一种降解石油烃的表面活性菌株及其应用的制作方法

[0001]
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种降解石油烃的表面活性菌株及其应用。


背景技术：

[0002]
随着经济的发展、社会的进步，工业生产对石油等化石燃料的需求日益增加，然而在油田的开采、炼制、运输、使用和储存的过程中会产生大量的含油污泥。含油污泥是一种含有大量的沥青质、重金属、病原菌、微量的放射性元素以及水、其他有机无机化合物牢固粘结在一起的乳化体系，会危害人体健康，影响动植物生长，污染土壤，破坏生态系统，同时也导致资源的浪费。近几年，我国含油污泥与炼化“三泥”的年产量已超过100万吨，且以每年3％以上的速度增长。2016版《国家危险废物名录》将石油石化工业产生的含油污泥划分为危险废物(hw08)，由含油污泥而引起的环境问题越发的显著。
[0003]
目前国内外降解含油污泥的常用方法有溶剂萃取法、焚烧法、热解法、生物处理法等。然而溶剂萃取法的萃取剂需求量巨大，价格不菲，易于挥发，成本较高，限制了它在含油污泥处理中的应用。焚烧法能源利用率低，易造成二次污染，且石油资源没有回收再利用。利用热解法处理含油污泥能够实现油气回收和残渣回收利用，但热解法能量需求较大、运行成本较高。生物处理法主要通过微生物降解含油污泥。自然界中一些微生物能够分泌出特殊的表面活性剂，增强生物破乳特性，进而降解含油污泥。利用微生物降解含油污泥成本低、安全性强、无二次污染且利于生态修复。
[0004]
目前对含油污泥降解菌的研究已有诸多报道。张恒等(陕北地区高效石油降解菌的筛选及其对油污土壤的修复研究，《延安大学学报》(自然科学版)2018年第3期)报道了从延安市延长县某油井的土壤样品中筛选出3株高效石油降解菌，分别为w1(假单胞菌属)、w3(芽孢杆菌属)、n4(红球菌属)，3种菌株在最适生长条件下对石油烃的降解率最高可达52.20％。李乐等(石油降解菌的筛选及复合菌群的构建，《当代化工》2018年第4期)从陇东油泥处理站的含油污泥中筛选分离得到5株高效石油降解菌，5株菌在最适生长条件下对石油烃的降解率为77.80％。由此可见，从含油污泥中可以筛选出具有一定降解石油烃能力的菌株。
[0005]
本发明利用从含油污泥中筛选出的表面活性菌株，分泌特殊的表面活性剂，增强生物破乳特性，从而实现高效降解石油烃，本发明的降解石油烃的表面活性菌株，为生物法处理含油污泥提供了理论参考。


技术实现要素：

[0006]
本发明以石油石化工业产生的含油污泥为原料，从中筛选分离出能够高效降解石油烃的表面活性菌株，并提供利用所述菌株进行降解石油烃的方法。
[0007]
本发明的一个目的是提供一种降解石油烃的表面活性菌株。
[0008]
技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009]
本发明所提供的菌株为为芽孢杆菌属bacillus sp.，命名为bbb，其保藏编号为cgmcc no.17504。
[0010]
本发明的菌株bbb，菌落形状为圆形，直径大约1-2mm，颜色为乳黄色，表面光滑，微微凸起，边缘光滑，生长快速。经过对该菌株的16s rdna的鉴定与序列分析，表明该菌株为芽孢杆菌(bacillus sp.)，该菌株的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0011]
该菌株bbb已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(简称cgmcc，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号：cgmcc no.17504，分类命名为芽孢杆菌(bacillus sp.)。
[0012]
上述菌株是从含油污泥中筛选分离得到的。本发明含油污泥提取自石油炼化车间的隔油池泥。
[0013]
本发明还提供了该菌株的分离方法，包括以下步骤：
[0014]
(1)称取风干后的含油污泥加入蒸馏水中，30℃、134r/min恒温振荡6h；静置后，吸取上层清液，按照倍比稀释法，依次制备10-2
、10-3
…
...10-8
稀释液；吸取稀释液进行涂布，30℃恒温培养3d后，挑取特征菌落进行平板划线分离纯化，将纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒温培养3d，4℃保存，每月继代一次；
