脂肪组织制剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及医学美容制剂领域，具体涉及一种脂肪组织制剂及其制备方法与应用。
背景技术：
：1889年，游离脂肪移植的首例临床应用被报道。随后，脂肪抽吸技术于20世纪80年代开始出现，使自体脂肪颗粒的获得变得常见和普通，这极大地促进了脂肪移植与吸脂术的有机结合，自体脂肪颗粒注射移植技术也因此得到迅速发展。自体脂肪颗粒游离移植，不仅取材更加容易，而且因具有对供受体部位创伤小，不留瘢痕，生物相容性好，无排斥及过敏反应等优点，近年来在整形外科修复各种软组织凹陷或缺损中得到了广泛应用。但是，现实中移植后的脂肪存活率较低，一般仅为30％-70％。研究发现，在移植早期，脂肪移植物缺乏有效的血液供应而处于急性缺血缺氧状态。在移植物与宿主建立充分的血供之前，脂肪组织只能靠周围组织液的浸润和渗透来维持营养供应，而这种供应的距离只有150～200μm，超过该距离就需要生成新的血管来提供营养。然而，新生血管生长缓慢，每天只生长十几微米，新生血管一般要在移植后5d才能长入移植物的周边部位，这时中央部分的脂肪组织已经由于缺血缺氧时间过长，发生了坏死、液化。因此，在自体颗粒脂肪移植后的转归过程中，如何促进脂肪的再血管化，是提高脂肪移植后成活率的关键。技术实现要素：有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种脂肪组织制剂及其制备方法与应用。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：脂肪组织制剂，包含脂肪组织和内皮祖细胞。优选地，所述脂肪组织制剂由颗粒脂肪和内皮祖细胞组分组成。优选地，所述内皮祖细胞组分为内皮祖细胞生理盐水溶液。优选地，内皮祖细胞生理盐水中内皮祖细胞的浓度为5×106-1×107个/ml。优选地，颗粒脂肪的体积为内皮祖细胞生理盐水溶液体积的10倍。优选地，所述内皮祖细胞的含量为5×105-1×106个内皮祖细胞/ml颗粒脂肪。优选地，所述内皮祖细胞的含量为7×105-8×105个内皮祖细胞/ml颗粒脂肪。一种脂肪组织制剂的制备方法，按10:1的体积比例将颗粒脂肪和内皮祖细胞生理盐水溶液混合均匀，所述内皮祖细胞生理盐水溶液的浓度为5×106-1×107个/ml。上述脂肪组织制剂在整形或美容中作为填充制剂的应用。所述整形或美容包括充填颜面部的凹陷畸形、隆乳、丰颞和隆鼻。内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是一种单一谱系的干细胞，EPCs同时具有干细胞和血管内皮细胞特征，可自我更新和分化。当受到外伤、炎症、缺血等刺激后，它可以从骨髓(或其它一些组织、器官)中动员至外周血，归巢至损伤的部位并分化为血管内皮细胞，通过整合入已存在的血管(血管新生)或直接产生新的血管(血管发生)来发挥其作用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、本发明脂肪组织制剂用做整形、美容中的填充制剂，在人体内存活率高。通过实验观察，移植后具有大量正常脂肪细胞，脂肪细胞清晰，仅有少量坏色、炎性反应现象和纤维间隙；移植2-3个月后，脂肪组织颜色淡黄，柔软，有光泽，仅少许纤维包裹；2、本发明脂肪组织制剂回注填充后，移植脂肪中心部位的微血管密度正常，血管再造化明显。3、本发明脂肪组织制剂的制作方法简单，可以大量制备。附图说明图1为脂肪组织的肉眼观察结果图片。图2为脂肪组织的HE染色结果图片(10×40倍)。图3为脂肪组织的免疫组化染色结果图片(10×40倍)。其中，图A为对照组，图B为本发明实验组。具体实施方式为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。实施例1、脂肪组织制剂本实施例中的脂肪组织制剂由下述含量的下述组分组成：颗粒脂肪，5×106个/ml内皮祖细胞生理盐水溶液，其中，颗粒脂肪的体积为内皮祖细胞生理盐水溶液体积的10倍。上述脂肪组织制剂的制备方法为：将颗粒脂肪和内皮祖细胞生理盐水溶液混合均匀，使每毫升颗粒脂肪0.1ml内皮祖细胞生理盐水溶液，脂肪组织制剂中，每毫升颗粒脂肪含有5×105个/ml的内皮祖细胞。本实施例中颗粒脂肪按照常规方法制备。简述如下：将皮下脂肪置于离心机中，2000rpm，离心3分钟，用剪刀剪碎脂肪，并用孔径300μm的细胞筛过滤，得到直径﹤300μm的颗粒脂肪备用。本实施例中内皮祖细胞生理盐水溶液通过以下方法制备：(1)脐血单个核细胞的分离将脐血样本用等量的Hank’s平衡盐溶液稀释，混匀后缓慢加入到等量的人淋巴细胞分离液之上，保持分界面稳定，避免其混合；使用离心机水平转头，740×g室温离心30min。离心后可见原淋巴细胞分离液与血液之间的灰白色细胞层，即单个核细胞(MNCs)。小心收集此层细胞置于另一新离心管中，并加入含有2％FBS的PBS液中，200×g室温离心5min。离心后弃上清液，再次以含有2％FBS的PBS液重悬，200×g室温离心5min。