羊膜和羊水来源的内皮祖细胞获取方法及其纯化培养方法与流程

本发明属于生物工程
技术领域：
中细胞的分离和扩增技术，具体涉及一种羊膜和羊水来源的内皮祖细胞获取方法及其纯化培养方法。
背景技术：
：内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，epc)是一类能循环、增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞，在各种生理和病理因素刺激下分化为内皮细胞，参与受损内皮的修复和血管新生，因此在心血管疾病尤其是动脉粥样硬化病变发展过程中起着重要作用。1997年，asahara等证实epc存在于成人外周血，首次在血管新生领域引入了干细胞的概念。随后相继研究发现骨髓、脐血、脂肪组织中有epc的存在。传统的epc主要采集自骨髓和脐血，然而骨髓采取不便，而且受到个人身体状况的限制；脐带血不但接取不便而且容易污染，脐血量也受限，并且脐血来源epc需要hla配型，同时同种异体输入可能存在免疫排斥等副作用。由于epc来源有限，数量极其稀少，一方面增加了科研人员对内皮细胞研究的难度，另一方面，限制了内皮细胞在心血管系统疾病、各种组织损伤等疾病中的临床应用。羊膜是胎膜最内层薄膜，与覆盖在胎盘、脐带的羊膜层相连接，具有分泌羊水的功能。目前已有研究表明，羊膜中含有丰富的滋养细胞和大量不同的胶原，包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等成份，正是因为这些细胞和成份使羊膜不仅可阻止白细胞浸润，而且能产生一些生长因子到羊水中，如：碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、肝细胞生长因子(hgf)和转化生长因子-β(tgf-β)等，血管内皮细胞生长因子(vegf)，上皮细胞生长因子(egf)。这些因子能够促进上皮、间质以及内皮类细胞的增殖、移行和分化。此外，由于羊膜组织是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，其表面人类白细胞抗原dr低表达，不表达hla-a，b，c抗原，andinolfi等于1982年首次报道了报道人羊膜细胞无免疫原性的特点。此外，羊膜组织和羊水系产后废弃物，无伦理学问题；而且由于羊膜组织细胞来源充分，因此羊膜作为一种新型、可靠的供体材料具有广泛的应用前景。目前国内外研究人员已经从羊膜中分离出能够贴壁的细胞群，然而由于羊膜组织结构复杂，一方面消化方式繁琐容易引入污染源，而且操作工艺难以控制和重复，另一方面所获得的细胞种类复杂，细胞分化潜能和趋势多样化。虽然近年来有研究者能从羊膜中分离出纯度较高的单一细胞种类，但是主要是以间质类的间充质干细胞为主，迄今为止，还没有从羊膜和羊水中获得纯度较高的内皮祖细胞的案例。例如申请号为201280040374.5(公开日期为2015.03.25)的发明名称为《利用羊膜来源的贴壁细胞治疗辐射损伤》和申请号为201710437293.3(公开日期为2017.9.26)的发明名称为《羊膜来源的贴壁细胞》的发明专利申请，均公布了一种从羊膜获得具有贴壁性能的一个细胞组合物的方法，其细胞群包含了造血干细胞、体干细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、内皮细胞、成血管细胞、内皮祖细胞、周皮细胞、心肌细胞、肌细胞、成心肌细胞、成肌细胞、胚胎干细胞、或经处理类似于胚胎干细胞在内的多种膜干细胞组合物。一方面，此专利中提供了一种可以从羊膜中获得具有分化生成血管样的细胞和细胞群，但是其很难从复杂的细胞混合物中分离出纯度较高的内皮祖细胞；而且羊膜的消化过程步骤繁琐，需要多次使用其利用玻璃加工容器和循环水域管路自主构建的加工容器，并需多次羊膜碎片间歇搅拌和过滤，不但步骤繁琐，容易污染，而且操作过程难于控制，不容易形成稳定的标准作业程序sop，难以实现产业化。例如申请号为201811259326.0(公开日期为2019.02.12)的发明名称为《一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增》的发明专利公布了一个采用两步酶消化法从羊膜中分离间充质干细胞的方法，首先使用剪刀把羊膜剪成大小均一的组织块后，用胰蛋白酶0.05％和edta0.02％混合，摇床震荡消化去除羊膜上皮干细胞(37℃，145rpm/min)，共消化两次，每次15min，中间使用生理盐水清洗去除上皮细胞后再次加入胰蛋白酶和edta消化酶；然后再用胶原酶ⅰ0.1％和dnasei0.02％消化1.0h，分离获得羊膜间充质干细胞。其操作步骤繁琐，消化过程中需要多次加入多种混合消化酶，消化酶配置复杂，不但容易污染，而且成本较高，也不利于产业化制备，此外，通过此消化获得的细胞是以间充质为主的干细胞群。本发明的目的是提供一种从羊膜和羊水中收集数量较多，纯度较高的血管内皮祖细胞的方法。技术实现要素：本发明提供一种羊膜和羊水来源的内皮祖细胞分离方法、培养方法及制备的内皮祖细胞，能够从羊膜中获得纯度较高的内皮祖细胞，而且分离方法较为简便、操作过程易于控制，能够有效降低分离过程中受污染的可能性，从而实现羊膜、羊水来源的内皮祖细胞的产业化制备。本发明提供一种羊膜和羊水来源的内皮祖细胞，所述内皮祖细胞从人或哺乳动物围产物羊膜中获得。本发明还提供了一种羊膜来源的内皮祖细胞获取方法，包括以下步骤：预处理步骤，对从胎盘剥离的羊膜进行预处理；去除海绵层以及上皮细胞层步骤，采用机械分离方法去除预处理后的羊膜上的海绵层以及上皮细胞层，获得羊膜组织；第一消化步骤，将所述羊膜组织切割成预设大小，将切割后的羊膜组织与胶原酶溶液按体积比为1：(1～5)混合，置于37℃培养箱消化1.0h～8.0h，用生理盐水清洗消化后的羊膜组织；第二消化步骤，将所述第一消化步骤后的羊膜组织与胶原酶溶液按体积比为1：(1～2)混合，置于37℃培养箱消化1.0h～2.0h，将消化液与生理盐水混合后离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。在其中一个实施例中，所述胶原酶为i型胶原酶、ii型胶原酶、iii型胶原酶、iv型胶原酶中的任意一种；所述胶原酶溶液的浓度为0.05％～0.25％。在其中一个实施例中，在所述预处理步骤中，所述预处理包括含有青霉素、链霉素的生理盐水浸洗处理、去除绒毛膜处理以及去污处理。