本发明涉及医学软骨组织工程技术领域，具体涉及一种具有再生性能和理想力学强度的去细胞化软骨支架及其制备方法。
背景技术：
软骨的自身修复能力极其有限，用组织工程技术构建工程化软骨为修复软骨缺损提供了一种具有良好应用前景的方法。软骨组织工程的研究内容包括种子细胞、支架材料、细胞因子以及生物反应器技术等，其中构建理想的支架材料是成功构建软骨组织工程的关键。细胞支架为软骨细胞的增殖分化提供适宜的场所，相当于软骨的细胞外基质成分。
目前用于软骨组织工程的支架材料包括天然材料和人工合成材料两种，人工合成的材料主要有聚乙交酯、聚丙交酯以及两者的共聚物等。人工合成材料的缺点是疏水性，不利于细胞的粘附，并且降解产物呈酸性，在体内容易引起炎症反应。而天然材料来源于动物或人体，其网状结构、成分、生物力学环境适合种子细胞的生长、发育及新陈代谢，材料可降解，因此越来越受到研究者的重视。
目前常用的天然软骨支架材料有胶原和透明质烷为原料的天然软骨的仿生支架。天然材料研制的基本原则是仿生，即模拟天然软骨细胞外基质的结构与生物化学成分，为软骨细胞生长提供适宜环境。但是软骨的细胞外基质生化成分与结构复杂，仿生材料难于真正模仿软骨组织的复杂的天然结构、生物力学和生物学特性，很少进入临床应用，尚无理想的支架。
脱细胞基质由于去除了细胞和可溶性蛋白等引起免疫反应的物质，并且保留了原先的天然结构，已经得到了广泛的应用。目前，异体脱细胞真皮基质已经商品化。国外有人用酒精脱水、冻干和液氮循环冻融等方法对兔鼻间隔软骨进行灭活，作为细胞生长的支架，但是此种方法会使细胞残片残留，抗原性去除不彻底，并且灭活的大块软骨无多孔网状结构，细胞营养供应以及代谢废物排出困难。国内有将软骨整块进行脱细胞处理的研究报道，但形成的脱细胞软骨不具备组织工程支架要求得多孔网状结构，营养物质的传送以及代谢物的派出困难；另外国内有将软骨进行粉碎后脱细胞的研究报道，韩雪峰等人将软骨粉碎成100～154μm微粒，与软骨细胞混合培养构建组织工程骨，其缺点是微粒较大、与软骨细胞混合不均匀，并且不具备一定具体的形状，细胞-微粒复合体生物力学强度低，手术植入不易操作，移植后易出现变形等问题。
丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70％～80％，富含18种氨基酸，具有优良的物理特性和化学特性，可以通过不同处理得到纤维、粉末、膜、凝胶等不同性状的材料。近年来随着组织工程化器官和细胞支架研究的兴起以及各种生物技术的发展，丝素蛋白的应用越来越广泛，已成功应用于手术缝合线等多种医用材料中，但是丝素蛋白本身不具有促进软骨再生能力。此外，体外细胞培养实验发现，表面涂有丝素蛋白的培养皿中，细胞不易黏附，生长缓慢。因此，尽管丝素蛋白具有较好的弹性强度、耐磨性能等力学特性，但缺乏促进细胞黏附和再生能力，因此很难应用于软骨支架中。
理想的用于组织工程软骨构建的支架材料应符合以下基本要求：①具有良好的弹性强度、耐磨性能等力学特性，能与组织植入部位的力学要求相匹配。②具有适合细胞粘附、增生和分化的表面化学特性，有利于细胞附着再生。③为软骨细胞生长提供了最接近的细胞外微环境，良好的生物相容性和生物可吸收性。④制备流程简单易行，制备出的支架产品易长期保存。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种具有再生性能和弹性强度的去细胞化软骨支架，能够复合细胞从而构建组织工程软骨，可用于临床上修复软骨缺损。
本发明的另一目的在于提供上述去细胞化软骨支架的制备方法。
通过大量实验，本发明将良好的生物相容性和优良力学性能的丝素蛋白作为基质材料，结合具有良好黏附性的蜗牛黏蛋白和具有促进组织再生能力的蟾蜍器官去细胞支架，制备形成一种符合理想支架要求的去细胞化软骨支架。
本发明的一种具有去细胞化软骨支架主要组分包括丝素蛋白、蜗牛黏蛋白、甾醇、蟾蜍或青蛙的软骨去细胞支架成分，可以通过改变组分配比，控制软骨支架的力学强度和降解速度，该去细胞化软骨支架呈三维固体形状，表面分布细密的空洞，具有促进细胞再生和黏附的性能。
上述的去细胞化软骨支架中丝素蛋白的质量百分含量为30％-60％、蟾蜍或青蛙的软骨去细胞支架成分的质量百分含量为20％-60％、蜗牛黏蛋白的质量百分含量为1％-15％、甾醇的质量百分含量为0.5％-5％。
上述的甾醇包括胆甾醇、谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇。
上述的去细胞化软骨支架中可进一步加入活性因子、抗生素、pH缓冲液、稳定剂中的一种或一种以上的混合物。
上述的稳定剂包括聚乙二醇、聚维酮、明胶、胶原、右旋糖酐、丙三醇、海藻糖、1，2，4-丁三醇、赤藓糖醇、苏阿糖醇、季戊四醇、环戊五醇、木糖醇、来苏糖醇、阿拉伯糖醇、环己六醇、山梨醇、阿洛糖醇、阿卓糖醇、葡萄糖醇、甘露醇、艾杜糖醇、半乳糖醇、太罗糖醇及果糖醇中的一种，或它们的任意组合。
