细菌总量、细菌孢子量的一体化的检测微流控芯片的制作方法

本发明设计微流控芯片技术领域，具体涉及一种可以用于航天器同时检测细菌总量与细菌孢子的一体化微流控芯片。

背景技术：

从地球飞往其他行星体的航天器上的细菌污染物可能会影响目的天体现场生命探测实验和返回的天体星球样本，从行星保护的角度必须选择合适的法对航天器进行细菌检测，确定其细菌总量以及忍受强辐射、干燥等极端环境的细菌芽孢量，进而采用合适的方法进行消杀以维持航天器高清洁环境。当前航天器细菌检测是采用微生物培养技术。使用这种对航天器进行微生物检测有着一定的不足：首先精准度不足，因为某些微生物不可培养性容易低估航天器的微生物总数量，。其次是细菌芽孢培养需要与总细菌的培养分开，即首先通过80℃加热杀死微生物营养体细胞，然后才可培养细菌芽孢。最后时间过长，培养结果往往需要72小时或者更长时间。因此需要开发一种能够快速、简便、灵敏的检测航天器细菌的方法。

生物发光法检测atp具有高特异性、较高灵敏度、方便快速和较宽测定范围等特点，随着社会的发展，人类不断发展和改进atp生物发光法，使其在食品卫生、环境监测、药物筛选、医学研究等领域有着广泛的应用。传统的平板菌落计数法等检测细菌的方法相比，采用atp生物发光法进行细菌总数检测，不需要长时间的培养过程，具有操作简便、灵敏度高、响应迅速等优点，在食品卫生和环境监测中，能够快速发现可能存在的细菌污染，并确定其含量。

dpa是细菌芽孢中特有的成分，其约占芽孢干重的～10％，可通过孢子的物理、化学裂解或者萌芽等方式释放出来。所以dpa可作为细菌芽孢的重要生物标志物用于检测细菌芽孢的存在。dpa也是一种经典的无机化学配体，它将金属离子与高亲和力结合起来。dpa与铕离子(或其他发光的镧系或过渡金属离子)结合，在紫外光激发下触发强烈的发光现象。依据这一原理进行dpa荧光染色技术测定细菌孢子数量。

微流控芯片(microfluidicchip)又称微流控芯片实验室或芯片实验室(lab-on-a-chip)。微流控芯片是微流控技术中实现实际检测的主要平台。微流控芯片的主要特征是其容纳流体的通道为微米级尺度，流体的操控也是在微小空间实现，从而实现在微小的芯片上构建化学或生物实验室，能够将多种化学和生物学的过程在快速和自动的微流控系统下完成。

目前现有的研究中，已经具有基于atp生物发光的微流控芯片用于细菌检测的报道，但是至今为止，尚未有将atp生物发光、dpa荧光二者结合，同时可以检测者细菌总量与细菌孢子的一体化微流控芯片报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种细菌总量、细菌孢子量的一体化的检测微流控芯片及其应用，用于实现样品进样、样品处理、样品反应和样品检测的全流程过程。实现了在微流控芯片上同时结合atp荧光定量检测细菌总量与dpa荧光定量检测细菌孢子两种方法，具有体积小、集成化，样品及试剂消耗量少、灵敏度高等优点。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

细菌总量、细菌孢子量的一体化的检测微流控芯片，其特征在于，包括芯片基体、流体通道、样本处理单元、反应单元、荧光检测单元。样本处理单元贴合设置在芯片本体上，包括裂解区和洗涤区，样品通过进样通道进入样本处理单元进行预处理；反应单元贴合设置在芯片本体上，包括加样区和荧光激发区，反应物和反应试剂可通过流体通道输送到反应区域中，以完成反应；荧光检测单元包括单光子计数器、数据显示卡并连接到电脑pc端以显示结果。

进一步地，芯片基体上包括两条通路，分别设有所述样本处理单元和所述反应单元，并通过所述流体通道与所述荧光检测单元连通。

进一步地，所述样本处理单元、所述反应单元和所述荧光检测单元在芯片基体上呈直线排列。

进一步地，所述样品处理单元和所述反应单元包括在芯片基体一侧的通道1中的第一裂解区、第一洗涤区、第一加样区；以及在芯片基体另一侧的通道2中的第二裂解区、第二洗涤区、第三加样区和荧光激发区。