在其中一个实施例中，在所述去除海绵层以及上皮细胞层步骤之前，还包括以下步骤：将预处理后的羊膜切割成第二预设大小，将切割后的羊膜用含有青霉素、链霉素的生理盐水浸洗处理。在其中一个实施例中，在所述去除海绵层和上皮细胞层步骤之后，还包括以下步骤：将羊膜组织用含有青霉素、链霉素的生理盐水浸洗处理。在其中一个实施例中，所述获取方法还包括以下步骤：将收集的羊水和/或保存过羊膜的保存液与含有青霉素、链霉素的生理盐水按体积比1：(0.5～1.5)混合后离心，弃去上清液，将得到的细胞沉淀与生理盐水混合后离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。本发明还提供了一种羊水来源的内皮祖细胞获取方法，包括以下步骤：将收集的羊水和/或保存过羊膜的保存液与含有青霉素、链霉素的生理盐水按体积比1：(0.5～1.5)混合后离心，弃去上清液，将得到的细胞沉淀与生理盐水混合后离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。本发明还提供了一种内皮祖细胞，所述内皮祖细胞采用上述的方法获得。本发明还提供一种上述内皮祖细胞的纯化培养方法，所述内皮祖细胞的纯化培养方法，包括以下步骤：将所述内皮祖细胞接种于培养液中经过6.0～24.0h自然沉降、贴壁后，去除残存的间质类细胞获得内皮祖细胞悬液，经过二次贴壁获得内皮祖细胞原代种子细胞用于传代培养。上述羊膜和羊水来源的内皮祖细胞，生长能力旺盛，流式细胞周期显示细胞处于指数生长期，倍增能力和核型稳定，具有典型的血管成型能力，低密度脂蛋白摄取能力和凝集素结合能力。上述羊膜来源的内皮祖细胞获取方法，采用机械分离与酶消化结合的方法，首先利用钝性分离羊膜组织去除绒毛膜，并利用机械法刮除上皮细胞层，然后利用酶梯度分步消化，第一步消化去除羊膜组织中的残余的上皮细胞和容易消化的间质类细胞，进而利用第二步消化获得内皮祖细胞的种子细胞，采用了分步机械分离去除不同种类细胞以及利用消化处理方法筛选细胞种类相结合的技术方案，突破了现有技术中无法获得高纯度的内皮祖细胞的技术难题，克服了传统的分离方法中消化处理作用单一的技术缺陷，还将消化处理用于筛选细胞种类以实现获得高纯度内皮祖细胞的目的。消化方式简便易行，无需加入其他辅助消化酶，减少试剂成本，无需组织研磨过滤等步骤，减少了人为操作带来的污染，整个消化过程易于形成完整的标准作业程序，利于产业化操作。附图说明图1为本发明实施例1的内皮祖细胞克隆集落4x图；图2为本发明实施例1的内皮祖细胞克隆集落10x图；图3为本发明实施例1的内皮祖细胞克隆集落20x图；图4为本发明实施例1的内皮祖细胞流式细胞表型检测结果图；图5为本发明实施例1的内皮祖细胞的血管形成能力验证图；图6为本发明实施例1的内皮祖细胞的吞噬能力、结合能力鉴定结果图；图7为本发明实施例1的内皮祖细胞的连续扩增能力鉴定结果图；图8为本发明实施例1的内皮祖细胞的细胞核型鉴定结果图；图9为本发明实施例1的内皮祖细胞的细胞周期鉴定结果图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，但并不用于限定本发明。本发明提供了一种羊膜和羊水来源的内皮祖细胞，该内皮祖细胞从人或哺乳动物围产物羊膜中获得，该内皮祖细胞经过传代培养后具有极强的血管新生能力。进一步实验验证发现，羊膜和羊水来源的epc生长能力旺盛，细胞周期检测显示细胞处于指数生长期，细胞倍增能力和核型稳定，具有典型的血管成型能力和低密度脂蛋白摄取能力和凝集素结合能力。羊膜来源的干细胞滋养性更高，已有研究证明羊膜来源的干细胞和其他组织来源干细胞相比，不但表达高浓度的干细胞因子，而且还表达造血干细胞因子。羊膜组织是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，不仅为胎儿发育提供营养，也是一道阻隔母体与胎儿两个异体组织互不排斥的奇妙屏障，结构和发育的特殊性使得羊膜组织缺乏免疫原性，不存在异体免疫排斥，此外羊膜细胞不表达端粒酶，不具有致瘤性，因此羊膜来源的干细胞生物不但滋养性更高，而且生物安全性又保证。目前羊膜干细胞已经用在多项临床项目中，例如眼科疾病，子宫内膜疾病，此外，近年来羊膜及羊膜细胞在组织工程皮肤、血管构建、生物支架材料及生物缓释材料等方面的研究取得了长足进步。由此可见，羊膜细胞比其他组织细胞具有更高的科学研究价值和广阔的应用前景优势。本发明的羊膜羊水来源的内皮祖细胞经过传代培养后具有极强的血管新生能力。本发明提供的一实施方式的羊膜来源的内皮祖细胞获取方法，包括以下步骤：预处理步骤，对从胎盘剥离的羊膜进行预处理；去除海绵层步骤，采用机械分离方法去除预处理后的羊膜上的海绵层和上皮细胞层，获得羊膜组织；第一消化步骤，将羊膜组织切割成预设大小，将切割后的羊膜组织与胶原酶溶液按体积比为1：(1～5)混合，置于37℃培养箱消化1.0h～8.0h，用生理盐水清洗消化后的羊膜组织；第二消化步骤，将第一消化步骤后的羊膜组织与胶原酶溶液按体积比为1：(1～2)混合，置于37℃培养箱消化1.0h～2.0h，将消化液与生理盐水混合后离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。上述羊膜来源的内皮祖细胞获取方法，采用机械分离与酶消化结合的方法，首先利用钝性分离羊膜组织去除绒毛膜，并利用机械法刮除上皮细胞层，然后利用酶梯度分步消化，第一步消化去除羊膜组织中残余的上皮细胞和容易消化的间质类细胞，进而利用第二步消化获得内皮祖细胞的种子细胞，采用了分步机械分离去除不同种类细胞以及利用消化处理方法筛选细胞种类相结合的技术方案，突破了现有技术中的无法获得高纯度的内皮祖细胞的技术难题，克服了传统的分离方法中消化处理作用单一的技术缺陷，还将消化处理用于筛选细胞种类以实现获得高纯度内皮祖细胞的目的。消化方式简便易行，无需加入其他辅助消化酶，减少试剂成本，无需组织研磨过滤等步骤，减少了人为操作带来的污染，整个消化过程易于形成完整的标准作业程序，利于产业化操作。在现有的生物工程
技术领域：
中细胞的分离和扩增
技术领域：
