酶解-膜过滤循环装置及利用该装置制备贝类多肽的方法与流程

本发明涉及多肽的制备技术领域，具体是一种酶解-膜过滤循环装置及利用该装置制备贝类多肽的方法。

背景技术：

海洋贝类含有丰富的、结构多样的生物活性肽。我国海洋贝类种类丰富，产量居世界之首，2014年产量达1341.67×10⁴t。海洋贝类肉质肥嫩，鲜美可口，含有大量的蛋白质、氨基酸、多糖等营养物质，是一种经济价值极高的海洋生物。大多数情况下，海洋贝类仅仅被加工成食品，品种单一，产品附加值低。运用酶解技术从海洋贝类或其加工副产物中提取具有生物功能活性的多肽，高值化利用海洋贝类资源，可获得更好的经济效益。近年来，从海洋贝类中获取生物活性肽的研究受到了广泛关注。

生物活性肽是蛋白序列内不活动的特定蛋白质片段，这个特定蛋白质片段可通过胃肠消化或食品加工从亲本蛋白中释放出来，并表现出多种生物功能活性，在机体生命活动中起着重要作用。生物活性肽是由两个或两个以上氨基酸缩合而成的，一般具有2-20个氨基酸残基，分子量一般小于6000da。生物活性肽的结构特性（氨基酸组成及序列）影响活性肽的活性，使得生物活性肽表现出多种生物活性，例如抗氧化、抗肿瘤、抗高血压、抑菌和抗凝血等。

目前，生物活性肽生产常用的方法有四种：(1)化学合成法、(2)酶解法、(3)重组dna技术、(4)发酵法。化学合成法广泛应用于生产高价值的中长肽，缺点是成本高，而且在合成过程中可能产生对健康和环境有害的物质；重组dna技术也被广泛应用，但这种方法需要昂贵的材料和设备，投资大，成本高，其安全性还需进一步检测，且多限于多肽的生产，而生物活性肽大都是短肽，所以重组dna技术在这方面的应用是有限的；发酵法是选取微生物菌种进行发酵，在发酵过程中产生具有活性的肽序列，该方法生产活性肽安全、易操作，但生产时间较长，该方法在乳源性活性肽生产方面应用较多；酶法生产活性肽则有许多优点，该法可生产大量短肽，反应条件温和，反应过程易于控制，生产时间短，且所用试剂和原料均是食品级的，安全性高。因此，活性肽的研究和生产主要采用酶解的方法进行。然而传统酶法制备多肽存在酶利用率不高、底物过度降解，以及操作不具备连续性等问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种酶解-膜过滤循环装置及利用该装置制备贝类多肽的方法，该装置可同时连续进行混合酶水解和膜过滤，并对截留的大分子量的超滤液进行再次酶解，有利于节约原料，提高原料利用率和产品生产效率；该方法制备的贝类多肽产品品质好，有利于生产大量短肽，贝类多肽的得率可达90%以上，同时能够有效提高制备的贝类多肽的转化率至85%以上，同时提高贝类多肽的抑制率至95%以上。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：酶解-膜过滤循环装置，包括原料池、第一恒温槽、酶解池、第二恒温槽、离心装置、膜过滤组件、集液槽、给料泵、第一循环泵和第二循环泵；所述的原料池设置在所述的第一恒温槽的内部，所述的原料池经所述的给料泵与所述的酶解池连接；所述的酶解池设置在所述的第二恒温槽的内部，所述的酶解池内设置有搅拌棒和ph计，所述的酶解池依次经所述的离心装置和所述的第一循环泵与所述的膜过滤组件的入口连接；所述的膜过滤组件的出口分别与所述的集液槽和所述的第二循环泵连接，所述的第二循环泵的另一端与所述的酶解池连接；所述的膜过滤组件为兼具分离、浓缩、纯化和精制功能的膜过滤组件；所述的集液槽用于收集所述的膜过滤组件超滤的小分子量的超滤液；所述的第二循环泵用于向所述的酶解池引入所述的膜过滤组件截留的大分子量的超滤液进行再次酶解。

