一种羊肚菌多糖及其制备方法和应用与流程

本发明属于真菌多糖应用技术领域，具体地说，涉及一种羊肚菌多糖及其制备方法和应用。

背景技术：

真菌多糖是由真菌菌丝体和子实体产生的，能够控制细胞分裂分化和调节细胞生长及衰老的一类代谢产物。同时活性多糖还可以刺激免疫细胞增殖，并通过多种其他方式参与免疫调控系统。真菌多糖因其独特的生物活性已被国际公认为生物调节效应剂(biologicalresponsemodifiers，brm)。

近20年来，关于多糖生物活性的研究报道主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等方面，其作用是多途径、多环节、多靶点的。

羊肚菌(morehellaesculenta)隶属于子囊菌亚门盘菌纲盘菌目羊肚菌科羊肚菌属，因其酷似羊肚，从而得名羊肚菌。野生羊肚菌，子实体个头中等或偏小，菌盖椭圆形且表面类似蜂窝状，顶端钝圆，菌柄近白色，味道鲜美，是很好的食用和药用真菌。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种羊肚菌多糖及其制备方法和应用。

本发明的目的是通过以下及技术方案实现的：

一种羊肚菌多糖，所述多糖是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖，所述甘露糖、葡萄糖、半乳糖的残基摩尔比为4：4：1。

优选的，所述甘露糖选自α-d-甘露糖或β-d-甘露糖；葡萄糖选自α-d-葡萄糖或β-d-葡萄糖；半乳糖选自β-d-半乳糖。

更优选的，所述α-d-甘露糖为α-d-吡喃甘露糖，β-d-甘露糖为β-d-吡喃甘露糖。

在本发明的一个优选实施方式中，所述羊肚菌多糖主链由(2,4→6)-α-d-吡喃甘露糖和(2,4→6)-β-d-吡喃甘露糖组成，(1,2→6)-β-d-半乳糖作为侧链与两个甘露糖6-o相连，4-β-d-葡萄糖作为末端糖与(1,2→6)-β-d-半乳糖2-o相连，其余甘露糖6-o分别与一个(1→6)-α-d-葡萄糖相连。

优选的，所述羊肚菌多糖的重均分子量为8000-20000da(如8000、10000、12000、15000、16000、17000、20000da)；在本发明的一个优选实施方式中，所述羊肚菌多糖的重均分子量为16348da。

在本发明的一个优选实施方式中，所述羊肚菌多糖的结构式如下：

其中，n为10-100的整数(如10、20、50、60、70、80、100)。

本发明还提供一种羊肚菌多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)取羊肚菌子实体粉末，热水浸提，所得水提物依次经浓缩、醇沉、除蛋白得到粗多糖；

(2)将步骤(1)所得粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液；

(3)将步骤(2)所得洗脱液用透析袋进行透析浓缩。

(4)将步骤(3)完成后的透析袋内液体离心，取上清液，冷冻干燥，得到羊肚菌多糖。

优选的，热水浸提步骤中，浸提温度为80-100℃(如80、85、90、95、100℃)，在本发明的一个实施例中，该浸提温度为100℃。

优选的，热水浸提步骤中，水与羊肚菌子实体粉末的液料比为1-10:1(体积质量比，如1:1、2:1、3:1、5:1、6:1、8:1、10:1，ml/g)；在本发明的一个实施例中，该液料比为3:1。