中，还没有关于从羊膜和羊水中分离出高纯度epc的案例。一是由于羊膜结构复杂，细胞组成多样，羊膜由内向外由单层上皮层、基膜层、间质层3层构成，其中间质层又可分为致密层、纤维细胞层和海绵层。单层上皮细胞主要是分泌羊水及营养因子；羊膜基膜层含独特的细胞间质和大量不同的胶元，主要为i、iii、iv、v和vii型胶原和纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等成份；间质层较厚，目前已知间质层内含有多于几十种成分的贴壁细胞，包含神经干细胞，纤维细胞，间质细胞，造血细胞，成血管细胞等在内的多种祖细胞；二是由于羊膜组织取材不便，虽然很容易将羊膜在海绵层从绒毛膜层上钝性分离，但是不能完全将羊膜组织的上皮和间质层彻底分离，因此目前已有报道能够从羊膜中获取贴壁的细胞群，但是未能将其中成分纯化；三是从羊膜分离的细胞中以中间充质干细胞和多能基质细胞为主，造血干细胞和血管基质细胞很少，因此，迄今为止已有从羊膜中获取纯度较高的上皮细胞和间充质干细胞的报道，然而，未见羊膜中分离获得纯度较高内皮祖细胞的成功案例。传统的羊膜分离技术所获得的贴壁细胞群种类繁多，成分复杂，虽然能够从羊膜获得贴壁的细胞群，但是只有少部分成血管样细胞的存在，数量和比例很低。虽然近年有报道从羊膜中获得纯度较高的干细胞，但是都是以间质类的间充质干细胞为主。例如中国专利201811259326.0公开了一种人羊膜间充质干细胞的高效分离和扩增技术，从羊膜中分离间充质干细胞的方法，一方面由于消化过程中消化酶种类多样，不但配置繁琐容易带入污染源，而且增加了试剂成本；因为羊膜结构复杂，本发明的发明人通过借鉴此两步酶消化法重复羊膜组织的消化，验证所得细胞为间充质干细胞，试验表明此方法，不适合羊膜来源内皮祖细胞的获得。另一方面，胰蛋白酶消化能力极强，能够在短时间内将羊膜组织消化成细胞悬液，因此传统的羊膜分离技术所获得的贴壁细胞群种类繁多，成分复杂，虽然能够从羊膜获得贴壁的细胞群，但是只有少部分成血管样细胞的存在，反而上皮细胞和间质类细胞所占比例较高；此外，由于胰蛋白酶的蛋白溶解和消化能力过强容易对目的细胞膜蛋白造成不同程度的损伤，而且羊膜组织个体差异较大，因此消化时间难以控制形成稳定的sop，组织工程中利用的细胞种子消化方法已经很少使用胰蛋白酶。然而，本发明研究发现，由于胶原酶属于蛋白酶，能够特异性的识别蛋白序列并切割其中肽键，适用于结缔组织和组织块中上皮细胞，间质类干细胞和成血管类干细胞的分离，尤其胶原酶iv含有低胰酶活性，性能比较温和，在消化细胞的同时兼顾维护细胞膜蛋白完整性具有独特优势。本发明利用低浓度的胶原酶iv缓慢的将上皮层细胞和间质类细胞从羊膜组织中消化分离出来，由于血管基质细胞难以消化，因此通过控制消化时间最后收集到的贴壁细胞为纯度较高的成血管细胞。之后通过差速贴壁法去除容易贴壁的残余间质类细胞，获得纯度更高的内皮祖细胞的原代种子细胞。在本发明的羊膜来源内皮祖细胞获取方法中，首先利用钝性分离羊膜组织去除绒毛膜，并利用机械法刮除上皮层细胞，然后利用酶梯度分步消化，首先通过第一次消化充分地去除羊膜中残余的上皮层细胞和间质类细胞，再通过第二次消化获得血管基质的成血管类的干细胞群，突破和克服了现有的技术偏见。利用上述方法获取的细胞，epc数量多，纯度高，具有内皮样细胞特征，在培养5～7天时观察到明显epc克隆呈现，呈现鹅卵石样细胞形状，通过流式验证epc的细胞表型，具有epc典型的细胞表型，高表达内皮细胞特异性标志物cd31、cd29、cd44，cd73和cd105，阳性率高达90～99％％，不表达造血干标志，cd45阳性率低于1％，同时具有不表达人类白细胞抗原，免疫原性极低，hla-dr阳性率低于1％。通过epc的功能验证实验证明通过上述方法获得的epc细胞具有体外分化为血管样细胞的功能。细胞长期扩增培养结果证明，利用该方法获得的epc生长能力旺盛，流式细胞周期检测显示细胞处于指数生长期，细胞倍增能力和核型稳定，具有典型的血管成型能力，低密度脂蛋白吞噬能力和凝集素结合能力。本发明公开的羊膜来源内皮祖细胞获取方法和羊水来源内皮祖细胞获取方法，内皮祖细胞来源于羊水和/或羊膜，羊水、羊膜属于医疗废弃物，无伦理争议，而且其干细胞含量丰富，能够获取较多数量的干细胞，能够大大降低制备成本。可选地，羊膜、羊水可以是收集的人羊膜、羊水，也可以是其他哺乳动物的羊膜、羊水。可选地，羊膜羊水的采集方法为在孕妇分娩过程中收集羊水，并在分娩后获得胎盘和羊膜组织，将羊膜用手术剪刀从胎盘剥离后置于含有保存液的储存盒中，经家属签署知情同意后，于2℃～8℃保存条件下及时冷链运送回实验室；为避免出现污染，对羊膜羊水进行编号。作为一种可选实施方式，在所述预处理步骤中，所述预处理包括含有青霉素、链霉素的生理盐水浸洗处理、去除绒毛膜处理以及去污处理。具体操作方法可以是：将盛放羊膜的样品瓶表面用75％酒精擦拭后，放入ⅱ级生物安全柜中；小心打开样品瓶的瓶盖，用无菌大镊子将羊膜转移至装有100ml～200ml生理盐水(含有青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的塑料盆中，浸洗2～3min进行浸洗处理，然后用弯头镊子将羊膜与绒毛膜钝性分离以去除绒毛膜。用镊子将羊膜一端提起，用另一把镊子将羊膜中残余血溶液尽量捋出进行去污处理，然后将其转移到新的装有100ml～200ml生理盐水(含有青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的塑料盆中，浸洗2～3min，重复以上操作，直至生理盐水中无血污，约需2～3次。进一步可选地，为了提高获得的内皮祖细胞数量以及充分利用原料，向羊水和羊膜的保存液中加入等体积生理盐水(含有青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)，转移入50ml无菌离心管中，1200rpm～1800rpm，离心8min～12min，弃去上清。用生理盐水清洗细胞沉淀，混匀后再次离心，弃去上清，沉淀重悬于生理盐水中，4℃存放备用。作为一种可选实施方式，在去除海绵层和上皮细胞层步骤之前，还包括将预处理后的羊膜切割成第二预设大小，例如，第二预设大小可以是100cm2/块～200cm2/块，将切割后的羊膜用含有青霉素、链霉素的生理盐水浸洗处理。去除海绵层以及上皮细胞层步骤，包括依次去除海绵层和上皮细胞层的操作，具体可以是：取一块羊膜，弯头镊子的弯头部固定羊膜边缘，然后用另一把弯头镊的弯头部轻轻地将该端的海绵层和羊膜钝性分离。将去除海绵层的羊膜置于一次性塑料皿中，使用手术小镊子将羊膜上皮层朝上平铺，一手使用手术镊固定羊膜一端，另一端采用细胞刮刀由里向外，水平方向刮除上皮层，同一方向大概刮5～10次，通过机械刮除可以去除大部分上皮层细胞。进一步可选地，在去除海绵层以及上皮细胞层步骤的中间和去除海绵层以及上皮细胞层步骤之后，还包括将羊膜组织用含有青霉素、链霉素的生理盐水浸洗处理。