微流控芯片打印喷嘴和生物3D打印系统的制作方法

本发明涉及生物3D打印成型技术，尤其是一种微流控芯片打印喷嘴和生物3D打印系统。

背景技术：

3D打印是一种利用计算机控制，在平台上逐层沉积材料来构建三维对象的过程。3D打印技术一词最初用来描述原料粉末在粘合剂的作用下，经由喷墨喷出到平台上层层堆积的过程。近年来，高性价比3D打印机的商业化将这种技术的应用范围扩大到建筑、艺术、汽车、生物医学、教育、时尚、玩具等行业。在生物医学领域，3D打印广泛应用于细胞研究、药物研究、癌症研究、医疗设备开发、和组织工程等方面。生物打印结合了3D打印技术、细胞生物学和材料科学，将打印平台与能够沉积生物墨水的设备(生物材料通常充满了活性分子和细胞)相结合。生物3D打印技术能够制作多种生物材料，例如合成或天然的聚合物作为支架，结合含有蛋白质的血清、细胞外基质(ECM))，进而在体外培养各种细胞，包括干细胞和体细胞等。通过选择适当的生物打印材料和体系结构，可以定制特定的结构、物理和生物特性，以模拟天然组织功能，并提供细胞生长、增殖和受控分化所需的微环境。此外，医学成像、CAD和CAM的并行发展使组织工程师能够使用常见的成像方式和重建技术，以患者所需求器官的特定几何形状生成生物打印组织。

微流控技术，通常是指在微米及以下尺度的结构中操控微小体积流体的技术和科学，在微纳级别尺度下流体具有独特的特征、界面效应及热传导性能。微流控制备纤维的杰出性能展示了微尺度分离的巨大潜力,微流控芯片的出现进一步将微纳流控体系推到了一个全新的高度。微流控芯片可以实现各种功能的高度集成,微流控制纤维系统是一个典型的代表,通过适当的芯片设计可以将样品、样品预处理、反应、多组分装载及固化等完整的制备过程集成在一个芯片上,类似这样的集成芯片也被称为“芯片实验室(Lab on a chip)”。经过二十多年的发展,微流控技术已覆盖化学、物理、生物、医学、材料科学、光学和微机电系统等众多领域,成为一个重要的交叉学科。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种适于打印梯度组织工程角膜的微流控芯片喷嘴及适于构建梯度组织工程角膜的生物3D打印系统。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种微流控芯片喷嘴，其特征在于,包括微流控芯片和双层结构的喷嘴，所述微流控芯片包括微流控芯片基底层和微流控芯片上层，所述微流控芯片基底层上形成有多条流道及其入口和连接所述多条流道的混流结构流道及微流控芯片出口，所述混流结构流道连接所述微流控芯片出口，所述微流控芯片上层上形成有对应于所述多条流道的微阀，所述微阀可受控开通或关闭以控制不同流道的液体进入所述混流结构流道，从而控制从所述微流控芯片出口输出的混合溶液的浓度和成分，所述双层结构的喷嘴包括内层微针头和包围在所述内层微针头的外侧的外壳，所述内层微针头与所述微流控芯片出口相连接，混合溶液通过所述内层微针头输入所述外壳内，所述内层微针头对混合溶液进入喷嘴后的流动状态提供保护，所述外壳上设置有交联液体输入口和喷嘴出口，交联液体在通入外壳后，经过沿着所述内层微针头外壁一段长度的流动，从周向包裹从所述内层微针头流出的混合溶液，与混合液体交联产生凝胶纤维，并利用周向的流体聚焦效应控制交联产生的凝胶纤维的流动方向，从所述喷嘴出口流出。

进一步地：

所述外壳为倒锥形结构，所述交联液体输入口设置在所述外壳的侧壁的靠近所述微流控芯片出口的上部。

所述微流控芯片呈竖直式设置，所述多条流道包括沿竖直方向向下延伸的主流道和与所述主流道相连的至少一条侧流道，所述混流结构流道具有沿竖直方向向下延伸的两条蜿蜒曲折结构，且所述两条蜿蜒曲折结构在延伸途中至少存在两次交汇。