优选的，浸提次数为1次或多次(如2、3、4、5次)；在本发明的一个实施例中，该浸提次数为3次。

优选的，每次浸提时间为4-10小时(如4、6、8、10小时)；在本发明的一个实施例中，每次浸提时间为6小时。

优选的，醇沉步骤中，醇与水提物的浓缩液的体积比为1-10:1(如1:1、3:1、4:1、5:1、10:1)；在本发明的一个实施例中，该体积比为3:1。

在本发明的一个实施例中，醇沉步骤中，醇为乙醇。

在本发明的一个实施例中，除蛋白采用sevage法。

更优选的，步骤(1)包括：取羊肚菌子实体粉末，热水浸提，收集上清液，浓缩，加入无水乙醇，收集沉淀，烘干，除去其中的蛋白质，得到粗多糖。

离子交换柱为纤维素柱，该纤维素柱的填料如deae-52纤维素。

洗脱所用洗脱剂为蒸馏水。

更优选的，步骤(2)包括：将步骤(1)所得粗多糖的水溶液通过纤维素柱，洗脱，收集洗脱液，浓缩，离心，收集上清液。

优选的，步骤(3)包括：将步骤(2)所得洗脱液置于透析袋，半天换一次水，透析两天。

透析袋的截留分子量为5000-10000da(如5000、7000、8000、10000da)；在本发明的一个实施例中，该截留分子量为7000da。

本发明提供一种羊肚菌多糖在制备增强免疫的药物、保健品或食品中的应用。

本发明提供一种羊肚菌多糖在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物、保健品或食品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明一定剂量的羊肚菌多糖me-x具有显著的免疫调节活性：当me-x多糖浓度为10μg/ml时，t、b淋巴细胞增殖活性最好；当me-x多糖浓度为20μg/ml时，促进raw264.7细胞的增殖能力及噬细胞吞噬活性均最好。

本发明一定剂量的羊肚菌多糖me-x具有显著的抗肿瘤活性：当me-x多糖浓度为10μg/ml时，抑制mfc细胞增殖效果最好；当me-x多糖浓度为20μg/ml时，抑制ct26.wt和s180细胞增殖效果最好。

附图说明

图1羊肚菌多糖me-xhpgpc谱图；

图2羊肚菌多糖me-x的红外谱图；

图3羊肚菌多糖me-x的¹hnmr图谱；

图4羊肚菌多糖me-x的¹³cnmr图谱；

图5羊肚菌多糖me-x的化学结构；

图6羊肚菌多糖me-x抑制ct-26细胞增殖结果统计图；

图7羊肚菌多糖me-x抑制mfc细胞增殖结果统计图；

图8羊肚菌多糖me-x抑制s180细胞增殖结果统计图。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1羊肚菌多糖me-x的分离提取

采用热水提取法提取羊肚菌粗多糖，并结合deae-纤维素柱层析法和透析法对羊肚菌粗多糖进一步分离纯化，具体步骤如下：

s1：通过热水提取法提取羊肚菌粗多糖

将烘干的羊肚菌子实体打粉，按照液料比为3:1的比例在100℃水中煮沸6小时，重复3次，收集上清液并浓缩，加入三倍体积的无水乙醇形成絮状沉淀，收集沉淀并干燥，用sevage法除去其中的蛋白质，得到羊肚菌粗多糖；

s2：利用deae-52纤维素柱层析法分离纯化羊肚菌粗多糖

用蒸馏水将deae-52纤维素50.00g搅拌均匀后，加入0.5mol/lnaoh溶液浸泡2小时，反复用蒸馏水洗至中性，再加入0.5mol/lhc1溶液浸泡2小时以上，反复用蒸馏水洗至中性，将中性的纤维素装入玻璃柱，利用蒸馏水作为流动相将纤维素压实，取适量的上步制备的粗多糖溶解于蒸馏水，并加入至纤维素柱中，以蒸馏水作为流动相，收集洗脱液并利用硫酸-苯酚法定性检测。浓缩洗脱液并离心，上清液转移至透析袋(7000da)，半天换一次水，透析两天。将透析袋中的液体离心，将上清液冷冻干燥得到羊肚菌多糖，并命名为me-x。

实施例2羊肚菌多糖me-x的结构鉴定

运用水解、甲基化分析、气相色谱和质谱联用技术、红外谱技术、核磁共振技术、高效液相色谱，对羊肚菌多糖me-x进行结构解析。

1，分子量的测定

将5mg实施例1制备的羊肚菌多糖me-x样品用1mlddh2o溶解，超声5min，进行hpgpc分析，结果如图1所示，本发明制备的羊肚菌纯多糖重均分子量为16348da。