具体操作步骤可以是：将羊膜平铺在一次性塑料皿上，用解剖刀将羊膜分块(200cm2/块)，然后将所有羊膜转移到120ml～150ml生理盐水(含有青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中浸洗1次；取其中一块羊膜，弯头镊子的弯头部固定羊膜边缘，然后用另一把弯头镊子的弯头部轻轻地将该端的海绵层和羊膜钝性分离，最后将所有去除海绵层的羊膜在生理盐水(含有青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中浸洗1次，获得羊膜组织，然后将所得羊膜的上皮层朝上平铺于塑料皿中，上皮层朝上向外暴露，用弯头镊固定羊膜一段，另一端用细胞刮刀水平方向由内而外轻轻刮除内膜表面的内皮细胞，共刮8次，刮取时，动作应轻柔均匀，刮刀与表面的角度约为60℃，每处刮除方向相同。用另一把镊子将羊膜转移到新的装有抗生素的塑料盆中，浸洗2～3次，同上操作。作为一种可选实施方式，第一消化步骤和第二消化步骤的具体操作方法可以是：将羊膜组织移至一次性塑料皿上铺展开，用镊子将羊膜的一端固定，再用解剖刀将去上皮羊膜切成预设大小，例如切割成2cm×2cm组织片。将切割后的羊膜组织碎片装入50ml离心管中，按切割后的羊膜组织与胶原酶溶液按体积比为1：(1～5)加入胶原酶溶液，置于37℃培养箱消化1.0h～8.0h，弃掉消化产物上清液(消化产物上清液中含有机械去除羊膜的海绵层及上皮层细胞步骤后残余的上皮细胞和间质类细胞)，用镊子将消化后的羊膜组织从消化酶粘液中转移到培养皿中，用生理盐水清洗两次，以尽量去除羊膜上附着的上皮细胞和间质类细胞。将消化后的羊膜组织放入新的50ml离心管中，按消化后的羊膜组织与胶原酶溶液按体积比为1：(1～2)加入胶原酶溶液，置于37℃培养箱消化1.0h～2.0h，向消化液中加入适量的生理盐水混合后，1100rpm/min～1500rpm，离心3min～7min，弃去消化产物上清液，获得内皮祖细胞单细胞悬液。可选地，向内皮祖细胞中加入适量生理盐水于4℃保存备用。作为一种可选实施方式，胶原酶为i型胶原酶、ii型胶原酶、iii型胶原酶、iv型胶原酶中的任意一种；胶原酶溶液的浓度为0.05％～0.25％。优选地，胶原酶为性能更为温和的iv型胶原酶。胶原酶溶液的浓度为0.05％～0.20％，例如，可以是0.05％、0.07％、0.09％、0.10％、0.11％、0.13％、0.15％、0.16％、0.19％、0.20％。进一步优选地，胶原酶溶液的浓度为0.1％。可选地，胶原酶以1640，dmem，mem，dmem/f12中的任意一种础培养基配制成浓度为0.05％～0.25％的胶原酶溶液。本发明中的梯度分步消化以两步消化为宜，其中，第一消化步骤以及第二消化步骤中胶原酶的加入体积、浓度以及消化时间对于处理效果具有重要的影响。在第一消化步骤中，若胶原酶的浓度过高、量过大或者消化时间过长，则将降低最终获得内皮祖细胞的数量；然而，若胶原酶的浓度过低、量过小或者消化时间过短，则将导致上皮和间质类细胞残存过多，影响获得的细胞纯度；相反，在第二消化步骤中，若胶原酶的浓度过高、量过大或者消化时间过长，则将导致细胞死亡率升高、细胞活性受限、降低获得的细胞纯度；若胶原酶的浓度过低、量过小或者消化时间过短，则将降低最终获得的内皮祖细胞的数量。本发明与现有的羊膜干细胞分离方法相比，使用温和的胶原酶iv分步消化法获得高纯度的内皮祖细胞，消化过程中只需使用一种消化酶，无需引入其他外源酶，简化了分离工艺，降低了外源物对细胞制剂质量产生影响的风险，而且操作简单，改变了现有的取材部位，无需组织及细胞过滤，此外，分离获得的细胞纯化方便，只需经过差速贴壁除去易贴壁的残余间质类干细胞，制备的干细胞数量更多，细胞活性佳，纯度高，增殖能力更强。作为一种可选实施方式，获取方法还包括以下步骤：将收集的羊水和/或保存过羊膜的保存液与含有青霉素、链霉素的生理盐水按体积比1：(0.5～1.5)混合后离心，弃去上清液，将得到的细胞沉淀与生理盐水混合后离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。获取的内皮祖细胞可以与羊膜来源的内皮祖细胞混合后加以培养利用。具体的操作方法可以是：向羊水和羊膜的保存液中加入等体积生理盐水(含有青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)，转移入50ml无菌离心管中，1200rpm～1800rpm，离心8min～12min，弃去上清。用生理盐水清洗细胞沉淀，混匀后再次离心，弃去上清，沉淀重悬于生理盐水中，4℃存放备用。将羊膜来源的内皮祖细胞悬液与羊水来源的内皮祖细胞悬液混合，加入等体积生理盐水制备混合溶液，将混合溶液分装到50ml离心管中，补加生理盐水至45ml，1800～2000rpm，离心10min。弃去上清液，将离心沉淀用生理盐水重悬后合成1管，1800～2000rpm，离心10min，弃去上清液备用。羊水便于与羊膜同时收集，且羊水中也还有可观的内皮祖细胞可供分离获取内皮祖细胞；此外，保存过羊膜的保存液中也会含有可观的内皮祖细胞。通过分离获取羊水或保存过羊膜的保存液中的内皮祖细胞，可以进一步提高获得的内皮祖细胞数量，提高原料的利用率，降低内皮祖细胞的制备成本。本发明还提供一种羊水来源的内皮祖细胞获取方法，包括以下步骤：将收集的羊水和/或保存过羊膜的保存液与含有青霉素、链霉素的生理盐水按体积比1：(0.5～1.5)混合后离心，弃去上清液，将得到的细胞沉淀与生理盐水混合后离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。羊水中也还有可观的内皮祖细胞可供分离获取内皮祖细胞；此外，保存过羊膜的保存液中也会含有可观的内皮祖细胞。通过分离获取羊水或保存过羊膜的保存液中的内皮祖细胞，可以进一步提高获得的内皮祖细胞数量，提高原料的利用率，降低内皮祖细胞的制备成本。该获取方法可以单独使用，当然也可以如上述描述，应用于羊膜来源的内皮祖细胞获取方法中。本发明的第二大方面还提供了一种内皮祖细胞，该内皮祖细胞采用上述的方法获得。本发明的第三大方面还提供了一种上述内皮祖细胞的纯化培养方法，包括以下步骤：将内皮祖细胞接种于培养液中经过6.0～24.0h自然沉降、贴壁后，去除残存的间质类细胞获得内皮祖细胞悬液，经过二次贴壁获得内皮祖细胞原代种子细胞用于传代培养。