所述混流结构流道在首尾两端分别形成一个倒Y形结构流道和一个Y形结构流道，在中间形成至少两个X形结构流道，所述倒Y形结构流道、所述至少两个X形结构流道和所述Y形结构流道依次串联。

所述微流控芯片出口设置成圆孔，所述内层微针头的顶部插入所述圆孔并形成液密封连接。

所述微流控芯片基底层和所属微流控芯片上层均由混有固化剂的软PDMS制备而成，所述软PDMS的主剂和所述固化剂的比例为10：1。

所述微流控芯片基底层和所述微流控芯片上层通过等离子表面处理技术键合在一起。

一种生物3D打印系统，具有所述的微流控芯片喷嘴，用于向所述微流控芯片喷嘴输送打印材料的管道，用于控制向所述微流控芯片喷嘴上的各流道输送的溶液流速的泵，以及用于控制所述微流控芯片喷嘴上的各微阀开闭的电路系统。

进一步地：

所述3D打印系统通过路线规划，在构建梯度组织工程角膜的过程中采用环形路径的打印方式，将从双层结构喷嘴中的凝胶纤维由内向外，一圈一圈地沉积在模具上，直到打印完成第一层；当第一层打印完毕后，喷嘴重新回到模具圆心处，在第一层的基础上按照和前面相同的方式，由内向外将凝胶纤维一圈一圈地沉积在之前一层上，以此类推，一直到整个角膜模型打印完毕，打印的梯度组织工程角膜按照包含的细胞类型分为内中外三大层，其中中间大层使用包含角膜基质细胞的凝胶纤维打印，内外两大层则使用不含细胞的凝胶纤维打印，之后内外两大层分别接种角膜内皮细胞和角膜上皮细胞，打印的组织工程角膜按照是否包含额外的生长因子又在径向方向上分为里中外三大圈，其中在打印中间大圈时，供应液包含高浓度生长因子的流道的微阀打开，从而打印的凝胶纤维含有高浓度的生长因子，最终实现径向上具有不同生长因子浓度梯度，各大层上具有不同细胞成分的梯度组织工程角膜构建。

一种使用所述的生物3D打印系统打印梯度组织工程角膜的方法。

一种由所述的生物3D打印系统打印的梯度组织工程角膜，打印的梯度组织工程角膜按照包含的细胞类型在空间上分为内中外三大层，按照是否包含额外的生长因子在径向方向上分为里中外三大圈，其中中间大圈使用包含高浓度生长因子的凝胶纤维打印，里外两大圈使用不含高浓度生长因子的凝胶纤维打印,中间大层使用包含角膜基质细胞的凝胶纤维打印，内外两大层使用不含细胞的凝胶纤维打印，之后内外两大层分别接种角膜内皮细胞和角膜上皮细胞，形成在径向上具有不同生长因子浓度梯度，不同大层上具有不同细胞成分的梯度组织工程角膜。

本发明结合生物3D打印技术和微流控技术，提供一种用于生物三维打印的微流控芯片喷嘴，该微流控芯片喷嘴的结构设计能够提供特别适于打印分层结构的梯度组织工程角膜的流体剪切应力。使用本发明的微流控芯片喷嘴能够通过微阀的控制精确地打印出分层结构的梯度组织工程角膜，使打印的角膜具有上皮层，基质层和内皮层三层结构，每层可接种不同的细胞。

本发明设计的双层结构的喷嘴包括内层微针头和包围在所述内层微针头的外侧的外壳，所述内层微针头与所述微流控芯片出口相连接，对混合溶液进入喷嘴后的流动状态具有保护作用，所述外壳上设置有交联液体输入口和喷嘴出口，从所述内层微针头输入的混合溶液进入外壳内，交联液体在通入外壳后，经过沿着内层微针头一段长度流动的时间，能够完全从周向包裹从内层微针头流出的混合溶液，从而实现效果非常好的交联现象，并利用周向的流体聚焦现象控制通过交联产生凝胶纤维的流动方向，从喷嘴出口流出。

