一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法与流程

文档序号:12211371阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法,其特征在于:包括以下步骤:

PEG与甲基丙烯酰氯过夜反应制备PEGDMA并纯化;

采用全骨髓贴壁法分离人间充质干细胞;

将生长状态良好的人间充质干细胞传代并调整密度,待细胞贴壁后更换诱导培养基培养;

清洗新鲜牛股骨,在骨软骨栓塞的中心位置用无菌活体穿孔器做出全层软骨缺损,将骨软骨栓塞置于DMEM中培养成3D生物纸;

将纯化的PEGDMA溶解,加入光引发剂2959,将步骤c)诱导所得软骨细胞重悬在过滤除菌的PEGDMA溶液中制成生物墨水;

将生物打印机消毒灭菌后加入生物墨水,按照设计的形状和大小在3D生物纸上层层打印出3D软骨,将3D软骨置于诱导培养基中培养。

2.如权利要求1所述的一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法,其特征在于:步骤a)中采用3kDa的PEG与甲基丙烯酰氯在氮气条件下过夜反应,再通过乙醚析出和过夜冻干的方法进行纯化,使合成的PEGDMA大分子单体纯度大于95%。

3.如权利要求1所述的一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法,其特征在于:步骤b)中分离人间充质干细胞包括在无菌条件下取健康成人骨髓液,用PBS漂洗并计数,将处理后的细胞培养在含20%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)青霉素-链霉素-庆大霉素的α-MEM基础培养基中,置于37℃、5%(v/v)CO2的细胞培养箱培养,48小时后换液,之后每隔3天换液。

4.如权利要求1所述的一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法,其特征在于:步骤c)中人间充质干细胞密度调整至5×103个/cm2,所述诱导培养基含1×胰岛素-转铁蛋白-硒-丙酮酸钠,0.1mmol/L抗坏血酸磷酸盐, 1.25mg/mL 人血清白蛋白, 10-7mol/L地塞米松, 1%(v/v)青霉素-链霉素-庆大霉素, 10 ng/mL TGF-b1,将所述诱导培养基置于37℃、5%(v/v)CO2的细胞培养箱,每3天更换一次诱导培养基,培养2-6周。

5.如权利要求1所述的一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法,其特征在于:步骤d)中无菌活体穿孔器直径为4mm,缺损的深度为2-5mm,所述DMEM含有10%(v/v)小牛血清和1%(v/v)青霉素-链霉素-庆大霉素,培养温度37℃,将DMEM置于5%(v/v)CO2的细胞培养箱。

6.如权利要求1所述的一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法,其特征在于:步骤e)中PEGDMA溶解在PBS或去离子水中,浓度为10 %(w/v)和20 %(w/v) ,光引发剂2959的加入量为0.05 %(w/v),所述生物墨水中每毫升溶液含5×106个细胞。

7.如权利要求1所述的一种基于3D生物打印修复人关节软骨的方法,其特征在于:步骤f)中生物打印机用紫外照射灭菌,打印笔用70%(v/v)乙醇消毒,打印时将UV强度为4.5 mW/cm2的长波紫外灯置于打印平台上方25cm处,打印笔中加满步骤e)制得的生物墨水并用铝箔覆盖以防止紫外照射,打印出的出3D软骨在诱导培养基中分别培养2、4、6周,每3天更换一次培养基。

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