可选地，将所述内皮祖细胞与培养液混合制得细胞悬液，将所述细胞悬液进行一次接种培养，于体积分数5％co2、37℃条件的培养箱中培养6.0h～24.0h，优选为8.0h～18.0h，更优选为11.0h～15.0h；经过该段时间的自然沉降贴壁后，通过首次贴壁可去除贴壁较快的残余间质类干细胞，将一次接种培养后未贴壁细胞及细胞悬液进行二次接种培养，于体积分数5％co2、37℃条件的培养箱中培养24.0h～55.0h，经过该二次贴壁后进行全换液，获得纯度较高的内皮祖细胞，此后根据培养情况定时进行全换液或半换液，直至细胞融合度率至80％～90％。通过梯度分步消化方法获得的原代祖细胞进一步利用上述纯化培养方法进行差速贴壁培养，能够去除残存的间质类细胞，通过二次贴壁，获得纯度较高的内皮祖细胞种子细胞，培养过程中通过培养液的因子优化法，获得的内皮祖细胞具有典型的克隆生长状态，细胞呈鹅卵石或短梭形的典型内皮祖细胞形态。操作简单，易于重复，而且所得细胞培养要求低，体外扩增能力强，增殖时间短，克服了自体来源epc数量低下，体外扩增缓慢等困难。纯化培养步骤简便易行、经济、实用性强、对操作要求不高。可选地，在制备细胞悬液前，将待用的内皮祖细胞利用生理盐水进行清洗处理，具体操作方法可以是：向羊膜来源的内皮祖细胞悬液和/或羊水来源的内皮祖细胞悬液，加入等体积生理盐水制备混合溶液，将混合溶液分装到50ml离心管中，补加生理盐水至45ml，1800rpm～2000rpm，离心8min～12min。弃去上清液，将离心沉淀用生理盐水重悬后合成1管，1800rpm～2000rpm，离心8min～12min，弃去上清液备用。可选地，内皮祖细胞的纯化培养方法采用的培养液为imdm，α-mem，dmem，egm，cgm以及dmem/f12培养液中的任意一种。可选地，培养液中添加有血小板裂解物、内皮细胞生长因子、上表皮生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子中的任意一种。进一步可选地，培养液中内皮细胞生长因子的含量为8ng/ml～12ng/ml，优选为10ng/ml；上表皮生长因子的含量为8ng/ml～12ng/ml，优选为10ng/ml；碱性成纤维细胞生长因子的含量为8ng/ml～12ng/ml，优选为10ng/ml。培养液中血小板裂解液的含量为3‰～7‰(v/v)，优选为5‰(v/v)。进一步可选地，所述内皮祖细胞的纯化培养方法还包括以下步骤：将细胞融合度率至80％～90％时的贴壁细胞用胰蛋白酶消化后，进行传代培养。可选地，胰蛋白酶的浓度为0.05％-0.25％(w/v)；优选地，胰蛋白酶的浓度为0.1％(w/v)。具体操作方法可以是：将细胞融合度率至80％～90％时的贴壁细胞直接用0.1％胰蛋白酶消化2min传代，进行后续扩增培养。同时，取少量传代细胞进行流式细胞检测，核型检测，以分析细胞体外长期培养的干性维持能力和稳定性。本发明采用胶原酶iv梯度分步消化法去除羊膜中的上皮和间质类细胞，获得成血管类的干细胞群，在贴壁过程中利用差速贴壁去除残存的间质类细胞获得纯度较高的内皮祖细胞种子细胞。消化过程中使用单一的消化酶，简单易行，无需组织研磨和过滤等操作，操作步骤简单易行，容易形成完整sop，易于工业转化和产业化。实施例1实验前准备：1)ⅱ级生物安全柜紫外灭菌20min后，风机吹台面15min；2)穿戴必要的个人防护用品包括工作服、工作鞋、帽子、口罩、双层无菌手套和防护眼镜；3)所需无菌耗材、器械、试剂等就位，准备好冲洗皿。预处理步骤：1)孕妇分娩过程中收集羊水并在分娩后获得胎盘和羊膜组织，将羊膜组织用手术剪刀从胎盘剥离后置于含有保存液的储存盒中，经家属签署知情同意后，2～8摄氏度及时冷链运送回实验室；为避免出现污染，并对其进行编号。2)将人羊膜的样品瓶表面用75％酒精擦拭后，放入ⅱ级生物安全柜中；小心打开样品瓶的瓶盖，用无菌大镊子将人羊膜转移至装有150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的塑料盆中，浸洗2～3min，然后用弯头镊子将羊膜与绒毛膜钝性分离。3)用镊子将羊膜一端提起，用另一把镊子将羊膜中残余血溶液尽量捋出，然后将其转移到新的装有150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的塑料盆中，浸洗2～3min，重复以上操作，直至生理盐水中无血污(2～3次)。4)将羊水和羊膜的保存液加入等体积生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)，转移入50ml无菌离心管中，1500rpm，离心10min，弃上清。用生理盐水清洗细胞沉淀，混匀后再次离心，弃上清，沉淀重悬与生理盐水中，4℃存放，备用。去除海绵层以及上皮层细胞步骤：1)将羊膜平铺在一次性塑料皿上，用解剖刀将羊膜分块(200cm2/块)，然后将所有羊膜转移到120～150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中浸洗1次。2)取其中一块羊膜，弯头镊子的弯头部固定羊膜边缘，然后用另一把弯头镊的弯头部轻轻地将该端的海绵层和羊膜钝性分离，最后将所有去除海绵层的羊膜组织在生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中浸洗1次。3)将羊膜置于一次性塑料皿中，使用手术小镊子将羊膜上皮层朝上平铺，一手使用手术镊固定羊膜一端，另一端采用细胞刮刀由里向外，水平方向刮除上皮层。第一消化步骤：1)将羊膜组织移至一次性塑料皿上铺展开，用镊子将羊膜的一端固定，再用解剖刀将去上皮羊膜切成2×2cm组织片。2)将切割后的羊膜组织碎片装入50ml离心管中，按照体积比1:(1～5)加入0.1％胶原酶ⅳ，拧紧盖子；37℃培养箱消化羊膜组织1.0h～3.0h。3)消化结束后。用镊子将羊膜组织从消化酶粘液中转移到放入培养皿中，用生理盐水清洗两次；尽量去除羊膜上附着的上皮细胞、间质类细胞。第二消化步骤：将羊膜组织放入新的50ml离心管中，按照体积比1:(1～3)胶原酶加入0.1％胶原酶ⅳ，拧紧盖子；37℃培养箱继续消化羊膜组织0.5～2.0h。消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min，离心5min；弃上清及组织；每管加入10ml生理盐水制得细胞悬液备用。内皮祖细胞的收集：将羊膜消化获得的细胞悬液与羊水来源获得的细胞悬液混合，加入等体积生理盐水，将溶液分装到50ml离心管中，补加生理盐水至45ml，1800～2000rpm，离心10min。