进一步地，样品通过y型流体通道分别进入两条通道进行反应与检测。

进一步地，第一裂解区与第一洗涤区之间和第二裂解区与第二洗涤区之间的流体通道由装有冷水的管壁包裹用于冷却。

本发明提供的微流控芯片具有以下优点：

检测速度快，分析效率高。在微流控芯片上实现相关的自动分析和检测的功能只需要数秒钟，甚至更短的时间，大大提高了样品的分析效率，快速准确的得出检测结果。

样品及试剂消耗量少。由于微流控芯片中通道尺寸为微纳米级别，所需检测样品及相关生物试剂量为微升甚至纳升，对于昂贵的生物试剂来说，可以节省大量的检测成本，而且在某些样品极其微少的条件下同样可以进行检测。

功能集成化。集样品进样、样品预处理、样品洗涤、样品反应、样品检测于一体，极大地简化了操作流程，降低了样品和试剂消耗，具有巨大的经济价值和社会价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明中的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实施例的一部分，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提出的微流控芯片的示意图。

其中，图中各附图标记：

1-芯片基体；2-第一裂解区；3-第一洗涤区；4-第一反应区；5-第一检测区；6-第二裂解区，7-第二洗涤区；8-第二反应区；9-荧光激发区；10-第二检测区；11-进样孔；12-进样通道；13-进样通道；14-激发光通道；15-出样孔；16-流体通道。

具体实施方式

为了使本发明的目的、结构及功能更加清楚明白，以下结合附图，对本发明的一种微流控芯片及其应用做进一步的详细描述。应当了解，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明提出的微流控芯片包括：芯片基体1，在芯片基体上设有平行两个通道，其中一条通道按直线排列依次设有第一裂解区2、第一洗涤区3、第一反应区4和第一检测区5；另一条通道同样按直线排列依次设有第二裂解区6、第二洗涤区7、第二反应区8、荧光激发区9和第二检测区。从而使得该微流控芯片集样品进样、样品预处理、样品洗涤、样品反应、样品检测于一体，极大地简化了操作流程，降低了样品和试剂消耗，并且不用配备昂贵的仪器，极大地降低了使用成本，使现场即时检测成为可能，具有巨大的经济价值和社会价值。

所述芯片基体1还设有进样孔11和出样孔15，所述样品裂解区、洗涤区、反应区和检测区之间通过微流控通道16联通。检测区提供了反应后的样品利用光学检测系统对其进行荧光检测的空间，样品在所述微流控芯片上完成反应及检测后，通过流体通道从出样孔15排出。

具体地，本发明所提出的微流控芯片的一种具体实施方式为在所述微流控芯片上同时结合atp荧光定量与dpa荧光定量两种方法，以快速有效地检测出细胞内细菌总量和细菌孢子总量。

进一步地，如图1所示，作为本发明提供的微流控芯片的一种具体实施方式，对于atp荧光定量法，样品进入第一裂解区2，采用加热方法将细胞外的atp消除，并将细胞内的atp全部释放出来，经过第一洗涤区3进入第一反应区4。此外，荧光素-荧光素酶试剂通过流体通道12进入第一反应区4，与预处理后的样品进行反应，之后通过流体通道进入第一检测区5，利用光学检测系统对其进行检测并定量。

进一步地，如图1所示，作为本发明提供的微流控芯片的一种具体实施方式，对于dpa荧光定量法，样品进入第二裂解区6，采用加热方法释放细菌孢子中的dpa，在第二洗涤区7内进行离心并收集含有dpa的上清液；此外，经过预处理后的样品通过流体通道进入第二反应区8，与通过流体通道13进入的eu-gnps-tnfb复合物溶液进行反应；反应后的溶液进入荧光激发区9，将激发光导入流体通道14，对样品进行荧光激发，之后进入第二检测区10利用光学检测系统对其进行检测并定量。

进一步地，如图1所示，作为本发明提供的微流控芯片的一种具体实施方式，所述第一反应池4和第二反应池8的体积大于样品裂解区和洗涤区的体积，这样可以保证能完全容纳所需添加的试剂。

进一步地，如图1所示，作为发明提供的微流控芯片的一种具体实施方式，上述微流控芯片还包括遮光层(附图未作出)，该遮光层可用于将反应区、荧光激发区、检测区和连接所述反应腔室的流体通道遮盖住，这样可以保证芯片内部样品溶液和反应产物不受外界可见光与检测光源的干扰。

所述反应腔与进样孔及出样孔之间的结构设置可以根据需求进行多样化，同一个微流控芯片上可以同时并列设置有多个反应腔，彼此之间通过多条微流控管道联通。