本发明涉及一种鸭坦布苏病毒卵黄抗体的制备方法。
背景技术：
：鸭坦布苏病毒病，该病感染率高，死亡率低，主要以产蛋量急剧下降为主要特征，肉鸭，雏鸭主要症状为站立困难，步态不稳，给养禽业带来了巨大损失。鸭坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属，同种属病毒有登革热病毒，黄热病毒，西尼罗河病毒等危害人体健康的病毒，不排除鸭坦布苏病毒感染哺乳动物并引发疾病的可能性。因此目前该病已经成为严重影响养鸭场生产性能的重大疫病之一。卵黄抗体(igy)是母禽被外来抗原刺激后，母禽血液中免疫球蛋白转移至其卵黄中对子代产生保护性作用的免疫球蛋白，是在卵黄内所产生的特异性抗体，其浓度远高于血清，并具有高度稳定性和生物学活性，这使应用卵黄抗体防病治病成为可能。如cn102793923a公开了一种鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂，其含有抗鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体，按照下述步骤制备而成：1)蛋鸭开产前高免：对蛋鸭群开产前进行鸭坦布苏病毒病高强度免疫2)采集高免鸭蛋：采集经高免的蛋鸭群开产一个月内的初产蛋；3)清洁消毒：将采集的高免鸭蛋清洁后，用质量百分比浓度为0.5％的新洁尔灭溶液浸泡消毒20min，晾干；4)分离卵黄：在无菌条件下，打破蛋壳倒净蛋清，把蛋黄倒入消毒好的大烧杯内；5)蛋黄匀浆：在无菌条件下，将蛋黄置于消毒好的捣碎机内，加入一定比例的生理盐水进行匀浆，所述生理盐水为与所述卵黄等体积质量浓度为0.85％的氯化钠溶液；6)防腐抑菌：在无菌条件下，匀浆后的卵黄加入质量百分比浓度为0.01％的硫柳汞溶液或每毫升卵黄液加入青霉素、链霉素各一千单位进行防腐抑菌；7)封装保存：在无菌条件下，将所述步骤6)中经防腐抑菌的卵黄液摇匀后分装于消毒好的瓶中，冻结保存待用，保存温度为4-8℃或-20℃。其中卵黄抗体未经精制，如此类粗制抗体中含有大量的脂蛋白及卵磷脂等大分子物质，这些物质没有任何治疗作用且体积大，粘稠度高，注射困难且难以吸收，注射后对机体的应激大，易造成过敏反应，是外源性致热原。注射后易造成注射部位局部组织出血、肿胀、坏死，坏死的组织会导致机体发热，而发热会造成机体神经调节、体液调节等功能的紊乱，从而导致发病群体采食量减少，抵抗力下降，继发其他疾病。另外一方面，卵黄抗体中存在的不饱和脂肪酸和磷脂类十分容易氧化变质，从而使卵黄抗体的保存期大大缩短，需添加硫柳汞、青、链霉素等来延长其保质期，增加所谓的使用“安全性”，但结果往往是造成更大的应激和严重的药物残留。而且因此，建立一种可大量生产、产品纯度和活性高的提纯方法对卵黄抗体的广泛应用将具有重要意义。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种纯度、收率高，活性强、易于制备与应用且经济的鸭坦布苏病毒卵黄抗体的制备方法。为解决上述技术问题，本发明公开一种鸭坦布苏病毒卵黄抗体的制备方法，其包括以下步骤：(1)利用鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和系带后利用胶体磨进行破碎，得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:1～3的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为0.5～2％的柠檬酸及1～4％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，1～5℃放置3～6h，1～5℃离心；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。所述步骤(3)蛋黄液与纯化水以1:2的体积比混合；搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为0.8％的柠檬酸及2.5％的聚阴离子纤维素；低温放置温度为3℃，放置时间为5小时；低温离心条件为3℃11000r/min离心25分钟。所述步骤(2)蛋黄液的获得优选为：将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨5min，即得蛋黄液。本发明所公开的鸭坦布苏病毒卵黄抗体的制备方法，步骤简单，效率及得率高。聚阴离子纤维素(polyanioniccellulose，pac)是由天然纤维素经化学改性而制得的水溶性纤维素醚类衍生物，是一种重要的水溶性纤维素醚，主要原料是精制棉，本身无药理作用，于生理无害。本发明技术人员意外发现，其与柠檬酸组合可在高浓度液体中有效去除蛋黄中的其它成分，蛋黄液不需要加入过多的纯化水稀释，制得的卵黄抗体液无需浓缩即有较高的浓度，极大的简化了操作流程，灭活、萃取、除杂质、无需浓缩一步到位。此制备方法耗时短，操作全程都维持在较低的温度，良好的保留了所制备卵黄抗体的活力，且极低浓度柠檬酸、pac于生理无害，可应用于注射剂，无需额外除去残留即可使用。所得的卵黄抗体纯度高，活力好，并可在胃肠道中保持较好的活性，免疫方式除注射给药，也可与饲料混合口服给药，均可提供较好的免疫保护，经济适用。具体实施方式以下通过具体实施例再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。用于免疫的鸭坦布苏病毒灭活疫苗可采用市售或自行制备，自行制备可应用现有的常规方法，不影响发明效果的实现。以下实施例所用的免疫鸭坦布苏病毒灭活疫苗采用如下方式制备：(1)传代细胞系bhk-21细胞的制备：将bhk-21细胞用0.25％edta-胰酶消化分散传代，用含5～10％新生牛血清和适量双抗的dmem培养液在37℃、5％co2培养箱中培养；(2)种毒繁殖：用鸭坦布苏病毒毒种按终体积1:200接种到步骤1制备的bhk-21细胞中，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，在用含1～2％新生牛血清、适量双抗和2mm谷氨酰胺的dmem培养液于37℃、5％co2培养至58±2小时；(3)病毒收集、浓缩和纯化：bhk-21细胞出现80％细胞病变时，收获细胞毒液于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃离心10min后收集上清液，即病毒原液，对上清病毒液进行效价测定，其效价可高达107.0/0.1ml；将病毒原液通过50k的中空纤维柱超滤浓缩10倍，即为制苗病毒液；(4)病毒含量测定：将制苗病毒液用dmem培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层bhk-21细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞孔；每孔0.1ml，37℃吸附30min后，补加含1～2％新生牛血清、适量双抗和2mm谷氨酰胺的dmem培养液0.3ml于37℃、5％co2培养120小时，，观察细胞病变(cpe)，计算tcid50，每0.1ml病毒含量108.0tcid50以上，方可用于制备疫苗；(5)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活制苗病毒液，即为疫苗抗原；(6)疫苗成品的配制：①油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-804份，先将白油缓慢加温，加入4％的司班-80和2％的硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；②水相制备：取疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-804份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；③乳化：利用ika乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；④分装：将制备的疫苗按照每瓶250ml进行分装。