弃上清，将离心沉淀用生理盐水重悬后合1管，1800～2000rpm，离心10min，弃上清液收集到内皮祖细胞备用。内皮祖细胞的纯化培养：向装有内皮祖细胞的离心管中加入一定量的epc培养液，悬浮细胞，计数后，以1×104/cm2密度将细胞接种于无菌的培养瓶中，置于体积分数5％co2、37℃、饱和湿度条件的培养箱，并取样送检微生物。上述培养条件细胞培养12h后，把未贴壁的细胞以及细胞悬液重新接种新的培养板中，置于体积分数5％co2、37℃、饱和湿度条件的培养箱中培养48h，进行第一次全换液，去掉多余组织块和未贴壁细胞，添加新鲜培养液，隔天全量换液1次，待细胞融合度达90％时，用0.05％(w/v)胰酶(购自sigma)消化传代，得到羊膜内皮细胞。同时，取少量传代细胞进行流式细胞检测，核型检测，以分析细胞体外长期培养的干性维持能力和稳定性。其中，培养液为含5％(v/v)的血小板裂解物(购自ultragro)、10ng/ml的vegf、10ng/ml的egf和10ng/ml的bfgf(购自peprotech)的imdm培养基(购自gibco)，在其他实施例中，还可选用dmem/f12、α-mem、ecm和egm等其它细胞培养基)进行扩增培养。人羊膜内皮细胞鉴定一、人羊膜内皮细胞生长特点及形态学特点用显微镜观察实施例1内皮祖细胞的纯化培养中，第一次全换液诱导贴壁2天的人羊膜内皮细胞(对内皮祖细胞差速贴壁培养后的细胞进行扩增)，如图1和2所示，镜下可见有散在的铺路石形状贴壁细胞，全量换液后培养3-4天，可见单克隆细胞形成(图1)，待细胞培养至约细胞融合度达90％时(图2)，细胞呈典型的铺路石形状、增殖速度较快、形态相对均一，能用于细胞生物学特性鉴定。继续培养后细胞的形态如图3所示。由上述鉴定可知，本发明的纯化培养方法简单，通过简单的差速贴壁法，原代细胞消化，获得纯度较高的epc种子细胞，培养过程中通过培养基的因子优化法，获得的epc具有克隆生长状态，细胞呈鹅卵石或短梭形的典型epc形态。二、流式细胞术鉴定人羊膜内皮细胞表面标志取羊膜来源第3代人羊膜内皮细胞，用流式细胞术检测细胞表面标志物。具体方法为：消化收集细胞，计数后取1×106个，用pbs洗涤1次，1500rpm离心10min，弃上清，残留200ul，吹打混匀细胞，分两组分别加入fitc标记的cd31(cd45)和percp标记的cd105，pe标记的cd44(cd73)和apc标记的cd29(hla-dr)各10ul，抗体均购自bd，并设1管为空白对照，在4℃下避光反应30min，用pbs洗涤1次，1500rpm离心10min，弃上清，残留200ul，上机检测。人羊膜内皮细胞表面标志的流式细胞术检测结果见表1和图4，发现本发明内皮祖细胞获取方法从羊膜和羊水中获得的epc纯度高，流式细胞表型证实通过上述方法获得的epc细胞不但高表达干细胞的重要表型干细胞标志cd29，cd44、cd73和cd105外，还都高表达内皮祖细胞特异抗原cd31(血小板-内皮细胞粘附分子)，其阳性率高达90％以上，即此方法获得细胞具有较高的均一度，种类单一，epc纯度很高，同时此专利获得的epc均不表达或者低表达造血干细胞标志cd45和细胞免疫特性hla-dr(<5％),表明细胞免疫原性很低，不存在移植后的免疫排斥，适用于组织工程和再生医学应用的种子来源。表1人羊膜内皮祖细胞流式细胞术检测结果生物标志化合物检测结果(％)cd2999.48cd3194.64cd4497.45cd7399.02cd10599.54cd450.26hla-dr0.49三、人羊膜内皮细胞的应用本发明实施例1分离的人羊膜内皮细胞经体外扩增后可用于分化成血管。具体步骤如下，准备24孔板，冰浴条件下铺上一层基质胶matrigel，200μl/孔。放入37℃培养箱中孵育1h使之呈胶状固体。然后将实施例2中指数生长期的epc经过胰蛋白酶消化为单个细胞后接种到matrigel胶上，10万个/孔。过夜孵育后观察epc体外三维培养环境中的血管形成能力(图5，由图可见，当把epc接种到基质层胶体上时，epc能像其他内皮细胞一样迁移到胶体内部，并形成毛细血管样的结构。此外，为了验证通过此方法分离和培养获得的epc，我们对其体外血管生成能力进行验证。体外扩增培养至第三代epc细胞经过胰蛋白酶消化为单个细胞后接种到matrigel胶中自由分化，过夜孵育后观察epc体外三维培养环境中的血管形成能力，由图5可见，当把epc接种到matrigel胶体上时，epc能像其他内皮细胞一样迁移到胶体内部，并形成毛细血管样的结构，图5的羊膜来源epc的管腔结构进一步验证了此方法获得epc的成血管功能。可见，本发明的人羊膜内皮细胞可以用于建立体外血管形成以及体内受损血管修复，应用前景十分广阔。四、人羊膜内皮祖细胞功能鉴定本发明分离培养获得的羊膜内皮细胞还具有内皮细胞粘附、摄取乙酰化低密度脂蛋(ac－ldl)和结合荆豆植物凝集素(uea-ⅰ)的特点，验证实验如下：原代内皮祖细胞经体外培养到第三代后，取指数生长期贴壁细胞加入10mg/l乙酰化的低密度脂蛋白dil-ac-ldl4μg，置于培养箱孵育4h，pbs洗3次，20g/l多聚甲醛固定20min，pbs漂洗一遍，将10mg/l绿色荧光标记的fitc-uea-ⅰ4μg加入上述标本中，于37℃孵育1h，dapi染色后利用荧光显微镜下观察细胞情况，结果见图6。其中，白光下细胞分布如图6a(白光)，dapi染色显示细胞核见图6b(紫色，dapi)，染色为绿色表示羊膜内皮祖细胞与uea-ⅰ结合见图6c(绿光，fitc-uea-ⅰ)，染色为红色表示细胞摄取ac-ldl见图6d(红光，dii-ac-ldl)，上述图像合并后显色为图6e(合并)，由图可见羊膜内皮祖细胞不但能摄取低密度脂蛋白ac-ldl，并能与植物凝集素uea-ⅰ结合，双染色阳性细胞率达到95％以上，可见本发明获得细胞纯度较高。五、人羊膜来源epc的连续扩增培养为评估人羊膜内皮祖细胞的连续增殖能力核稳定性，将本发明实施例1分离获得培养的内皮祖细胞在全培养基egm中培养，连续扩增至第10代，发现细胞传代后卵圆形生长迅速，细胞增殖迅速，每2-4d可传代1次，传代比例可达1：5～6，传代后细胞形态稳定，细胞符合指数期生长。培养至10代后取贴壁细胞送样进行染色体g带分析和流式周期分析(北京京蒙高科干细胞技术有限公司细胞与分子临床检验所)，从而进行核型和细胞周期检测。