本发明提供的基于微流控技术的微流控芯片喷嘴还具有以下优点：

1)可用于梯度组织工程角膜3D打印，可以通过路径规划，通过一圈一圈从内向外的方式，将凝胶纤维层层堆叠至圆弧形模具上，制备出梯度组织工程角膜；

2)微流控芯片制造技术使得喷嘴的制造变得简单，喷嘴的重量、体积都得到减小，减少制作成本；

3)可以通过计算机控制的控制微流控芯片上的阀门来控制微流控芯片中各侧流道的流通情况，提高了微流控芯片的响应速度；

4)可以通过控制微阀开关控制各组分流体进入混流流道的时间，而实现控制混流流道制备出的纤维的组分；

5)可以通过控制组分流道的数量来决定在打印过程中使用组分材料数量的上限；

6)可以实现在不更换喷嘴的制备出多组分的凝胶纤维，包括:同一段纤维同时存在多组分材料，较长一段纤维同时存在多段单组分材料纤维；

7)可以通过控制同时流动的组分流道的数量来控制制备出的纤维横截面组分的构成和比例；

8)可以通过同时向混流流道中输入并增大组分流道的流速，来实现纤维横截面面积的增大。

本发明结合了微流控芯片技术和3D打印技术，充分利用了微流控芯片制备纤维时，连续稳定的特点，结合了本发明中的控制阀后，通过在同一硬件中多组分调节来实现同一出口制备多种材料的纤维，可以实时、准确、灵活的制造不同成分的凝胶纤维。充分利用了3D打印技术操作简单、成本低、灵活的特点，将多种组分材料构成的纤维直接打印到构建组织工程角膜的模具上，实现了实时的、准确的搭建多层多成分的梯度组织工程角膜。

根据本发明实施例，利用本发明微流控芯片喷嘴制备组织工程角膜，在打印过程中，可以根据打印过程中对应角膜位置的成分不断切换每一段纤维的材料，可以利用3D打印技术一次性制备而成，整个打印过程无需更换喷嘴，无需中断，可一次性完成多层多成分的梯度组织工程角膜。

本发明基于微流控芯片技术、3D打印技术实现，简单易行、成本低，效果显著，具备极佳的优势和商业背景。

本发明基于微流控芯片技术的喷嘴，具有操作简单、材料选取广泛、较高的制造柔性、精确度高等优秀特性，该喷嘴为实现微流控芯片喷嘴制备梯度组织工程角膜提供了重要的基础和前提。

附图说明

图1是本发明实施例的微流控芯片喷嘴制备梯度组织工程角膜的示意图。

图2是本发明实施例的能够控制打印材料成分的微流控芯片，以及通过交联产生凝胶纤维的双层结构喷嘴的分解示意图。

图3是使用本发明实施例的微流控芯片喷嘴通过微阀控制多成分纤维材料方法中纤维制备，单层生长因子浓度梯度在径向上的改变以及组织工程角膜层层沉积过程的示意图。

图4是本发明实施例的梯度组织工程角膜的多层细胞和生长因子浓度多圈结构示意图。

图5是本发明实施例中的微流控芯片的结构示意图。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

参阅图1至图5，在一种实施例中，一种微流控芯片喷嘴，包括微流控芯片和双层结构的喷嘴2，所述微流控芯片包括微流控芯片基底层10和微流控芯片上层4，所述微流控芯片基底层10上形成有多条流道5、8及其入口6和连接所述多条流道5、8的混流结构流道9及微流控芯片出口，所述混流结构流道9连接所述微流控芯片出口，所述微流控芯片上层4上形成有对应于所述多条流道的微阀7，所述微阀7可受控开通或关闭以控制不同流道的液体进入所述混流结构流道9，从而控制从所述微流控芯片出口输出的混合溶液的浓度和成分，所述双层结构的喷嘴2包括内层微针头3和包围在所述内层微针头3的外侧的外壳11，所述内层微针头3与所述微流控芯片出口相连接，混合溶液通过所述内层微针头3输入外壳11内，所述内层微针头3对混合溶液进入喷嘴后的流动状态具有保护作用，所述外壳11上设置有交联液体输入口和喷嘴出口，交联液体在通入外壳11后，经过沿着内层微针头3一段长度流动的时间，能够完全从周向包裹从内层微针头3流出的混合溶液，与从所述交联液体输入口输入的交联液体在所述外壳11内进一步混合，从而实现效果非常好的交联现象，并利用周向的流体聚焦现象控制交联产生凝胶纤维的流动方向，所述凝胶纤维最终从所述喷嘴出口流出。该微流控芯片喷嘴的结构设计能够提供适于打印分层结构的梯度组织工程角膜的流体剪切应力，使用本发明的微流控芯片喷嘴能够通过微阀的控制精确地打印出分层结构的梯度组织工程角膜。

