本发明属于生物领域，具体涉及一种区分鹿自然感染牛分枝杆菌和免疫卡介苗的检测方法及其基因检测特异性引物。
背景技术：
鹿结核病主要是由牛分枝杆菌(mycobacteriumbovis)引起的鹿的胸腔、肺脏、肠道等内脏器官形成结节性肉芽肿和坏死燥为特征的一种慢性、消耗性的人兽共患传染病。目前，由于对鹿结核病的防治没有特定有效的方法，给本病的传播有了可乘之机。它的传染和流行不仅严重影响了畜牧业的健康持续发展，而且还威胁着人类的身心健康。因此，鹿结核的流行对动物结核病的控制具有重要的生态学意义。牛分支杆菌早期分泌型蛋白esat-6是牛分支杆菌的主要免疫优势抗原，主要在牛分支杆菌感染早起分泌表达的一种抗原；卡介苗(bacilluscalmette-guérin，bcg)是可用于防治结核病的减毒活疫苗，动物机体接种卡介苗后会对皮内结核菌素反应的特异性产生严重干扰，出现检测结果假阳性的现象，因此用ppd皮试无法将疫苗接种与自然感染区分开来。
技术实现要素：
本发明针对目前鹿结核病常规检测方法中不能有效区分自然感染和卡介苗免疫引起的阳性检测结果，提供了一种鹿结核病病原牛分支杆菌esat-6、ag85b基因双重pcr检测的特异性性引物两对，以及提供一种区分临床检测自然感染和卡介苗免疫的鹿结核病病原牛分支杆菌的检测方法，达到快速检测和区别检测的目的。
首先，本发明提供利用双重pcr检测方法来检测牛分枝杆菌区分卡介苗免疫的方法，包括如下步骤：
(1)生物样本的前处理：生物样本中加入含有20mmol/ltris-hcl、1％tritonx-100作为处理液，混匀后离心，弃去上清，加入te缓冲液，重悬沉淀，得到样本液；
(2)双重pcr检测：提取步骤1所得样本液中的生物基因组dna；使用提取的生物基因组dna作为pcr扩增的dna模板，引物为牛分支杆菌基因检测特异性引物，进行pcr扩增；产物进行琼脂糖凝胶检测；
(3)结果判定：琼脂糖凝胶检测结果中如果出现了285bp和969bp两条带，结果判定为生物样本中含有生物个体自然感染的牛分支杆菌；如果只出现969bp一条带，结果判定为免疫卡介苗；或未检测到任何一条带，结果判定为生物样本中不含有生物个体自然感染的牛分支杆菌并且未免疫卡介苗。
步骤(1)所述的生物样本为液体样本。
步骤(1)所述的生物样本为鹿的鼻腔分泌物、血液或胸腔积液。所述血液为静脉血。
步骤(1)所述加入的处理液体积为生物样本体积的50％。
步骤(1)所述处理液中，tris含量为20mmol/l，用1m的hcl调节ph为8.3。
步骤(1)所述离心，离心转速为13000r/min，离心时间为5min。
步骤(1)所述te缓冲液中，包括10mmol/l的tris，1mmol/l的edta，用1m的hcl调节ph为8.0。
步骤(1)所述te缓冲液的加入体积与原生物样本体积相等。
步骤(2)所述提取生物基因组dna，具体为：在步骤(1)所得样本液中加入蛋白酶k，水浴消化后，加热保温，然后加入三氯甲烷，离心后取上清液作为dna模板。
步骤(2)所述加入蛋白酶k的终浓度为100μg/ml。所述水浴消化，温度为56℃，时间为30min。所述加热保温，温度为98℃，时间为10min。所述加入三氯甲烷，加入体积与原体系体积相等。所述离心，离心转速为13000r/min，离心时间为5min。
步骤(2)所述pcr扩增，牛分支杆菌基因检测特异性引物包括4种引物：
牛分支杆菌esat-6基因上游引物esat-6-f：5’gaatttcgcgggtatc3’，下游引物esat-6-r：5’gattcccaagcttcctatg3’；
牛分支杆菌ag85b基因上游引物ag85-f:5’gtgagccgaaagattcg3’，下游引物ag85-r：5’cagccgtcgactaacgaacgtc3’。
步骤(2)所述pcr扩增反应条件如下：在25μl反应体系中，分别加入10×pcr缓冲液2.5μl、dntp0.5μl(10mmol/l)、mgcl12.5μl(2.5mmol/l)、牛分支杆菌基因检测特异性引物4种各10pmol、taqdna聚合酶(fermentas公司)0.1μl(5u/μl)、dna模板1μl，用水补至25μl，于pcr仪上进行pcrdna扩增；pcr程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。
步骤(2)所述进行琼脂糖凝胶检测，琼脂糖浓度为1.2％。
