl^-1，ph自然；

pdb培养基组成：土豆200gl^-1,葡萄糖20gl^-1，ph自然；

改良的基础产酶培养基组成：葡萄糖15gl^-1，豆粕5gl^-1，柠檬酸氢二铵0.5gl^-1，cuso4·5h2o0.125gl^-1，kcl0.5gl^-1，kh2po41gl^-1，mgso4·7h2o0.5gl^-1，酵母膏1gl^-1，mnso4·h2o0.01gl^-1，初始ph为4.0；

主要试剂

四环素(tc,95％,cas:60-54-8)和新诺明(smx,98％,cas723-46-6)购于上海源叶生物科技有限公司。氧化还原介体2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)diammoniumsalt(abts,98％,cas:30931-67-0)和丁香醛(sa,98％,cas:134-96-3)购于西格玛化学品公司。纯酶(lac-q)用0.1moll^-1ph6.0的磷酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释成50uml^-14℃冰箱保存备用，四环素和新诺明均用0.1moll^-1ph6.0的磷酸-磷酸氢二钠缓冲液(含20％乙醇)溶解配置成500mgl^-1的母液4℃冰箱保存备用，abts用0.1moll^-1ph6.0的磷酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解配置成5.0mmoll^-1的母液4℃冰箱保存备用，丁香醛用0.1moll^-1ph6.0的磷酸-磷酸氢二钠缓冲液(含20％乙醇)溶解配置成5.0mmoll^-1的母液4℃冰箱保存备用。其他原料和试剂均为国产分析纯商品。

主要仪器

立式蒸汽压力灭菌锅(yxq-ls-50上海博迅)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；金属浴(mc-0203-台湾majorscience迷你型制冷金属浴，-10℃–100℃)；蛋白纯化仪(aktaavant蛋白质纯化系统，美国ge公司)

实例1漆酶介体体系在四环类抗生素降解中的应用

1.1反应体系

1.5ml含终浓度50mgl^-1tc,5.0uml^-1lac-q,0.5mmoll^-1abts

1.2反应条件

25℃，ph6.0,静置孵育。

1.3操作步骤

(1)用移液枪吸取1.05ml0.1moll^-1ph6.0的磷酸-磷酸氢二钠缓冲液加入1.5离心管中,吸取0.15ml四环素母液加入离心管中，再吸取0.15mlabts母液加入离心管中，25℃，静置孵育10分钟。

(2)用移液枪吸取0.15ml纯酶溶液，加入离心管中，开始反应，计时开始，反应0.5-5分钟。分别在0.5,1,2,3,4,5分钟时取样0.25ml，立即加入0.5ml甲醇终止反应。每个反应做3个平行。

(3)跑液相检测反应体系中四环素的残余浓度。

(4)做抑菌实验分析。对照组加入未处理的四环素溶液(0.25ml50mgl^-1四环素溶液，加入0.5ml甲醇)，实验组加入酶降解5分钟后终止反应的样品。测试菌株为革兰氏阴性菌大肠杆菌escherichiacolibl21和革兰氏阳性菌芽孢杆菌bacillusaltitudinissybchb4。luria-bertani(lb)培养基37℃，200rmin^-1培养。24小时后测od600值，计算菌株的生长抑制率。探究降解前后四环素的抑菌活性变化。

1.4降解效果

经过酶处理后，4分钟四环素降解率达到100％(见附图1中(a)所示)。抑菌实验发现实验组菌株生长状况跟对照组基本上一致，说明降解后四环素的抑菌效果基本上完全消失，此方法操作简单，降解速率高效，具有潜在的应用价值。

实例2漆酶介体体系在四环类抗生素降解中的应用

2.1反应体系

1.5ml含终浓度50mgl^-1tc,10.0uml^-1lac-q,1.0mmoll^-1abts

2.2反应条件

0℃，ph6.0,静置孵育。

2.3操作步骤

(1)用移液枪吸取0.75ml0.1moll^-1ph6.0的磷酸-磷酸氢二钠缓冲液加入1.5离心管中,吸取0.15ml四环素母液加入离心管中，再吸取0.3mlabts母液加入离心管中，0℃，静置孵育10分钟。

(2)用移液枪吸取0.3ml纯酶溶液，加入离心管中，开始反应，计时开始，反应0.5-5分钟。分别在0.5,1,2,3,4,5分钟时取样0.25ml，立即加入0.5ml甲醇终止反应。每个反应做3个平行。