利用上述酶解-膜过滤循环装置制备贝类多肽的方法，包括以下步骤：

（1）原料预处理：将贝类肉绞成肉糜，并加肉糜质量3-6倍的水匀浆，得到以贝类肉糜作为底物的底物溶液，置于酶解-膜过滤循环装置的原料池中，并将第一恒温槽的温度控制在40-60℃的恒温；

（2）混合酶水解：将第二恒温槽的温度控制在40-60℃的恒温，向给料泵加压，将原料池中的底物溶液输送至酶解池中，再调节底物溶液的ph值至7.5-9，向酶解池内加入底物溶液质量1-3%的混合酶，用搅拌棒持续搅拌酶解2-3小时，得酶解液；

（3）灭酶：将第二恒温槽的温度升温至95-100℃，在95-100℃下持续灭酶处理15-20min，得到灭酶后的混合液体；

（4）离心过滤：将灭酶后的混合液体通过离心装置离心处理10-30min，取上清液；

（5）膜过滤：将得到的上清液经过第一循环泵进入膜过滤组件，在膜过滤组件内，经超滤膜或纳滤膜超滤处理，分子量小于1000da的超滤液被集液槽收集，分子量大于1000da的超滤液被截留并经过第二循环泵重新进入酶解池，将第二恒温槽的温度控制在40-60℃的恒温，调节酶解池内超滤液的ph值至7.5-9，在酶解池内再次加入混合酶，该混合酶的加入量为经过第二循环泵重新进入酶解池的超滤液质量的1-3%，在酶解池内，用搅拌棒持续搅拌酶解2-3小时，通过混合酶对分子量大于1000da的超滤液进行二次酶切，得二次酶解液；

（6）重复一次步骤（3）和步骤（4），将得到的上清液经膜过滤组件内的超滤膜或纳滤膜超滤处理，分子量小于1000da的超滤液被集液槽收集；

（7）将集液槽收集的分子量小于1000da的超滤液进行冷冻干燥，即得到贝类多肽产品。

作为优选，步骤（2）和步骤（5）中所用的混合酶的组成均为：木瓜蛋白酶39-44%、中性蛋白酶28-33%、胰蛋白酶24-28%。该混合酶对贝类多肽的酶切效果较好，有利于获得大量短肽。

作为优选，步骤（4）中离心处理的转速为4500-5000r/min。

作为优选，步骤（5）和步骤（6）中超滤处理的温度为20-30℃，压力为0.2-0.25mpa。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明公开的酶解-膜过滤循环装置，可同时连续进行混合酶水解和膜过滤，并对截留的大分子量的超滤液进行再次酶解，有利于节约原料。混合酶水解和膜过滤两个过程采用连续的方式进行，达到连续化的操作，易于工业化生产，提高原料利用率和产品生产效率。此外，由于产物是连续采出，因而使反应尽可能向产物方向进行，可得到比传统制取工艺更高的转化率。

2、本发明公开的制备贝类多肽的方法，其混合酶水解反应条件温和、易于控制，同时通过对大分子贝类多肽进行二次酶切，有效提高了贝类多肽的转化率，更有效的发挥了活性肽的功能性。本发明制备方法所得贝类多肽产品品质好，有利于生产大量短肽，能够有效提高制备的贝类多肽的转化率至85%以上，同时提高贝类多肽的抑制率至95%以上。

3、本发明公开的制备贝类多肽的方法，采用膜过滤组件，通过膜分离的方法有效分离出小分子的贝类多肽，赋予最终得到的贝类多肽高纯度、高品质和高得率，贝类多肽的得率可达90%以上。本发明方法尤其适用于牡蛎、缢蛏等贝类多肽的制备。