如图8所示，g带分析显示细胞具有正常的核型(46xy)，这说明在连续扩增培养过程中，细胞保持了遗传的稳定性；如图9所示，细胞周期显示dna合成前期(g1期)、dna合成期(s期)与dna合成后期(g2期)的细胞比例分别为94.63％，0.63％和5.36％。说明细胞生长能力旺盛，大部分细胞物质代谢活跃，迅速合成rna和蛋白质，能够进行快速的有丝分裂。实施例2实验前准备：1)ⅱ级生物安全柜紫外灭菌20min后，风机吹台面15min；2)穿戴必要的个人防护用品包括工作服、工作鞋、帽子、口罩、双层无菌手套和防护眼镜；3)所需无菌耗材、器械、试剂等就位，准备好冲洗皿。预处理步骤：1)孕妇分娩过程中收集羊水并在分娩后获得胎盘和羊膜组织，将羊膜组织用手术剪刀从胎盘剥离后置于含有保存液的储存盒中，经家属签署知情同意后，2～8摄氏度及时运送回实验室；为避免出现污染，并对其进行编号。2)将人羊膜的样品瓶表面用75％酒精擦拭后，放入ⅱ级生物安全柜中；小心打开样品瓶的瓶盖，用无菌大镊子将人羊膜转移至装有150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的塑料盆中，浸洗2～3min，然后用弯头镊子将羊膜与绒毛膜钝性分离。3)用镊子将羊膜一端提起，用另一把镊子将羊膜中残余血溶液尽量捋出，然后将其转移到新的装有150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的塑料盆中，浸洗2～3min，重复以上操作，直至生理盐水中无血污(2～3次)。4)将羊水和羊膜的保存液加入等体积生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)，转移入50ml无菌离心管中，1500rpm，离心10min，弃上清。用生理盐水清洗细胞沉淀，混匀后再次离心，弃上清，沉淀重悬与生理盐水中，4℃存放，备用。去除海绵层及上皮细胞层步骤：1)将羊膜平铺在一次性塑料皿上，用解剖刀将羊膜分块(200cm2/块)，然后将所有羊膜转移到120～150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中浸洗1次。2)取其中一块羊膜，弯头镊子的弯头部固定羊膜边缘，然后用另一把弯头镊的弯头部轻轻地将该端的海绵层和羊膜钝性分离，最后将所有去除海绵层的羊膜组织在生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中浸洗1次。3)将羊膜置于一次性塑料皿中，使用手术小镊子将羊膜上皮层朝上平铺，一手使用手术镊固定羊膜一端，另一端采用细胞刮刀由里向外，水平方向刮除上皮层。第一消化步骤：1)将羊膜组织移至一次性塑料皿上铺展开，用镊子将羊膜的一端固定，再用解剖刀将去上皮羊膜切成2×2cm组织片。2)将切割后的羊膜组织碎片装入50ml离心管中，按照体积比1:1加入0.2％胶原酶ⅳ，拧紧盖子；37℃培养箱消化羊膜组织1.0h。3)消化结束后。用镊子将羊膜组织从消化酶粘液中转移到放入培养皿中，用生理盐水清洗两次；尽量去除羊膜上附着的上皮细胞、间质类细胞。第二消化步骤：将羊膜组织放入新的50ml离心管中，按照体积比1:1胶原酶加入0.2％胶原酶ⅳ，拧紧盖子；37℃培养箱继续消化羊膜组织0.5h。消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min，离心5min；弃上清及组织；每管加入10ml生理盐水制得细胞悬液备用。内皮祖细胞的收集：将羊膜消化获得的细胞悬液与羊水来源获得的细胞悬液混合，加入等体积生理盐水，将溶液分装到50ml离心管中，补加生理盐水至45ml，1800～2000rpm，离心10min。弃上清，将离心沉淀用生理盐水重悬后合1管，1800～2000rpm，离心10min，弃上清液收集到内皮祖细胞备用。内皮祖细胞的纯化培养：向装有内皮祖细胞的离心管中加入一定量的epc培养液，悬浮细胞，计数后，以5×104/cm2密度将细胞接种于无菌的培养瓶中，置于体积分数5％co2、37℃、饱和湿度条件的培养箱，并取样送检微生物。上述培养条件细胞培养6.0h后，把未贴壁的细胞以及细胞悬液重新接种新的培养板中，置于体积分数5％co2、37℃、饱和湿度条件的培养箱中培养45h，进行第一次全换液，去掉多余组织块和未贴壁细胞，添加新鲜培养液，隔天全量换液1次，待细胞融合度达90％时，用0.05％(w/v)胰酶(购自sigma)消化传代，得到羊膜内皮细胞。同时，取少量传代细胞进行流式细胞检测，核型检测，以分析细胞体外长期培养的干性维持能力和稳定性。实施例3实验前准备：1)ⅱ级生物安全柜紫外灭菌20min后，风机吹台面15min；2)穿戴必要的个人防护用品包括工作服、工作鞋、帽子、口罩、双层无菌手套和防护眼镜；3)所需无菌耗材、器械、试剂等就位，准备好冲洗皿。预处理步骤：1)孕妇分娩过程中收集羊水并在分娩后获得胎盘和羊膜组织，将羊膜组织用手术剪刀从胎盘剥离后置于含有保存液的储存盒中，经家属签署知情同意后，2～8摄氏度及时运送回实验室；为避免出现污染，并对其进行编号。2)将人羊膜的样品瓶表面用75％酒精擦拭后，放入ⅱ级生物安全柜中；小心打开样品瓶的瓶盖，用无菌大镊子将人羊膜转移至装有150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的塑料盆中，浸洗2～3min，然后用弯头镊子将羊膜与绒毛膜钝性分离。3)用镊子将羊膜一端提起，用另一把镊子将羊膜中残余血溶液尽量捋出，然后将其转移到新的装有150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的塑料盆中，浸洗2～3min，重复以上操作，直至生理盐水中无血污(2～3次)。4)将羊水和羊膜的保存液加入等体积生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)，转移入50ml无菌离心管中，1500rpm，离心10min，弃上清。用生理盐水清洗细胞沉淀，混匀后再次离心，弃上清，沉淀重悬与生理盐水中，4℃存放，备用。去除海绵层及上皮细胞层步骤：1)将羊膜平铺在一次性塑料皿上，用解剖刀将羊膜分块(200cm2/块)，然后将所有羊膜转移到120～150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中浸洗1次。2)取其中一块羊膜，弯头镊子的弯头部固定羊膜边缘，然后用另一把弯头镊的弯头部轻轻地将该端的海绵层和羊膜钝性分离，最后将所有去除海绵层的羊膜组织在生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中浸洗1次。