[0015]
(2)将分离纯化出来的菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、150r/min恒温振荡培养，制成菌液；3d后，取培养后的菌液接种于添加石油烃做底物的液体牛肉膏蛋白胨培养基中，以下称作bbb液体培养基，接种量为3％，30℃、150r/min恒温振荡培养，设置3组重复；同时做空白对照实验，空白对照中加3％的无菌水；3d后测定以上bbb液体培养基中石油烃的含量，并分析其生物破乳特性；
[0016]
(3)经过反复的平板划线及石油烃去除效率、破乳能力的检验，最终得到所述的降解石油烃的表面活性菌株。
[0017]
具体来说，该菌株的分离方法，包括以下步骤：
[0018]
(1)称取10g风干后的含油污泥加入27ml蒸馏水中，30℃、134r/min恒温振荡6h；静置后，用移液枪(枪头灭菌)吸取1ml上层清液，按照倍比稀释法，依次制备10-2
、10-3
…
...10-8
稀释液；后用移液枪吸取0.1ml稀释液进行涂布，30℃恒温培养3d，挑取特征菌落进行平板划线分离纯化；将纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒温培养3d，4℃保存，每月继代一次；
[0019]
(2)将分离纯化出来的菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、150r/min恒温振荡培养，制成菌液；3d后，取培养后的菌液接种于20ml添加石油烃做底物的液体牛肉膏蛋白胨培养基中，即bbb液体培养基，接种量为3％，30℃、150r/min恒温振荡培养，设置3组重复；同时做空白对照实验，空白对照中加3％的无菌水；3d后测菌液中石油烃的含量，并分析其生物破乳特性；
[0020]
(3)经过反复的平板划线及石油烃去除效率、破乳能力的检验，最终得到所述的降解石油烃的表面活性菌株。
[0021]
所述bbb培养基中添加的底物石油烃提取自含油污泥。
[0022]
所述底物石油烃的提取方法，包括以下步骤：
[0023]
(1)搅拌：对提取比例为10g风干后的含油污泥、50ml四氯化碳混合溶液进行搅拌2h(2000r min-1
)，使其充分溶解；
[0024]
(2)破乳：在混合液中添加6g nacl，增强破乳特性；
[0025]
(3)离心：8000r/min离心15min；
[0026]
(4)过滤：通过0.45μm滤膜过滤；
[0027]
(5)滤液调ph至强酸性：收集滤液，用稀盐酸调节ph值至2左右以下；
[0028]
(6)旋转蒸发：滤液60℃旋转蒸发去除四氯化碳；
[0029]
(7)固相萃取：稀释后的粗提液流经固相萃取柱进行富集浓缩，并用四氯化碳梯
[0030]
度洗脱；
[0031]
(8)氮气吹干：利用氮气吹干仪吹干洗脱液中的残留液体；
[0032]
(9)灭菌保存：用四氯化碳相或水相重新溶解，121℃高温消毒灭菌20min(1
×
10
5
pa)，-20℃保存作为石油烃储备液。
[0033]
所述液体牛肉膏蛋白胨培养基的组分为：牛肉膏2g；蛋白胨4g；氯化钠3g，加蒸馏水到1000ml，调节溶液ph值至5-6。
[0034]
所述bbb液体培养基的组分为：底物石油烃；在液体牛肉膏蛋白胨培养基培养3天的bbb菌液；牛肉膏2g；蛋白胨4g；氯化钠3g，加蒸馏水到1000ml，调节溶液ph值至5-6。
[0035]
本发明的另一个目的是提供上述降解石油烃的表面活性菌株在降解含油污泥中的应用。
[0036]
所述菌株对含油污泥中石油烃的降解条件为30-35℃、ph为5-6。
[0037]
所述菌株对含油污泥中石油烃的降解方法包括以下步骤：
[0038]
(1)菌株的活化：将菌株bbb从斜板上接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、150r/min恒温振荡培养3d，制成菌液；
[0039]
(2)菌株降解过程：取上述菌液接种到添加含油污泥做底物的液体牛肉膏蛋白胨培养基中，即bbb液体培养基，ph为5-6，接种量3％，30℃、150r/min恒温振荡培养3d，即能够高效的降解含油污泥中石油烃。
[0040]
本发明所用的液体牛肉膏蛋白胨培养基组为：牛肉膏2g；蛋白胨4g；氯化钠3g，加水到1000ml，充分溶解，用1mol l-1
的naoh和hcl调节溶液ph值至5-6，121℃灭菌20min。
[0041]