附图说明

图1为本发明酶解-膜过滤循环装置的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：一种酶解-膜过滤循环装置，如图1所示，包括原料池1、第一恒温槽2、酶解池3、第二恒温槽4、离心装置5、膜过滤组件6、集液槽7、给料泵8、第一循环泵9和第二循环泵10；原料池1设置在第一恒温槽2的内部，原料池1经给料泵8与酶解池3连接；酶解池3设置在第二恒温槽4的内部，酶解池3内设置有搅拌棒31和ph计32，酶解池3依次经离心装置5和第一循环泵9与膜过滤组件6的入口连接；膜过滤组件6的出口分别与集液槽7和第二循环泵10连接，第二循环泵10的另一端与酶解池3连接；膜过滤组件6采用现有技术，为兼具分离、浓缩、纯化和精制功能的膜过滤组件6；集液槽7用于收集膜过滤组件6超滤的小分子量的超滤液；第二循环泵10用于向酶解池3引入膜过滤组件6截留的大分子量的超滤液进行再次酶解。

实施例2：利用实施例1的酶解-膜过滤循环装置制备贝类多肽的方法，包括以下步骤：

（1）原料预处理：将贝类肉绞成肉糜，并加肉糜质量3倍的水匀浆，得到以贝类肉糜作为底物的底物溶液，置于酶解-膜过滤循环装置的原料池中，并将第一恒温槽的温度控制在40℃的恒温；

（2）混合酶水解：将第二恒温槽的温度控制在40℃的恒温，向给料泵加压，将原料池中的底物溶液输送至酶解池中，再调节底物溶液的ph值至7.5，向酶解池内加入底物溶液质量2%的混合酶，用搅拌棒持续搅拌酶解2小时，得酶解液；

（3）灭酶：将第二恒温槽的温度升温至95℃，在95℃下持续灭酶处理20min，得到灭酶后的混合液体；

（4）离心过滤：将灭酶后的混合液体通过离心装置以4500r/min的转速离心处理30min，取上清液；

（5）膜过滤：将得到的上清液经过第一循环泵进入膜过滤组件，在膜过滤组件内，经超滤膜或纳滤膜超滤处理，超滤处理的温度为30℃，压力为0.2mpa，分子量小于1000da的超滤液被集液槽收集，分子量大于1000da的超滤液被截留并经过第二循环泵重新进入酶解池，将第二恒温槽的温度控制在40℃的恒温，调节酶解池内超滤液的ph值至7.5，在酶解池内再次加入混合酶，该混合酶的加入量为经过第二循环泵重新进入酶解池的超滤液质量的3%，在酶解池内，用搅拌棒持续搅拌酶解2小时，通过混合酶对分子量大于1000da的超滤液进行二次酶切，得二次酶解液；

（6）重复一次步骤（3）和步骤（4），将得到的上清液经膜过滤组件内的超滤膜或纳滤膜超滤处理，超滤处理的温度为20℃，压力为0.25mpa，分子量小于1000da的超滤液被集液槽收集；

（7）将集液槽收集的分子量小于1000da的超滤液进行冷冻干燥，即得到贝类多肽产品。

实施例2的步骤（2）和步骤（5）中所用的混合酶的组成均为：木瓜蛋白酶39%、中性蛋白酶33%、胰蛋白酶28%。

实施例2中的贝类多肽得率为95%，同时能够有效提高制备的贝类多肽的转化率至88%，同时提高贝类多肽的抑制率至98%。

实施例3：利用实施例1的酶解-膜过滤循环装置制备贝类多肽的方法，包括以下步骤：

（1）原料预处理：将贝类肉绞成肉糜，并加肉糜质量4倍的水匀浆，得到以贝类肉糜作为底物的底物溶液，置于酶解-膜过滤循环装置的原料池中，并将第一恒温槽的温度控制在50℃的恒温；

（2）混合酶水解：将第二恒温槽的温度控制在50℃的恒温，向给料泵加压，将原料池中的底物溶液输送至酶解池中，再调节底物溶液的ph值至8，向酶解池内加入底物溶液质量3%的混合酶，用搅拌棒持续搅拌酶解2小时，得酶解液；