步骤(3)所述结果判定，可以进一步地判定：琼脂糖凝胶检测结果中如果出现了285bp和969bp两条带，结果判定为生物样本中含有生物个体自然感染的牛分支杆菌；如果只出现969bp一条带，结果判定为免疫卡介苗；或未检测到任何一条带，结果判定为生物样本中不含有生物个体自然感染的牛分支杆菌并且未免疫卡介苗。
如果出现了285bp和969bp两条带，结果判定为生物样本中含有生物个体自然感染的牛分支杆菌；如果只出现969bp一条带，未见285bp条带，结果判定为生物样本所属的生物个体经卡介苗免疫；若未检测到285bp或969bp条带中的任何一条带，结果判定为生物样本所属的生物个体未自然感染牛分支杆菌的或免疫卡介苗。
第二，本发明还提供上述方法中使用的牛分枝杆菌基因检测特异性引物，包括4种引物：
牛分支杆菌esat-6基因上游引物esat-6-f：5’gaatttcgcgggtatc3’，下游引物esat-6-r：5’gattcccaagcttcctatg3’；
牛分支杆菌ag85b基因上游引物ag85-f:5’gtgagccgaaagattcg3’，下游引物ag85-r：5’cagccgtcgactaacgaacgtc3’。
所述牛分支杆菌esat-6基因，genbank:mg655585.1；所述牛分支杆菌ag85b基因genbank:ab716955.1。
所述生物样本为鹿的生物样本。生物样本类型有鼻腔分泌物、血液、胸腔积液。鼻腔分泌物采集方法如下，采用一次性鼻腔采集拭子，将采集头放置鼻腔采集部位，捏住采样拭子手柄，以同一方向转动2～3圈，完成后，将拭子放在样本保存瓶中搅拌3～5下，使样本完全释放与保存瓶中。血液样本的采集方法如下，将鹿保定好后，暴露出颈部静脉血管，用毛剪去除采血部位的被毛，消毒后，按照动物静脉采血操作，使用一次性采血针和真空采血管采集抗凝静脉血10ml左右。胸腔积液样本采集方法如下，将鹿保定好后，将采集部位祛毛消毒后，使用胸腔穿刺针采集5ml的胸腔积液样本，转移至无菌离心管中。样本采集后应立即进行前处理。
有益效果
本发明可以快速简便地检测生物样本中自然感染的牛分支杆菌，双重pcr检测方法可靠，准确性高，并且也能将自然感染和免疫卡介苗的生物样本区分开。
具体实施方式
本发明针对目前鹿结核病常规检测方法中不能有效区分自然感染和卡介苗免疫引起的ppd皮试阳性检测结果，提供了一种牛分支杆菌esat-6、ag85b基因双重pcr检测的特异性性引物两对，以及提供一种区分临床检测自然感染和卡介苗免疫的检测方法，达到快速检测和区别检测的目的。
为了说明本发明用于生物样本中自然感染的牛分支杆菌的检测的效果，下面结合实施例进行进一步说明。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造试剂盒等的厂商所建议的条件。
实施例1本发明提供的牛分枝杆菌基因检测特异性引物和双重pcr检测方法体外检测卡介苗的准确性
培养后的bcg标准株菌(活的无毒力牛型结核杆菌)悬浮于pbs(ph7.0)中，95℃灭活10min，12000r/min离心2min，弃上清，将沉淀稀释成100、1000、10000和100000个菌/ml，提取基因组dna模板。双重pcr方法扩增牛分支杆菌esat-6、ag85b基因。
pcr反应条件如下：在25μl反应体系中，分别加入10×pcr缓冲液2.5μl、dntp0.5μl(10mmol/l)、mgcl12.5μl(2.5mmol/l)、牛分支杆菌基因检测特异性引物4种各10pmol、taqdna聚合酶(fermentas公司)0.1μl(5u/μl)、dna模板1μl，用水补至25μl，于pcr仪上进行pcrdna扩增。
pcr程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。应结束后取产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果见表1。
表1双重pcr检测方法体外检测卡介苗结果
结果显示，本发明涉及到的特异性引物，对检测bcg的特异性强，结果准确。
实施例2ppd皮试阳性的鹿鼻腔分泌物和血液生物样本的双重pcr检测。
对采集的ppd皮试阳性的鼻腔分泌物和血液生物样本共计20份，按照本发明所述的前处理方法，进行检测：
(1)生物样本的前处理：生物样本中加入含有20mmol/ltris-hcl、1％tritonx-100作为处理液，混匀后离心，弃去上清，加入te缓冲液，重悬沉淀，得到样本液；