参阅图1和图2，在优选的实施例中，所述外壳11为倒锥形结构，所述交联液体输入口设置在所述外壳11的侧壁的靠近所述微流控芯片出口的上部。

参阅图1、图2和图5，在优选的实施例中，所述微流控芯片呈竖直式设置，所述多条流道包括沿竖直方向向下延伸的主流道和与所述主流道相连的至少一条侧流道，所述混流结构流道9具有沿竖直方向向下延伸的两条蜿蜒曲折结构，且所述两条蜿蜒曲折结构在延伸途中至少存在两次交汇。

参阅图1、图2和图5，在更优选的实施例中，所述混流结构流道9在首尾两端分别形成一个倒Y形结构流道和一个Y形结构流道，在中间形成至少两个X形结构流道，所述倒Y形结构流道、所述至少两个X形结构流道和所述Y形结构流道依次串联。

根据优选实施例的混流结构能够破坏微流控芯片内流体的层流状态从而让溶液在流出流道前充分混合，混合的效率高，效果好。混流液充分混合后与交联液作用产生高质量的凝胶纤维，有利于提高打印梯度组织工程角膜的质量。

在优选的实施例中，所述微流控芯片出口设置成圆孔，所述内层微针头3的顶部插入所述圆孔并形成液密封连接。

在优选的实施例中，所述微流控芯片基底层10和所属微流控芯片上层4均由混有固化剂的软PDMS制备而成，所述软PDMS的主剂和所述固化剂的比例为10：1。

在优选的实施例中，所述微流控芯片基底层10和所述微流控芯片上层4通过等离子表面处理技术键合在一起。

在另一种实施例中，一种生物3D打印系统，具有所述的微流控芯片喷嘴，用于向所述微流控芯片喷嘴输送打印材料的管道(图未示出)，用于控制向所述微流控芯片喷嘴上的各流道输送的溶液流速的泵(图未示出)，以及用于控制所述微流控芯片喷嘴上的各微阀开闭的电路系统(图未示出)。

参见图1、图3、图4，在优选的实施例中，所述3D打印系统通过路线规划，在构建梯度组织工程角膜的过程中采用环形路径的打印方式，将从双层结构喷嘴中的凝胶纤维由内向外，一圈一圈地沉积在模具上，直到打印完成第一层12。当第一层12打印完毕后，喷嘴重新回到模具圆心处，在第一层12的基础上按照和前面相同的方式，由内向外将从双层结构喷嘴中的凝胶纤维一圈一圈地沉积在之前一层上，以此类推，层叠打印，一直到整个角膜模型打印完毕。打印的梯度组织工程角膜按照包含的细胞类型分为内、中、外三大层15、14、16，其中中间大层14使用包含角膜基质细胞的凝胶纤维打印，内、外两大层15、16则使用不含细胞的凝胶纤维打印，之后分别接种角膜内皮细胞和角膜上皮细胞。同时，打印的组织工程角膜按照是否包含额外的生长因子又在径向方向上分为里、中、外三大圈，其中在打印中间大圈17时，控制供应液包含高浓度生长因子的流道的微阀打开，从而打印的纤维含有高浓度的生长因子。最终实现径向上具有不同生长因子浓度梯度13，各大层14-16上具有不同细胞成分的梯度组织工程角膜构建。

如图3和图4所示，在另一种实施例中，一种3D打印的梯度组织工程角膜，打印的梯度组织工程角膜按照包含的细胞类型在空间上分为内中外三大层，按照是否包含额外的生长因子在径向方向上分为里中外三大圈，其中中间大圈17使用包含高浓度生长因子的凝胶纤维打印，里外两大圈使用不含高浓度生长因子的凝胶纤维打印,中间大层14使用包含角膜基质细胞的凝胶纤维打印，内、外两大层15、16使用不含细胞的凝胶纤维打印，之后内外两大层15、16分别接种角膜内皮细胞和角膜上皮细胞，形成在径向上具有不同生长因子浓度梯度，不同大层上具有不同细胞成分的梯度组织工程角膜。