2，羊肚菌多糖me-x的红外谱分析

将实施例1制备的羊肚菌多糖me-x样品2mg与kbr混合压片，红外分光光度计扫描4000cm-¹-400cm-¹范围，结果如图2所示，通过傅里叶变换红外光谱进行羊肚菌多糖me-x的红外分析发现，在1250cm-¹-950cm-¹是me-x的指纹峰区域，共具有2处明显的信号峰，4000cm-¹-1300cm-¹是me-x的特征吸收峰区域，共具有4处明显的信号峰，该结果进一步证明此物质为多糖结构，特征峰明显，无其他结构特征峰，应为多糖纯品。

3，羊肚菌多糖me-x的核磁共振分析

取实施例1制备的羊肚菌多糖me-x样品10mg溶于0.5ml重水(d2o)中，装入核磁管中，使用核磁共振仪检测。me-x的¹hnmr谱结果如图3所示，其中异头质子共振峰δ4.5-5.5ppm范围内主要有9个异头氢的共振峰，在δ3.00-4.50ppm处存在的高度重叠的共振峰，归属为me-x糖环的h2-h6的信号。me-x的¹³cnmr谱结果如图4所示，从图中可以看出共振区域δ90-110ppm主要有9个异头碳的共振峰，所有碳的化学位移归属总结并列于表1中。

表1羊肚菌多糖mex的¹³cnmr图中的化学位移

4，羊肚菌多糖me-x的结构预测

根据上述数据，我们预测本发明制备的羊肚菌多糖me-x结构如图5所示，根据scifinder查新结构结果显示，me-x是一种结构新颖的糖类化合物。

实施例3羊肚菌多糖me-x的生物活性研究

在体外运用两种cck-8法检测羊肚菌多糖me-x的免疫调节活性和抗肿瘤活性。

实验试剂

cck-8试剂盒，rpim1640，fbs，dmso，双抗等。

实验仪器

酶标仪；恒温培养箱。

实验方法

(1)me-x对肿瘤细胞(结肠癌细胞、胃癌细胞、小鼠肿瘤细胞)增殖的抑制影响

用cck-8(cellcountingkit)法检测me-x对肿瘤细胞的增殖的抑制效果。将96孔培养板边缘的孔依次加入pbs缓冲液，剩余的孔每孔加入100μl细胞稀释液。在co2的培养箱中培养并观察，待细胞完全贴壁且状态稳定后2小时，依次加入不同浓度的me-x溶液100μl，空白对照组则加入等体积的细胞培养液。继续培养24h后，向每孔中分别加入5μlcck-8试剂，在培养箱中孵育3h，把酶标仪波长调至450nm，检测其od值。

实验结果

(1)me-x对结肠癌细胞(ct26.wt)增殖的抑制影响

me-x对ct26.wt细胞增殖的抑制效果如图6所示，值得注意的是当药物浓度在20μg/ml时，对ct26.wt细胞的抑制率最大为35.48％，表明该浓度的me-x对ct26.wt细胞增殖的抑制效果最好。

(2)me-x对胃癌细胞(mfc)增殖抑制的影响

结果如图7所示，药物组都能极显著地抑制mfc细胞增殖，当药物浓度为10μg/ml，抑制率最高为41.57％，表明该浓度的me-x对mfc细胞增殖的抑制效果最好。

(3)me-x对小鼠肿瘤细胞(s180)增殖抑制的影响

me-x在一定浓度范围内能抑制s180细胞增殖，如图8所示，当me-x浓度为20μg/ml时，抑制率可达30.53％。通过该结果我们推测me-x能刺激s180细胞释放某种物质，从而抑制癌细胞s180的正常分裂，进而抑制其增殖。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。