(2)双重pcr检测：提取步骤1所得样本液中的生物基因组dna；使用提取的生物基因组dna作为pcr扩增的dna模板，引物为牛分支杆菌基因检测特异性引物，进行pcr扩增；产物进行琼脂糖凝胶检测；
(3)结果判定：琼脂糖凝胶检测结果中如果出现了285bp和969bp两条带，结果判定为生物样本中含有生物个体自然感染的牛分支杆菌；如果只出现969bp一条带，或未检测到285bp或969bp条带中的任何一条带，结果判定为生物样本中不含有生物个体自然感染的牛分支杆菌。
步骤(1)所述的生物样本为液体样本。
步骤(1)所述的生物样本为鹿的鼻腔分泌物、血液或胸腔积液。所述血液为静脉血。
步骤(1)所述加入的处理液体积为生物样本体积的50％。
步骤(1)所述处理液中，tris含量为20mmol/l，用1m的hcl调节ph为8.3。
步骤(1)所述离心，离心转速为13000r/min，离心时间为5min。
步骤(1)所述te缓冲液中，包括10mmol/l的tris，1mmol/l的edta，用1m的hcl调节ph为8.0。
步骤(1)所述te缓冲液的加入体积与原生物样本体积相等。
步骤(2)所述提取生物基因组dna，具体为：在步骤(1)所得样本液中加入蛋白酶k，水浴硝化后，加热保温，然后加入三氯甲烷，离心后取上清液作为dna模板。
步骤(2)所述加入蛋白酶k的终浓度为100μg/ml。所述水浴消化，温度为56℃，时间为30min。所述加热保温，温度为98℃，时间为10min。所述加入三氯甲烷，加入体积与原体系体积相等。所述离心，离心转速为13000r/min，离心时间为5min。
步骤(2)所述pcr扩增，牛分支杆菌基因检测特异性引物包括4种引物：
牛分支杆菌esat-6基因上游引物esat-6-f：5’gaatttcgcgggtatc3’，下游引物esat-6-r：5’gattcccaagcttcctatg3’；
牛分支杆菌ag85b基因上游引物ag85-f:5’gtgagccgaaagattcg3’，下游引物ag85-r：5’cagccgtcgactaacgaacgtc3’。
步骤(2)所述pcr扩增反应条件如下：在25μl反应体系中，分别加入10×pcr缓冲液2.5μl、dntp0.5μl(10mmol/l)、mgcl12.5μl(2.5mmol/l)、牛分支杆菌基因检测特异性引物4种各10pmol、taqdna聚合酶(fermentas公司)0.1μl(5u/μl)、dna模板1μl，用水补至25μl，于pcr仪上进行pcrdna扩增；pcr程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。
步骤(2)所述进行琼脂糖凝胶检测，琼脂糖浓度为1.2％。
步骤(3)所述结果判定，可以进一步地判定：琼脂糖凝胶检测结果中如果出现了285bp和969bp两条带，结果判定为生物样本中含有生物个体自然感染的牛分支杆菌；如果只出现969bp一条带，未见285bp条带，结果判定为生物样本所属的生物个体经卡介苗免疫；若未检测到285bp或969bp条带中的任何一条带，结果判定为生物样本所属的生物个体未自然感染牛分支杆菌的或免疫卡介苗。
pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定结果及判定结果见表2。
表2ppd皮试阳性的鹿鼻拭子和血液生物样本双重pcr检测结果
通过对ppd皮试阳性的鹿鼻腔分泌物和血液生物样本，进行双重pcr检测，结果显示，在自然感染疑似病例的鼻腔分泌物和血液生物样本中均检测到了esat-6(285bp)和ag85b(969bp)目的基因，在bcg免疫的样本中只检测到了ag85b(969bp)目的基因，说明本方法的可靠性强，准确性高。
实施例3ppd皮试阳性疑似的鹿鼻腔分泌物、血液和胸腔穿刺液生物样本的双重pcr检测。
样本采集：采集ppd皮试阳性疑似鹿的鼻腔分泌物、血液和胸腔穿刺液生物样本。将鹿保定后，采用一次性鼻腔采集拭子在鼻腔采集部位，以同一方向转动2～3圈，然后将拭子放在样本保存瓶中搅拌3～5下。血液样本的采集，按照动物静脉采血操作，使用一次性采血针和真空采血管采集抗凝静脉血10ml左右。胸腔积液样本采集方法为将采集部位祛毛消毒后，使用胸腔穿刺针采集5ml的胸腔积液样本，转移至无菌离心管中。共计30份，按照本发明所述的前处理方法，进行检测：
