一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法与流程

本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法。

背景技术：

骨关节炎、衰老以及关节损伤等原因导致的软骨缺损是关节痛和慢性残疾的主要原因之一。由于缺乏血管、神经和淋巴，成熟软骨不能自愈。目前最常用于晚期软骨退化的治疗方法是关节置换术，但是该手术本身操作复杂，常引起周围组织感染，并且手术费用也非常昂贵。尽管基于细胞移植的组织工程疗法在二十多年前已被引进，但目前软骨组织工程策略还不能制造出和天然软骨一样的组织，包括层次结构、细胞外基质和机械性能。另外，几乎所有的膝盖软骨修复方法都有一个步骤：将损伤部位周围的健康软骨组织移除，以产生一定形状的人工缺损，便于后期的治疗和移植。该步骤实际上对现存的软骨造成了额外的坏死并最终导致了软骨退化和组织移植失败。

基于组织工程的直接软骨修复方法非常具有吸引力，因为该方法是直接对缺损部位进行修复，而不会导致周围健康组织额外的损伤。理想的移植组织需要和天然软骨很好的整合并对不同大小和厚度的损伤部位进行修复。因此，需要开发新的技术，使工程化组织能够与损伤部位不同的形状和性质相匹配。

喷墨打印是非接触式打印技术，在基底上通过微墨滴的形式复制数模信息。打印前加热产生热量，进而气化墨水产生气泡，由此产生的压力使墨滴以不同体积（10-150 pL）喷射。在打印过程中，尽管每个喷嘴处的加热元件使局部温度上升到300℃并持续几微秒，但哺乳动物细胞只被加热2微秒，温度超过外界环境4-10℃，90%的细胞任能够保持活力。随着高通量数控技术的发展和对细胞、生长因子和生物材料支架的高精度定位，目前已经有研究组用生物打印的方法成功制造出了具有生物功能的人类微血管。

生物材料支架的产生通常是将粘性较小的生物墨水喷射到粘性较大的生物纸上。研究表明，由聚乙二醇（PEG）大分子单体合成的水凝胶可以保持软骨细胞的活力并促进细胞外基质的沉积，如蛋白聚糖和II型胶原。PEG水凝胶的压缩模量与人软骨的压缩模量相仿，和天然组织具有生物相容性，不会引发强免疫排斥。另外，PEG是水溶性的，粘度低，可以通过光交联方法进行修饰。因此，在生物打印中，PEG可以作为生物支架材料用于自发聚合。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，该方法可以按照软骨部位缺损形状、大小以及性质快速而准确的制造相应的组织，最终用于修复人软骨缺损。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，其创新点在于：包括以下步骤：

a）PEG与甲基丙烯酰氯过夜反应制备PEGDMA并纯化；

b）采用全骨髓贴壁法分离人间充质干细胞；

c）将生长状态良好的人间充质干细胞传代并调整密度，待细胞贴壁后更换诱导培养基培养；

d）清洗新鲜牛股骨，在骨软骨栓塞的中心位置用无菌活体穿孔器做出全层软骨缺损，将骨软骨栓塞置于DMEM中培养成3D生物纸；

e）将纯化的PEGDMA溶解，加入光引发剂2959，将步骤ｃ）诱导所得软骨细胞重悬在过滤除菌的PEGDMA溶液中制成生物墨水；

f）将生物打印机消毒灭菌后加入生物墨水，按照设计的形状和大小在3D生物纸上层层打印出3D软骨，将3D软骨置于诱导培养基中培养。

进一步的，步骤ａ）中采用3kDa的PEG与甲基丙烯酰氯在氮气条件下过夜反应，再通过乙醚析出和过夜冻干的方法进行纯化，使合成的PEGDMA大分子单体纯度大于95%。

进一步的，步骤ｂ）中分离人间充质干细胞包括在无菌条件下取健康成人骨髓液，用PBS漂洗并计数，将处理后的细胞培养在含20%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)青霉素-链霉素-庆大霉素的α-MEM基础培养基中，置于37℃、5%(v/v)CO₂的细胞培养箱培养，48小时后换液，之后每隔3天换液。