以下结合附图进一步描述本发明具体实施例。

参阅图1至图5，在一种实施例中，一种用于打印梯度组织工程角膜的微流控芯片喷嘴，包括微流控芯片基底层10和微流控芯片上层4以及双层结构喷嘴2。所述微流控芯片基底层上10形成有一条主流道5和多条侧流道8及其入口6和连接所述多种流道并让不同溶液充分混合的混流结构流道9及出口。所述混流结构9能够破坏微流控芯片内流体的层流状态从而让溶液在流出流道前充分混合。所述微流控芯片上层4上形成有对应于所述多条侧流道的微阀7，所述微阀7通过计算机编程控制流道的流通和闭合进而控制不同浓度成分的液体进入主流道5，从而控制所述混流流道9制备出的对象的溶液浓度和成分并进入双层结构喷嘴的内层微针头3。所述双层结构喷嘴2包括内层微针头3和能够通入交联液体的外壳11，通过向外壳11中持续通入交联液体与内层微针头3的溶液进行交联，从而获得特定浓度成分的凝胶纤维并从喷头出口流出。

优选的实施例中，所述微流控芯片基底层10与微流控芯片上层4的流体出口使用0.5mm的打孔器制作成圆孔，出口处将双层结构喷嘴2的内部微针3插入圆孔并用胶水密封。

优选的实施例中，所述微流控芯片基底层10和所属微流控芯片上层4均由混有硬化剂的软PDMS制备而成。

优选的实施例中，软PDMS的主剂和固化剂的比例为10：1。

优选的实施例中，所述微流控芯片基底层10和所述微流控芯片上层4利用模具制作，通过软光刻方式或纳米压印制作流道。

优选的实施例中，所述微流控芯片基底层10和所属微流控芯片上层4通过等离子表面处理技术键合在一起。

优选的实施例中，所述内层微针头3的外径为0.85mm内径为0.5mm，材料为316不锈钢，所述双层结构喷嘴2结构由一个侧入口流道和圆锥形外壳11组成，所述侧入口流道内通入可以和微流控芯片出口溶液产生交联的液体，并在内层微针头出口处发生交联，产生凝胶纤维。

在另一种实施例中，一种应用于梯度组织工程角膜的3D打印系统，具有所述的微流控芯片和所述的双层结构喷嘴，用于向芯片和喷嘴灌注溶液的流道入口6，用于控制各个流道内溶液流速的数控注射泵，用于控制微阀7开闭的电路系统。

优选的实施例中，所述3D打印系统通过路线规划，在构建梯度组织工程角膜的过程中采用环形路径的打印方式，将从双层结构喷嘴中的凝胶纤维由内向外，一圈一圈地沉积在模具上，直到打印完成第一层12。当第一层12打印完毕后，喷嘴重新回到模具圆心处，在第一层12的基础上按照和前面相同的方式，由内向外将从双层结构喷嘴中的凝胶纤维一圈一圈地沉积在之前一层上，以此类推，层叠打印，一直到整个角膜模型打印完毕。打印的梯度组织工程角膜按照包含的细胞类型分为内、中、外三大层15、14、16，其中中间大层14使用包含角膜基质细胞的凝胶纤维打印，内、外两大层15、16则使用不含细胞的凝胶纤维打印，之后分别接种角膜内皮细胞和角膜上皮细胞。同时，打印的组织工程角膜按照是否包含额外的生长因子又在径向方向上分为里、中、外三大圈，其中在打印中间大圈17时，控制供应液包含高浓度生长因子的流道的微阀打开，从而打印的纤维含有高浓度的生长因子。最终实现径向上具有不同生长因子浓度梯度13，各大层14-16上具有不同细胞成分的梯度组织工程角膜构建。

优选的实施例中，所述的梯度组织工程角膜1，可以用于替代兔子的眼表，进行相关动物实验，并用于药物的筛选和毒性测试。

优选的实施例中，所述的梯度组织工程角膜1，可以用于角膜相关病理疾病发生及发展过程的研究。

以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。