(1)生物样本的前处理：生物样本中加入含有20mmol/ltris-hcl、1％tritonx-100作为处理液，混匀后离心，弃去上清，加入te缓冲液，重悬沉淀，得到样本液；
(2)双重pcr检测：提取步骤1所得样本液中的生物基因组dna；使用提取的生物基因组dna作为pcr扩增的dna模板，引物为牛分支杆菌基因检测特异性引物，进行pcr扩增；产物进行琼脂糖凝胶检测；
(3)结果判定：琼脂糖凝胶检测结果中如果出现了285bp和969bp两条带，结果判定为生物样本中含有生物个体自然感染的牛分支杆菌；如果只出现969bp一条带，或未检测到285bp或969bp条带中的任何一条带，结果判定为生物样本中不含有生物个体自然感染的牛分支杆菌。
步骤(1)所述的生物样本为液体样本。
步骤(1)所述的生物样本为鹿的鼻腔分泌物、血液或胸腔积液。所述血液为静脉血。
步骤(1)所述加入的处理液体积为生物样本体积的50％。
步骤(1)所述处理液中，tris含量为20mmol/l，用1m的hcl调节ph为8.3。
步骤(1)所述离心，离心转速为13000r/min，离心时间为5min。
步骤(1)所述te缓冲液中，包括10mmol/l的tris，1mmol/l的edta，用1m的hcl调节ph为8.0。
步骤(1)所述te缓冲液的加入体积与原生物样本体积相等。
步骤(2)所述提取生物基因组dna，具体为：在步骤(1)所得样本液中加入蛋白酶k，水浴硝化后，加热保温，然后加入三氯甲烷，离心后取上清液作为dna模板。
步骤(2)所述加入蛋白酶k的终浓度为100μg/ml。所述水浴消化，温度为56℃，时间为30min。所述加热保温，温度为98℃，时间为10min。所述加入三氯甲烷，加入体积与原体系体积相等。所述离心，离心转速为13000r/min，离心时间为5min。
步骤(2)所述pcr扩增，牛分支杆菌基因检测特异性引物包括4种引物：
牛分支杆菌esat-6基因上游引物esat-6-f：5’gaatttcgcgggtatc3’，下游引物esat-6-r：5’gattcccaagcttcctatg3’；
牛分支杆菌ag85b基因上游引物ag85-f:5’gtgagccgaaagattcg3’，下游引物ag85-r：5’cagccgtcgactaacgaacgtc3’。
步骤(2)所述pcr扩增反应条件如下：在25μl反应体系中，分别加入10×pcr缓冲液2.5μl、dntp0.5μl(10mmol/l)、mgcl12.5μl(2.5mmol/l)、牛分支杆菌基因检测特异性引物4种各10pmol、taqdna聚合酶(fermentas公司)0.1μl(5u/μl)、dna模板1μl，用水补至25μl，于pcr仪上进行pcrdna扩增；pcr程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。
步骤(2)所述进行琼脂糖凝胶检测，琼脂糖浓度为1.2％。
步骤(3)所述结果判定，可以进一步地判定：琼脂糖凝胶检测结果中如果出现了285bp和969bp两条带，结果判定为生物样本中含有生物个体自然感染的牛分支杆菌；如果只出现969bp一条带，未见285bp条带，结果判定为生物样本所属的生物个体经卡介苗免疫；若未检测到285bp或969bp条带中的任何一条带，结果判定为生物样本所属的生物个体未自然感染牛分支杆菌的或免疫卡介苗。
pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定结果及判定结果见表3。
表3ppd皮试疑似阳性的鹿鼻腔分泌物、血液和胸腔穿刺液生物样本双重pcr检测结果
通过对ppd皮试阳性的鹿鼻腔分泌物、血液和胸腔穿刺液生物样本，进行双重pcr检测，结果显示，s01、s03、s04、s05、s07、s08、s10和s11的鼻腔分泌物、血液和胸腔穿刺液生物样本中均检测到了esat-6(285bp)和ag85b(969bp)目的基因，结果判定为自然感染；在s02、s06和s09的样本中只检测到了ag85b(969bp)目的基因，结果判定为bcg免疫，阴性对照中未检测到目的基因，结果表明本发明中检测基因的特异性引物设计合理，双重pcr检测方法可行。对自然感染和bcg免疫的结果进行了有效的区分。
sequencelisting
<110>中国农业科学院特产研究所
<120>一种区分鹿自然感染牛分枝杆菌和免疫卡介苗的检测方法及其基因检测特异性引物
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