实施例1制备方法：(1)利用鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1ml鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；(2)将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，水清洗干净，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带蛋黄，破碎得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:1的体积比混合，搅拌均匀后加入重量体积比为0.5％的柠檬酸及4％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，5℃放置6h，1℃10000r/min离心20min，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。实施例2制备方法：(1)利用鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1ml鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；(2)高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨5min，即得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:3的体积比混合，搅拌均匀后加入重量体积比为2％的柠檬酸及1％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，1℃放置6h，5℃11000r/min离心30min，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。实施例3制备方法：(1)利用鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1ml鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；(2)高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨5min，即得蛋黄液；；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为0.8％的柠檬酸及2.5％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，3℃放置3小时；3℃11000r/min离心25分钟，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。实施例4制备方法：(1)利用鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫100日龄的海兰褐鸡，获得高免鸡蛋，具体为：给100日龄的海兰褐鸡皮下注射1ml鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；(2)高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带，然后置于胶体磨中研磨5min，即得蛋黄液；；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度重量体积比为0.8％的柠檬酸及2.5％的聚阴离子纤维素，充分搅拌后，3℃，放置5小时；3℃11000r/min离心25分钟，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液用0.22μm滤膜过滤除菌后即得卵黄抗体液。对比例1样品通过除步骤(3)不加聚阴离子纤维素，其它操作同实施例4步骤所制备。对比例2样品通过除步骤(3)中不加柠檬酸，其它操作同实施例4步骤所制备。对比例3样品通过如下步骤制备：(1)清洁消毒：将高免鸡蛋清洁后，用质量百分比浓度为0.5％的新洁尔灭溶液浸泡消毒20min，晾干；(2)分离卵黄：在无菌条件下，打破蛋壳倒净蛋清，把蛋黄倒入消毒好的大烧杯内；(3)蛋黄匀浆：在无菌条件下，将蛋黄置于消毒好的捣碎机内，加入与所述卵黄等体积质量浓度为0.85％的氯化钠溶液进行匀浆即得，即用即制。本发明以上实施例所制备的鸭坦布苏病毒卵黄抗体的试验测试结果如下：1)以上实施例所制备的鸭坦布苏病毒卵黄抗体的质量控制：根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》其进行无菌检验、支原体检验、外源性病毒检测，结果显示实施例样品均未检出。2)以上实施例所制备的鸭坦布苏病毒卵黄抗体的纯度检测：采用sds-page分别检测实施例1-4、对比例1-3制得的卵黄抗体纯度，结果显示，实施例的纯度高于对比例。3)以上实施例所制备的鸭坦布苏病毒卵黄抗体的安全性试验：选用健康3日龄雏鸭将其分为8组，每组10只，分别肌肉注射和饲料拌食口服给药实施例1-4(肌肉注射1.5ml/只；口服给药6ml/只)，剩余一组作为空白对照组。结果显示，各组试验雏鸭的精神、食欲和饮欲均正常，注射部位皮肤和肌肉均无异常情况出现，在第10天进行解剖观察，内脏组织无明显的病变。表明本发明实施例1-4制备的卵黄抗体安全。4)以上实施例所制备的鸭坦布苏病毒卵黄抗体的效价检测：在细胞培养上进行病毒中和试验，先将鸭坦布苏病毒稀释成适当浓度，使每0.2ml含80个～100个pfu(空斑形成单位)，与不同稀释度的各实施例及对照例卵黄抗体等量混合，置37℃作用1.5h，分别测定pfu，使空斑减少50％卵黄抗体稀释度即为该卵黄抗体的中和效价。结果显示实施例样品中和效价高于对比例，具体见表1：表1组别实施例1实施例2实施例3实施例4对照例1对照例2对照例3中和效价1:5681:6121:6421:6881:4241:4441:4265)以上实施例所制备的鸭坦布苏病毒卵黄抗体的免疫保护试验：取3日龄雏鸭140只，分为14组，每组10只。各组同步进行强毒攻击，分别肌肉注射鸭坦布苏病毒病毒株0.5ml只(107tcid50/ml)，间隔1天，间隔日分别肌肉注射和饲料拌食口服给药实施例1-4及对照例1-3，对照组1注射生理盐水，对照组2空白。连续观察20天，统计各组卵黄抗体的保护率，结果显示实施例样品免疫保护效果优于对比例，具体见表2：表2当前第1页12