本发明所用的bbb液体培养基组为：底物含油污泥；在液体牛肉膏蛋白胨培养基培养3天的bbb菌液；牛肉膏2g；蛋白胨4g；氯化钠3g，加水到1000ml，充分溶解，用1mol l-1
的naoh和hcl调节溶液ph值至5-6，121℃灭菌20min。
[0042]
有益效果：
[0043]
(1)本发明从含油污泥中分离筛选出一株高效降解石油烃的菌株bbb，属于芽孢杆菌(bacillus sp.)，接种3％此菌株到ph为5-6，添加含油污泥做底物(初始浓度为3.6g/l)的液体牛肉膏蛋白胨培养基中培养，12d后含油污泥中石油烃的去除率达到83.75％，降解效果显著。本发明提供了一种新的降解石油烃的菌种，为生物法处理含油污泥提供了理论参考。
[0044]
(2)本发明用作底物的含油污泥提取自石油炼化车间的隔油池泥，提取成本较低，方法简单可行。
[0045]
(3)本发明考察了不同ph条件及不同添加量的bbb菌剂，对表面活性菌株bbb降解含油污泥的影响，为利用菌株处理含油污泥提供应用参考。
附图说明
[0046]
图1为菌株bbb的平板划线图；
[0047]
图2为菌株bbb的菌落形态图；
[0048]
图3为菌株bbb的扫描电镜图；
[0049]
图4为实施例3中石油烃含量变化图。
具体实施方式
[0050]
下面通过具体实施例和附图对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
[0051]
本发明所用的液体牛肉膏蛋白胨培养基组为：牛肉膏2g；蛋白胨4g；氯化钠3g，加水到1000ml，充分溶解，用1mol l-1
的naoh和hcl调节溶液ph值至5-6，121℃灭菌20min。
[0052]
本发明所用的bbb液体培养基组为：底物含油污泥；在液体牛肉膏蛋白胨培养基培养3天的bbb菌液；牛肉膏2g；蛋白胨4g；氯化钠3g，加水到1000ml，充分溶解，用1mol l-1
的naoh和hcl调节溶液ph值至5-6，121℃灭菌20min。
[0053]
含油污泥做底物的bbb液体培养基中油污泥的含量是3.6g/l。
[0054]
实施例1：菌株bbb的筛选与分离
[0055]
1、从含油污泥中提取石油烃：
[0056]
本发明中含油污泥提取自石油炼化车间的隔油池泥。
[0057]
从含油污泥中提取石油烃，提取比例：10g风干后的含油污泥，50ml四氯化碳溶液。
[0058]
具体步骤：
[0059]
(1)搅拌：对混合溶液进行磁力搅拌2h(2000r min-1
)，使其充分溶解；
[0060]
(2)破乳：在混合液中加6g nacl，增强破乳特性；
[0061]
(3)离心：使用离心机离心15min(8000r min-1
)；
[0062]
(4)过滤：通过0.45μm滤膜过滤；
[0063]
(5)调ph至强酸性：收集滤液，用稀盐酸调节ph值至2左右以下；
[0064]
(6)旋转蒸发：滤液60℃旋转蒸发去除四氯化碳；
[0065]
(7)固相萃取：稀释后的粗提液流经固相萃取柱进行富集浓缩，并用四氯化碳梯度洗脱；
[0066]
(8)氮气吹干：利用氮气吹干仪吹干洗脱液中的残留液体；
[0067]
(9)灭菌保存：用四氯化碳相或水相重新溶解，121℃高温消毒灭菌20min(1
×
10
5
pa)，-20℃保存作为石油烃储备液。
[0068]
2、菌株bbb的分离与筛选：
[0069]
(1)称取10g风干后的含油污泥加入27ml蒸馏水中，30℃恒温振荡6h(134r min-1
)；静置2h后用移液枪(枪头灭菌)吸取1ml上层清液，按照倍比稀释法，依次制备10-2
、10-3
…
...10-8
稀释液；后用移液枪吸取0.1ml稀释液进行涂布，稀释涂布的培养基采用液体牛肉膏蛋白胨培养基，30℃恒温培养3d，挑取优势菌落进行划线纯化。将纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒温培养3d，4℃保存，每月继代一次。
[0070]
(2)将分离出来的菌株分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃恒温振荡培养(150r min-1
)，制成菌液；3d后，取菌液接种于20ml添加10ml石油烃储备液做底物的液体
牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，接种量为3％，30℃恒温振荡培养(150r min-1