3)将羊膜置于一次性塑料皿中，使用手术小镊子将羊膜上皮层朝上平铺，一手使用手术镊固定羊膜一端，另一端采用细胞刮刀由里向外，水平方向刮除上皮层。第一消化步骤：1)将羊膜组织移至一次性塑料皿上铺展开，用镊子将羊膜的一端固定，再用解剖刀将去上皮羊膜切成2×2cm组织片。2)将切割后的羊膜组织碎片装入50ml离心管中，按照体积比1:5加入0.2％胶原酶ⅳ，拧紧盖子；37℃培养箱消化羊膜组织3.0h。3)消化结束后。用镊子将羊膜组织从消化酶粘液中转移到放入培养皿中，用生理盐水清洗两次；尽量去除羊膜上附着的上皮细胞、间质类细胞。第二消化步骤：将羊膜组织放入新的50ml离心管中，按照体积比1:5胶原酶加入0.2％胶原酶ⅳ，拧紧盖子；37℃培养箱继续消化羊膜组织2.0h。消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min，离心5min；弃上清及组织；每管加入10ml生理盐水制得细胞悬液备用。内皮祖细胞的收集：将羊膜消化获得的细胞悬液与羊水来源获得的细胞悬液混合，加入等体积生理盐水，将溶液分装到50ml离心管中，补加生理盐水至45ml，1800～2000rpm，离心10min。弃上清，将离心沉淀用生理盐水重悬后合1管，1800～2000rpm，离心10min，弃上清液收集到内皮祖细胞备用。内皮祖细胞的纯化培养：向装有内皮祖细胞的离心管中加入一定量的epc培养液，悬浮细胞，计数后，以5×104/cm2密度将细胞接种于无菌的培养瓶中，置于体积分数5％co2、37℃、饱和湿度条件的培养箱，并取样送检微生物。上述培养条件细胞培养18h后，把未贴壁的细胞以及细胞悬液重新接种新的培养板中，置于体积分数5％co2、37℃、饱和湿度条件的培养箱中培养55h，进行第一次全换液，去掉多余组织块和未贴壁细胞，添加新鲜培养液，隔天全量换液1次，待细胞融合度达90％时，用0.05％(w/v)胰酶(购自sigma)消化传代，得到羊膜内皮细胞。同时，取少量传代细胞进行流式细胞检测，核型检测，以分析细胞体外长期培养的干性维持能力和稳定性。实施例4实验前准备：1)ⅱ级生物安全柜紫外灭菌20min后，风机吹台面15min；2)穿戴必要的个人防护用品包括工作服、工作鞋、帽子、口罩、双层无菌手套和防护眼镜；3)所需无菌耗材、器械、试剂等就位，准备好冲洗皿。预处理步骤：1)孕妇分娩过程中收集羊水并在分娩后获得胎盘和羊膜组织，将羊膜组织用手术剪刀从胎盘剥离后置于含有保存液的储存盒中，经家属签署知情同意后，2～8摄氏度及时运送回实验室；为避免出现污染，并对其进行编号。2)将人羊膜的样品瓶表面用75％酒精擦拭后，放入ⅱ级生物安全柜中；小心打开样品瓶的瓶盖，用无菌大镊子将人羊膜转移至装有150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的塑料盆中，浸洗2～3min，然后用弯头镊子将羊膜与绒毛膜钝性分离。3)用镊子将羊膜一端提起，用另一把镊子将羊膜中残余血溶液尽量捋出，然后将其转移到新的装有150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的塑料盆中，浸洗2～3min，重复以上操作，直至生理盐水中无血污(2～3次)。4)将羊水和羊膜的保存液加入等体积生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)，转移入50ml无菌离心管中，1500rpm，离心10min，弃上清。用生理盐水清洗细胞沉淀，混匀后再次离心，弃上清，沉淀重悬与生理盐水中，4℃存放，备用。去除海绵层及上皮细胞层步骤：1)将羊膜平铺在一次性塑料皿上，用解剖刀将羊膜分块(200cm2/块)，然后将所有羊膜转移到120～150ml生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中浸洗1次。2)取其中一块羊膜，弯头镊子的弯头部固定羊膜边缘，然后用另一把弯头镊的弯头部轻轻地将该端的海绵层和羊膜钝性分离，最后将所有去除海绵层的羊膜组织在生理盐水(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中浸洗1次。3)将羊膜置于一次性塑料皿中，使用手术小镊子将羊膜上皮层朝上平铺，一手使用手术镊固定羊膜一端，另一端采用细胞刮刀由里向外，水平方向刮除上皮层。第一消化步骤：1)将羊膜组织移至一次性塑料皿上铺展开，用镊子将羊膜的一端固定，再用解剖刀将去上皮羊膜切成2×2cm组织片。2)将切割后的羊膜组织碎片装入50ml离心管中，按照体积比1:2加入0.05％胶原酶ⅳ，拧紧盖子；37℃培养箱消化羊膜组织1.0。3)消化结束后。用镊子将羊膜组织从消化酶粘液中转移到放入培养皿中，用生理盐水清洗两次；尽量去除羊膜上附着的上皮细胞、间质类细胞。第二消化步骤：将羊膜组织放入新的50ml离心管中，按照体积比1:2胶原酶加入0.05％胶原酶ⅳ，拧紧盖子；37℃培养箱继续消化羊膜组织0.5h。消化结束后，加入适量生理盐水，1300rpm/min，离心5min；弃上清及组织；每管加入10ml生理盐水制得细胞悬液备用。内皮祖细胞的收集：将羊膜消化获得的细胞悬液与羊水来源获得的细胞悬液混合，加入等体积生理盐水，将溶液分装到50ml离心管中，补加生理盐水至45ml，1800～2000rpm，离心10min。弃上清，将离心沉淀用生理盐水重悬后合1管，1800～2000rpm，离心10min，弃上清液收集到内皮祖细胞备用。内皮祖细胞的纯化培养：向装有内皮祖细胞的离心管中加入一定量的epc培养液，悬浮细胞，计数后，以5×104/cm2密度将细胞接种于无菌的培养瓶中，置于体积分数5％co2、37℃、饱和湿度条件的培养箱，并取样送检微生物。上述培养条件细胞培养14h后，把未贴壁的细胞以及细胞悬液重新接种新的培养板中，置于体积分数5％co2、37℃、饱和湿度条件的培养箱中培养50h，进行第一次全换液，去掉多余组织块和未贴壁细胞，添加新鲜培养液，隔天全量换液1次，待细胞融合度达90％时，用0.05％(w/v)胰酶(购自sigma)消化传代，得到羊膜内皮细胞。同时，取少量传代细胞进行流式细胞检测，核型检测，以分析细胞体外长期培养的干性维持能力和稳定性。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12