(3)跑液相检测反应体系中四环素的残余浓度。

(4)做抑菌实验分析。对照组加入未处理的四环素溶液(0.25ml50mgl^-1四环素溶液，加入0.5ml甲醇)，实验组加入酶降解5分钟后终止反应的样品。测试菌株为革兰氏阴性菌大肠杆菌escherichiacolibl21和革兰氏阳性菌芽孢杆菌bacillusaltitudinissybchb4。luria-bertani(lb)培养基37℃，200rmin^-1培养。24小时后测od600值，计算菌株的生长抑制率。探究降解前后四环素的抑菌活性变化。

2.4降解效果

经过酶处理后，5分钟四环素降解率达到100％(见附图1中(b))。抑菌实验发现实验组菌株生长状况跟对照组基本上一致，说明降解后四环素的抑菌效果基本上完全消失，此方法操作简单，降解速率高效，具有潜在的应用价值。

实例3漆酶介体体系在磺胺类抗生素降解中的应用

3.1反应体系

1.5ml含终浓度50mgl^-1smx,10.0uml^-1lac-q,0.5mmoll^-1sa

3.2反应条件

25℃，ph6.0,静置孵育。

3.3操作步骤

(1)用移液枪吸取0.90ml0.1moll^-1ph6.0的磷酸-磷酸氢二钠缓冲液加入1.5离心管中,吸取0.15ml新诺明母液加入离心管中，再吸取0.15mlsa母液加入离心管中，25℃，静置孵育10分钟。

(2)用移液枪吸取0.3ml纯酶溶液，加入离心管中，开始反应，计时开始，反应0.5-5分钟。分别在0.5,1,2,3,4,5分钟时取样0.25ml，立即加入0.5ml甲醇终止反应。每个反应做3个平行。

(3)跑液相检测反应体系中新诺明的残余浓度。

(4)做抑菌实验分析。对照组加入未处理的新诺明溶液(0.25ml50mgl^-1新诺明溶液，加入0.5ml甲醇)，实验组加入酶降解5分钟后终止反应的样品。测试菌株为革兰氏阴性菌大肠杆菌escherichiacolibl21和革兰氏阳性菌芽孢杆菌bacillusaltitudinissybchb4。luria-bertani(lb)培养基37℃，200rmin^-1培养。24小时后测od600值，计算菌株的生长抑制率。探究降解前后新诺明的抑菌活性变化。

3.4降解效果

经过酶处理后，4分钟新诺明降解率达到100％(见附图1中(c))。抑菌实验发现实验组菌株生长状况跟对照组相差不大，说明降解后新诺明的抑菌效果显著降低，此方法操作简单，降解速率高效，具有潜在的应用价值。

实例4漆酶介体体系在同时降解四环类和磺胺类抗生素降解中的应用

4.1反应体系

1.5ml含终浓度20mgl^-1tc,20mgl^-1smx,6.0uml^-1lac-q,0.1mmoll^-1abts,0.2mmoll^-1sa

4.2反应条件

25℃，ph6.0,静置孵育。

4.3操作步骤

(1)用移液枪吸取1.11ml0.1moll^-1ph6.0的磷酸-磷酸氢二钠缓冲液加入1.5离心管中,分别吸取0.06ml四环素和0.06ml新诺明母液加入离心管中，再分别吸取0.03mlabts和0.06mlsa母液加入离心管中，25℃，静置孵育10分钟。

(2)用移液枪吸取0.18ml纯酶溶液，加入离心管中，开始反应，计时开始，反应1-6分钟。分别在1,2,3,4,5,6分钟时取样0.25ml，立即加入0.5ml甲醇终止反应。每个反应做3个平行。

(3)跑液相检测反应体系中四环素和新诺明的残余浓度。

(4)做抑菌实验分析。对照组加入未处理的四环素和新诺明溶液(混合液0.25ml含20mgl^-1四环素和20mgl^-1新诺明，加入0.5ml甲醇)，实验组加入酶降解6分钟后终止反应的样品。测试菌株为革兰氏阴性菌大肠杆菌escherichiacolibl21和革兰氏阳性菌芽孢杆菌bacillusaltitudinissybchb4。luria-bertani(lb)培养基37℃，200rmin^-1培养。24小时后测od600值，计算菌株的生长抑制率。探究降解前后四环素和新诺明的抑菌活性变化。

4.4降解效果

经过酶处理后，6分钟四环素和新诺明的降解率均达到100％(见附图1中(d))。抑菌实验发现实验组菌株生长状况跟对照组基本上一致，说明降解后四环素和新诺明的抑菌效果基本上完全消失，此方法操作简单，降解速率高效，具有潜在的应用价值。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。