)，设置3组重复。同时做空白对照实验，空白对照中加3％的无菌水。3d后测菌液中石油烃的含量，并分析其生物破乳特性。
[0071]
(3)经过反复的平板划线及石油烃去除效率、破乳能力的检验，最终得到1株具有高效石油烃降解能力的表面活性菌bbb，平板划线图如图1所示。
[0072]
实施例2：菌株bbb的形态观察、生理生化实验及dna鉴定：
[0073]
(1)将挑选出来的优势菌株分离纯化，并进行革兰氏染色、显微镜观察及电镜观察。经形态观察，菌株培养2d后，菌株bbb，菌落形状为圆形，直径大约1-2mm，颜色为乳黄色，表面光滑，微微凸起，边缘光滑，生长快速，菌落形态图如图2。电镜观察显示，菌株呈杆状，扫描电镜图谱如图3；革兰氏染色结果表明其为阳性菌。
[0074]
(2)根据《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)中的鉴定项目和鉴定方法进行实验。生理生化特征如表1：
[0075]
表1菌落bbb的生理生化特征
[0076][0077]
注:“+”表示阳性，“—”表示阴性。
[0078]
(3)发明人对菌株bbb进行了16s rdna测序，其核苷酸序列如seq id no：1所示，所测得的16s rdna序列进行blast比对，表明该菌株为芽孢杆菌属(bacillus sp)。现保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(cgmcc)，保藏时间为：2019年04月01日，保藏编号：cgmcc no.17504，建议的分类命名：芽孢杆菌bacillus sp。
[0079]
实施例3：菌株bbb对含油污泥的降解应用
[0080]
将菌株bbb从斜板上接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、150r/min恒温振荡培养3d，制成菌液。
[0081]
将菌液接种于装有20ml添加10g含油污泥作底物的液体牛肉膏蛋白胨培养基(即bbb液体培养基)的锥形瓶中，ph为5-6，接种量为3％，30℃，150r min-1
恒温振荡培养，每隔2d取样，采用红外测油仪测定石油烃含量，考察菌株12d的降解效果。降解结果显示：12d内菌株能把初始浓度为3.6g l-1
的石油烃降解到0.59g l-1
，降解率为83.75％，降解效果显著，石油烃含量变化见图4。
[0082]
实施例4：菌株bbb在不同ph值下对含油污泥中石油烃的降解效果
[0083]
将菌株bbb从斜板上接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、150r/min恒温振荡培养3d，制成菌液。
[0084]
将菌液接种于装有20ml添加10g含油污泥作底物的液体牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，接种量为3％，ph为3、4、5、6、7、8，30℃，150r min-1
恒温振荡培养，6d后测定石油烃
含量。降解结果显示：ph为3、4、5、6、7、8时，6d能把初始浓度为3.6g l-1
的石油烃降解到2.78g l-1
、2.65g l-1
、2.16g l-1
、2.58g l-1
、2.65g l-1
、2.42g l-1
，降解率分别为22.80％、26.36％、40.04％、33.88％、26.52％、32.67％，ph为5-6时降解效果最好。
[0085]
实施例5：菌株bbb在不同添加量的bbb菌剂下对含油污泥中石油烃的降解效果
[0086]
将菌株bbb从斜板上接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、150r/min恒温振荡培养3d，制成菌液。
[0087]
将菌液接种于装有20ml液体牛肉膏蛋白胨培养基中，次日考察添加1ml、2ml、3ml bbb菌液分别到装有10g含油污泥的锥形瓶中，30℃，150r min-1
恒温振荡培养，12d后用红外测油仪测定石油烃含量。
[0088]
降解结果显示：12d后，混合液中剩余石油烃的含量为3.21g l-1
、2.67g l-1
、1.56g l-1
，降解率分别为10.83％、25.83％、56.67％，可见bbb菌液添加量越大降解效率较高。
[0089]
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。