进一步的，步骤ｃ）中人间充质干细胞密度调整至5×10³个/cm²，所述诱导培养基含1×胰岛素-转铁蛋白-硒-丙酮酸钠，0.1mmol/L抗坏血酸磷酸盐, 1.25mg/mL 人血清白蛋白, 10-7mol/L地塞米松, 1%(v/v)青霉素-链霉素-庆大霉素, 10 ng/mL TGF-b1，将所述诱导培养基置于37℃、5%（v/v）CO₂的细胞培养箱，每3天更换一次诱导培养基，培养2-6周。

进一步的，步骤ｄ）中无菌活体穿孔器直径为4mm，缺损的深度为2-5mm，所述DMEM含有10%(v/v)小牛血清和1%(v/v)青霉素-链霉素-庆大霉素，培养温度37℃，将DMEM置于5%(v/v)CO₂的细胞培养箱。

进一步的，步骤ｅ）中PEGDMA溶解在PBS或去离子水中，浓度为10 %(w/v)和20 %(w/v) ，光引发剂2959的加入量为0.05 %(w/v)，所述生物墨水中每毫升溶液含5×10⁶个细胞。

进一步的，步骤ｆ）中生物打印机用紫外照射灭菌，打印笔用70%(v/v)乙醇消毒，打印时将UV强度为4.5 mW/cm²的长波紫外灯置于打印平台上方25cm处，打印笔中加满步骤ｅ）制得的生物墨水并用铝箔覆盖以防止紫外照射，打印出的出3D软骨在诱导培养基中分别培养2、4、6周，每3天更换一次培养基。

本发明的优点在于：1）可以按照组织受损部位的大小和形状制造出合适的软骨移植物；2）可以准确的控制单个细胞和生物材料支架的位置；3）对细胞损伤小有利于维持软骨表型；4）采用热喷墨打印机和自发光聚合反应将组织工程制造的时间大大缩短。本发明操作简单快速且准确，细胞毒性小，非常有希望成为临床软骨修复的方法。

附图说明

图1为本发明一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法的过程示意图。

图2为本发明生物打印关节软骨的COL2A1基因表达水平柱状图。

图3为本发明生物打印关节软骨的ACAN基因表达水平柱状图。

图4为本发明生物打印关节软骨的COL1A1基因表达水平柱状图。

具体实施方式

如图1所示，本发明公开了一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法，包括以下步骤：

PEGDMA的制备

将3kDa的PEG（聚乙二醇）溶解在四氢呋喃中，在氮气条件下使PEG与甲基丙烯酰氯过夜反应。通过乙醚析出和过夜冻干的方法纯化合成的PEGDMA（聚乙二醇二甲基丙烯酸酯）大分子单体，采用质子核磁共振法检测，确保合成的PEGDMA大分子单体纯度大于95%。

人间充质干细胞分离

无菌条件下取健康成人骨髓液，加入等体积PBS，用吸管吹打分散细胞。室温下取300g骨髓PBS混合液离心5min，收集细胞。用PBS重悬细胞，进行计数。室温下取300g骨髓PBS混合液离心5min，收集细胞，用含20%(v/v)胎牛血清和1%(v/v) PSG（青霉素-链霉素-庆大霉素）的α-MEM基础培养基重悬细胞，将细胞以1.6×10⁵个/cm²的密度接种于培养瓶中，置于37℃、5%(v/v)CO₂的细胞培养箱培养，48小时后换液，之后每隔3天换液。体外扩增到第二代后，将干细胞传代，调整密度至5×10³个/cm²，培养24小时使细胞贴壁。将基础培养基更换为诱导培养基DMEM，置于37℃、5%(v/v)CO₂的细胞培养箱培养，每3天更换一次诱导培养基，培养2-6周。所述诱导培养基DMEM含1×胰岛素-转铁蛋白-硒-丙酮酸钠 (ITS-A )，0.1mmol/L抗坏血酸磷酸盐, 1.25mg/mL 人血清白蛋白, 10-7mol/L地塞米松, 1%(v/v) 青霉素-链霉素-庆大霉素, 10 ng/mL TGF-b1。

3D生物纸和生物墨水的制备

取新鲜牛股骨，无菌条件下用直径8mm的不锈钢钻洞，骨软骨栓塞用含抗生素的DMEM清洗3次。在骨软骨栓塞的中心位置用直径4mm的无菌活体穿孔器做出全层软骨缺损，缺损的深度约2-5mm，具体取决于软骨的厚度。将通过上述方法制备的骨软骨栓塞培养在含有10%（v/v）小牛血清和1%(v/v)PSG（青霉素-链霉素-庆大霉素）的DMEM中，在37℃、5%(v/v)CO₂的细胞培养箱中培养成3D生物纸。将前述制得的纯化PEGDMA溶解在PBS或去离子水中，使溶液终浓度为10%(w/v)和20 %(w/v)。向溶液中加入0.05%(w/v)光引发剂2959。将诱导所得软骨细胞重悬在过滤除菌的PEGDMA溶液中，每毫升溶液含5×10⁶个细胞。