（3）灭酶：将第二恒温槽的温度升温至100℃，在100℃下持续灭酶处理15min，得到灭酶后的混合液体；

（4）离心过滤：将灭酶后的混合液体通过离心装置以5000r/min的转速离心处理20min，取上清液；

（5）膜过滤：将得到的上清液经过第一循环泵进入膜过滤组件，在膜过滤组件内，经超滤膜或纳滤膜超滤处理，超滤处理的温度为25℃，压力为0.25mpa，分子量小于1000da的超滤液被集液槽收集，分子量大于1000da的超滤液被截留并经过第二循环泵重新进入酶解池，将第二恒温槽的温度控制在50℃的恒温，调节酶解池内超滤液的ph值至8，在酶解池内再次加入混合酶，该混合酶的加入量为经过第二循环泵重新进入酶解池的超滤液质量的2%，在酶解池内，用搅拌棒持续搅拌酶解2小时，通过混合酶对分子量大于1000da的超滤液进行二次酶切，得二次酶解液；

（6）重复一次步骤（3）和步骤（4），将得到的上清液经膜过滤组件内的超滤膜或纳滤膜超滤处理，超滤处理的温度为30℃，压力为0.2mpa，分子量小于1000da的超滤液被集液槽收集；

（7）将集液槽收集的分子量小于1000da的超滤液进行冷冻干燥，即得到贝类多肽产品。

实施例3的步骤（2）和步骤（5）中所用的混合酶的组成均为：木瓜蛋白酶42%、中性蛋白酶32%、胰蛋白酶26%。

实施例3中的贝类多肽得率为93%，同时能够有效提高制备的贝类多肽的转化率至87%，同时提高贝类多肽的抑制率至96%。

实施例4：利用实施例1的酶解-膜过滤循环装置制备贝类多肽的方法，包括以下步骤：

（1）原料预处理：将贝类肉绞成肉糜，并加肉糜质量6倍的水匀浆，得到以贝类肉糜作为底物的底物溶液，置于酶解-膜过滤循环装置的原料池中，并将第一恒温槽的温度控制在60℃的恒温；

（2）混合酶水解：将第二恒温槽的温度控制在60℃的恒温，向给料泵加压，将原料池中的底物溶液输送至酶解池中，再调节底物溶液的ph值至9，向酶解池内加入底物溶液质量1%的混合酶，用搅拌棒持续搅拌酶解3小时，得酶解液；

（3）灭酶：将第二恒温槽的温度升温至100℃，在100℃下持续灭酶处理20min，得到灭酶后的混合液体；

（4）离心过滤：将灭酶后的混合液体通过离心装置以4500r/min的转速离心处理30min，取上清液；

（5）膜过滤：将得到的上清液经过第一循环泵进入膜过滤组件，在膜过滤组件内，经超滤膜或纳滤膜超滤处理，超滤处理的温度为20℃，压力为0.25mpa，分子量小于1000da的超滤液被集液槽收集，分子量大于1000da的超滤液被截留并经过第二循环泵重新进入酶解池，将第二恒温槽的温度控制在60℃的恒温，调节酶解池内超滤液的ph值至9，在酶解池内再次加入混合酶，该混合酶的加入量为经过第二循环泵重新进入酶解池的超滤液质量的1%，在酶解池内，用搅拌棒持续搅拌酶解3小时，通过混合酶对分子量大于1000da的超滤液进行二次酶切，得二次酶解液；

（6）重复一次步骤（3）和步骤（4），将得到的上清液经膜过滤组件内的超滤膜或纳滤膜超滤处理，超滤处理的温度为25℃，压力为0.25mpa，分子量小于1000da的超滤液被集液槽收集；

（7）将集液槽收集的分子量小于1000da的超滤液进行冷冻干燥，即得到贝类多肽产品。

实施例4的步骤（2）和步骤（5）中所用的混合酶的组成均为：木瓜蛋白酶44%、中性蛋白酶31%、胰蛋白酶25%。

实施例4中的贝类多肽得率为91%，同时能够有效提高制备的贝类多肽的转化率至86%，同时提高贝类多肽的抑制率至95%。