(2)内皮祖细胞的培养单个核细胞(MNCs)最后一次离心后弃上清液，加入含有10％FBS的EGM-2培养基，轻柔吹打细胞成单细胞悬液，接种于前期包被的6孔培养板中，置于二氧化碳细胞培养箱中培养，37℃、5％CO2、湿度>95％。20ml脐带血中提取的细胞可接种于3个孔中。细胞接种后24h，吸除上清液以去除未贴壁细胞及细胞碎片，以新鲜EGM-2培养基润洗细胞，吸除后更换新鲜培养基进行培养，每日换液。培养至7天，转为隔日换液，记录最初集落形成时间；培养至14天，40×倒置相差显微镜下随机选取3个视野计数集落数量(以超过50个细胞为集落的判断标准)。至细胞生长至80％以上汇合后以0.25％胰蛋白酶/EDTA消化传代。按以上方法将细胞培养P2代备用(3)收集细胞去除瓶中培养液，用PBS清洗两次，加入2ml胰蛋白酶溶液，放入37℃、5％CO2培养箱中，约2分钟后，加入2ml含10％胎牛血清的DMEM终止消化，对细胞进行计数。1000转离心5分钟，去除上清培养基，使用生理盐水调至细胞浓度5×105，得到内皮祖细胞生理盐水溶液。实施例2、脂肪组织制剂本实施例中的脂肪组织制剂由下述含量的下述组分组成：颗粒脂肪，7.5×106个/ml内皮祖细胞生理盐水溶液，其中，颗粒脂肪的体积为内皮祖细胞生理盐水溶液体积的10倍。上述脂肪组织制剂的制备方法为：将颗粒脂肪和内皮祖细胞生理盐水溶液混合均匀，使每毫升颗粒脂肪0.1ml内皮祖细胞生理盐水溶液，脂肪组织制剂中，每毫升颗粒脂肪含有7.5×105个/ml的内皮祖细胞。本实施例中颗粒脂肪和内皮祖细胞生理盐水溶液的制备方法与实施例1相同。实施例3、脂肪组织制剂本实施例中的脂肪组织制剂由下述含量的下述组分组成：颗粒脂肪，1×107个/ml内皮祖细胞生理盐水溶液，其中，颗粒脂肪的体积为内皮祖细胞生理盐水溶液体积的10倍。上述脂肪组织制剂的制备方法为：将颗粒脂肪和内皮祖细胞生理盐水溶液混合均匀，使每毫升颗粒脂肪0.1ml内皮祖细胞生理盐水溶液，脂肪组织制剂中，每毫升颗粒脂肪含有1×106个/ml的内皮祖细胞。本实施例中颗粒脂肪和内皮祖细胞生理盐水溶液的制备方法与实施例1相同。为了更好的说明本发明的效果，对本发明脂肪组织制剂进行动物实验。采用8只月龄为4-6周的健康SPF级裸鼠(广东省动物实验中心提供)，体质量15～18g，雌雄不限。实验动物作下列分组：将裸鼠随机分为A、B两组，每组四只，每只分别于背部皮下注射4点，每点注射0.4ml脂肪组织制剂。A组为空白对照组，其脂肪组织制剂为每毫升颗粒脂肪加入0.1ml生理盐水。B组为实验组，分别采用实施例2中的脂肪组织制剂。注射后、注射3个月后，麻醉裸鼠，取各点移植物放入10％多聚甲醛保存，进行肉眼观察、HE染色和免疫组化实验。效果实施例1、肉眼观察肉眼观察脂肪组织体积大小、质地、色泽、纤维包膜形成情况。结果如图1所示。由图1可知，A组移植物质地较硬，灰暗无光泽，可见明显纤维包裹现象；B组较柔软，有光泽，颜色淡黄，仅有少许纤维包裹。综上所述，B组脂肪存活效果明显优于A组脂肪。效果实施例2、HE染色对3个月后的脂肪组织进行HE染色，方法如下：将脂肪组织放入固定液中固定24小时，从固定液中取出脂肪组织，使用酒精浸泡脱水，然后将脱水后的脂肪组织放入二甲苯溶液去除酒精并透明化。将已透明的脂肪组织放入已融化的石蜡中包埋，然后立刻取出冷却凝固成块。石蜡块冰冻半小时，放入切片机中切片得到石蜡切片，烘干石蜡切片后脱蜡染色，然后镜检。HE染色结果如图2所示。由图2可知，A组脂肪细胞散在分布，纤维结缔组织较多；B组纤维结缔组织较少，并可见分布的血管横断面。综上所述，B组脂肪存活效果明显优于A组。效果实施例3、免疫组化对及3个月后的脂肪组织进行免疫组化实验，方法如下：将石蜡切片(制备方法同HE染色方法)置于65℃烘箱中20分钟，PBS冲洗。滴加约50μl3％H2O2在切片上室温静置10分钟，PBS冲洗。将切片置于EDTA溶液中，放入高压锅中加热，待高压锅喷气阀喷气后计时3分钟。取出切片复温1小时，PBS冲洗。采用二步法免疫组化检测试剂盒(BOSTER)，按照说明书滴加适当稀释的一抗(兔IgG)，20-37℃孵育1～2小时或4℃过夜。用0.01MPBS洗2分钟，滴加聚合HRP标记抗兔IgG(SV-0002)，37℃孵育30分钟，PBS或TBS冲洗2分钟。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般5-30分钟。蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染、脱水，透明，封片、观察。结果如图3所示。图中阳性部位表明该处为微血管横截面。统计每组20个视野下微血管的个数，统计结果如表1所示。表1、微血管个数统计表组别每个视野微血管横截面平均数(个)A组1±0.976B组4±1.523由表1可知，B组与A组差异极显著(P<0.001)。B组每个视野微血管横截面平均数为4个以上，A组每个视野微血管横截面平均数为1个左右，B组脂肪组织在体内形成的微血管数是A组的四倍，证明本发明方案有利于脂肪在体内存活。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 2 3