3D生物打印

将生物打印机用紫外照射灭菌，将含有50个喷墨仓的打印笔用70%(v/v)乙醇消毒。打印时将长波紫外灯置于打印平台上方25cm处，UV强度为4.5 mW/cm²。打印笔中加满前述制得的生物墨水，用铝箔覆盖打印笔以防止紫外照射。用Adobe Photoshop设计软骨缺损的大小和形状，用打印机层层打印，制造出3D软骨，并将其在诱导培养基中分别培养2、4、6周，培养基每3天更换一次。

为更清楚的了解和表征PEGDMA及3D软骨性能，我们对其进行了相应的性能测试功能鉴定。

（1）PEGDMA机械性能测试

测试前，将制备的PEGDMA无细胞水凝胶在37℃的DMEM中放置48小时，用双轴控制器测量水凝胶的厚度。采用步进式压缩的方式，用测试速度为0.1mm/s的应变荷载将水凝胶压缩至最大压缩张力的20%。每个荷载循环后，都对软骨进行DMEM溶液平衡。压缩模量根据压力-张力曲线的斜率计算。结果表明所打印的软骨组织机械强度达到或优于天然软骨的生物力学特性。

（2）PEGDMA溶胀系数测定

取一定量的PEGDMA水凝胶在37℃的DMEM中放置48小时后称重，得到溶胀后质量Ws；将PEGDMA水凝胶冻干，称重得到干重Wd。平衡溶胀比Q= Ws /Wd，水含量M=（Ws -Wd）/ Ws。结果表明所打印的关节软骨组织和天然组织非常相似。

（3）3D生物打印软骨相关基因表达水平

用液氮速冻制备的3D软骨物并将其粉末化，提取上述样品的RNA逆转录得cDNA，用实时定量PCR的方法检测软骨相关基因（COL1A1，COL2A1，ACAN，GAPDH做为内参）表达情况，如图2、图3、图4所示，分别为COL2A1，ACAN，COL1A1的表达情况。结果表明打印软骨的基因表达水平达到天然软骨的要求。

（4）3D生物打印软骨生化分析

将分别培养2周、4周、6周的3D软骨冻干48小时，分别向软骨样品中加入1ml木瓜蛋白酶溶液（含125 mg/mLIII型木瓜蛋白酶，10mM L-半胱氨酸，100mM磷酸盐缓冲液和10mM EDTA，pH 6.4），在60℃下处理16小时。之后向溶液中加入1ml胃蛋白酶溶液（浓度100 mg/mL，胃蛋白酶溶解于0.05M醋酸），将溶液置于4℃处理6天。用CyQUANT Cell Proliferation Assay试剂盒测定DNA含量，用ELISA试剂盒测定I型和II型胶原含量。结果表明打印软骨的蛋白生产水平优异。

（5）3D生物打印软骨组织学分析

将制备的3D软骨用10%福尔马林溶液固定过夜，然后将其转移到70%（v/v）的乙醇溶液中，接着用石蜡包埋经过上述步骤处理的3D软骨。包埋后制作成6μm厚的石蜡切片并用蕃红O/固绿染色，观察水凝胶分泌的蛋白聚糖。结果表明打印软骨的蛋白聚糖生成水平达到天然软骨水平。

（6）天然软骨的界面破坏应力测试

将PEG水凝胶打印到3D生物打印纸上，分别在诱导培养基中培养2、4、6周的时候收集样品。小心的将3D生物打印纸和移植物的软骨部分与软骨下骨分离，所得软骨样本置于专门的可以支持外环部分的小室中。采用由SMAC音圈电机驱动的活塞（直径稍小于3.5mm）推软骨样本中心，速度为0.1mm/s，在1kHz的时候测量轴向力并记录。中心部分的厚度用游标卡尺测定，界面破坏应力是实验中测得最大力和中心侧边区域之比。结果表明天然软骨和打印软骨的相互结合力随着培养时间的增长而增强。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。