上述的活性因子包括硫酸软骨素、透明质酸、促进组织生长的生物活性因子一种或几种。
一种上述去细胞化软骨支架的制备方法：将所述的丝素蛋白、蜗牛黏蛋白、甾醇、蟾蜍或青蛙的软骨去细胞支架成分加入到含有抗生素、pH缓冲液、稳定剂的水溶液中，搅拌形成均匀溶液，灌注于金属模具中，液氮速冻成型，冷冻干燥除去水分，形成三维固体支架，γ-射线辐照灭菌。
上述的去细胞化软骨支架表面成亲水性，分布细密的孔洞，有利于软骨细胞的黏附。
上述的去细胞化软骨支架用于软骨组织的替换移植物。
本发明的去细胞化生物支架具备以下优点：①应用蟾蜍或青蛙的软骨去细胞支架成分，不仅来源广泛，而且生物相容性好，并有促进软骨组织再生的能力。②应用丝素蛋白，去除因丝胶蛋白引起的免疫反应，保持去细胞化软骨组织支架具有良好的弹性强度、耐磨性能等力学特性，能与组织植入部位的力学要求相匹配。③蜗牛黏蛋白、甾醇和蟾蜍或青蛙的软骨去细胞支架成分合用，为软骨细胞生长提供了最接近的细胞外微环境，具有促进细胞粘附、增生和分化的特性，有利于软骨细胞附着再生。④去细胞化软骨组织支架具有良好的生物相容性和生物可吸收性。⑤制备流程简单易行，制备出的三维去细胞化生物支架无菌，容易长期保存；表面成亲水性，分布细密的孔洞，有利于软骨细胞的黏附。⑥制备过程不经加热，不使用任何化学或酶交联剂，不会产生因交联剂残留导致的毒副反应，也保存了各组分的活性。
具体实施方式
下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例1具有再生性能和弹性强度的去细胞化软骨支架的制备
按照表1的去细胞化软骨支架各实验组和对照组的组成，秤取各组分，将抗生素、pH缓冲液、稳定剂等附加组分溶解配成水溶液，加入丝素蛋白、蜗牛黏蛋白、甾醇、蟾蜍或青蛙的软骨去细胞支架成分，搅拌均匀，灌注于金属模具中，浸入液氮中速冻成型，脱模，将成型的去细胞支架冷冻干燥处理，除去水分，形成三维固体支架，γ-射线辐照灭菌，封装于无菌容器中保存。
表1 去细胞化软骨支架各实验组的组成
注：“/”代表此项组分为0；“软骨去细胞支架成分”项下数字后的括号内的动物是指软骨去细胞支架成分的来源动物。
实施例2具有再生性能和弹性强度的去细胞化软骨支架的性能检测和应用效果
(1)去细胞化软骨支架的性能检测
表面孔径观察：光镜和扫描电镜观察下各组的去细胞化软骨支架表面的孔隙率和孔径大小，是否均匀一致。
吸水性测定：称量去细胞化软骨支架质量Wo值，然后置于盛有去离子水的称量瓶中，充分溶胀，用滤纸吸干表面水分，称质量得Wn值。样品吸水率根据下列公式计算：吸水率(％)＝[(Wn-Wo)/Wo]×100
硬度测定：利用万能试验机，测定去细胞化软骨支架的压缩模量和拉伸模量。
(2)支架的生物相容性
采用MTT法检测去细胞化软骨支架浸提液对体外培养的多种细胞的毒性；采用裸鼠实验，将去细胞化软骨支架植入到裸鼠背部皮袋，4周后取组织观察结果，判断支架的体内相容性。
(3)对缺损的兔膝关节软骨的移植修复效果
将去细胞化软骨支架植入修复兔膝关节软骨缺损，6个月后观察兔膝关节的活动行为，取修复部位的软骨组织进行组织学观察，综合评价各组的去细胞化软骨支架对于缺损的兔膝关节软骨的移植修复后的应用效果。本项指标作为软骨组织的替换移植物的最关键评价指标。
实验结果：以上各组的去细胞化软骨支架实验结果见表2。
从表2数据可见，各个实验组在孔隙率、孔径大小、吸水性、压缩模量和拉伸模量等性能指标上相差不明显，各项性能指标优异，且体内外相容性良好，兔膝关节的活动行为和组织学评价等指标良好，验证了实验组对于缺损的兔膝关节软骨具有良好移植修复效果。
对照组1的孔隙率、孔径大小、吸水性、压缩模量和拉伸模量等性能指标很差，对于兔膝关节软骨缺损无修复效果，移植后关节出现变形。
对照组3选用同为啮齿类动物小鼠的软骨去细胞支架成分，但是对于兔膝关节软骨缺损的修复效果不如实验组，且再生的软骨细胞形态差。
对照组2、4和5在孔隙率、孔径大小、吸水性、压缩模量和拉伸模量等性能指标上与实验组相近，也具有良好的体内外相容性，但在兔膝关节软骨缺损的实验中修复效果较差，并伴有再生的细胞形态差、骨质疏松、软骨细胞附着少等问题。
由上可知，实验组对于对缺损的兔膝关节软骨的移植修复效果良好，可以作为软骨组织的替换移植物。而缺失本发明的去细胞化软骨支架主要成分的对照组不能作为关节软骨缺损的移植替代物应用，即使替换同为啮齿类动物小鼠的软骨去细胞支架成分代替本发明的蟾蜍或青蛙的软骨去细胞支架成分，也不能取得良好的软骨修复效果。
表2 去细胞化软骨支架各实验组的性能结果和应用效果
上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。
另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。