造血区室的增强的重建和自动重建的制作方法

本申请是申请日为2013年7月19日、申请号为201380048261.4、发明名称为“造血区室的增强的重建和自动重建”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2012年7月20日的美国临时申请no.61/674,224和提交于2013年3月14日的美国临时申请no.61/785,691的权益，所述临时申请均据此全文以引用方式并入。

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本公开整体涉及由造血干细胞实现的造血区室细胞形成、细胞存活和细胞增殖。具体地讲，本公开涉及使造血区室的重建加速，以及使造血区室的自动重建增强。

背景技术：

将造血干细胞用于骨髓移植已经根本改变了用于治疗众多血液恶性肿瘤(如，白血病)以及若干广泛存在的自体免疫疾病的方法，并且是免疫缺陷病变的关键治疗方法(buckley,rh,annurevimmunol22,625-655,2004(buckley,rh，《免疫学年评》，第22卷，第625-655页，2004年))。使用造血干细胞移植还成功地减轻了在若干情况下暴露于高强度辐射的影响(bishop,mr,stemcells15suppl2,305-310,1997(bishop,mr，《干细胞》，第15卷，增刊2，第305-310页，1997年))。此外，已使用造血干细胞移植以使高剂量的细胞毒性化疗剂能够施用至罹患多种实体器官肿瘤的患者，从而使骨髓能够在药物诱导的毒性之后重生(crivellari,getal.,oncologist12,79-89,2007(crivellari,g等人，《肿瘤学家》，第12卷，第79-89页，2007年))。使用造血干细胞移植来改善实体器官移植的植入率是该医疗过程的另一个最近应用(delis,setal.,pancreas32,1-8,2006(delis,s等人，《胰腺》，第32卷，第1-8页，2006年))。最近的研究还表明骨髓移植可能在心脏疾病的治疗中有价值(engelmann,mgetal.,curropinmolther8,396-414,2006(engelmann,mg等人，《分子治疗新见》，第8卷，第396-414页，2006年))。虽然该效应的原理不明，但这些发现提高了造血干细胞可被重编程以产生其他组织的可能性(kiel,mjetal.,devbiol283,29-39,2005(kiel,mj等人，《发育生物学》，第283卷，第29-39页，2005年))。因此，与有争议的胚胎干细胞疗法相比，成体造血干细胞可能具有广泛得多的实用性，并且可以提供胚胎干细胞疗法的替代疗法。造血干细胞移植的这些治疗应用证明了改善造血干细胞移植具有医疗和经济方面的效益。

有若干问题限制了造血干细胞(hsc)移植的治疗应用。例如，一个主要问题是可供移植用的hsc的数目偏少。罹患骨髓衰竭、自体免疫疾病、先天性免疫缺陷或血液恶性肿瘤的患者无法提供良好的hsc来源供自体移植之用(linker,c,bestpractresclinhaematol20,77-84,2007(linker,c，《临床血液学最佳实践与研究》，第20卷，第77-84页，2007年))。此外，一些骨髓衰竭患者和癌症患者需要多轮hsc移植，以实现放疗或化疗后hsc完全植入(oliansky,dmetal.,biolbloodmarrowtransplant13,1-25,2007(oliansky,dm等人，《血液与骨髓移植生物学》，第13卷，第1-25页，2007年))。在无法进行自体hsc移植的情况下，还存在需要鉴定具有适当的组织相容性的骨髓供体的问题。这通常使用已将超过600万名潜在供体登记在册的资料库实现(demello,anetal.,j.telemed.telecare12suppl3,64-6,2006(demello,an等人，《远程医疗与远程护理杂志》，第12卷，增刊3，第64-66页，2006年))。另外，一旦供体被选中，其必须忍受使hsc移动到血液中的折磨痛苦的过程，之后需经受4到5天的白细胞单采术以分离出稀有的长期hsc(nervi,betal.,jcellbiochem99,690-705,2006(nervi,b等人，《细胞生物化学杂志》，第99卷，第690-705页，2006年))。已存在多种旨在通过将hsc分离后进行离体扩展来解决可供移植用的hsc数目偏少的问题的新型方法，但仍不能够生成大量的在多年内保持可用性和生物活性的长期再生hsc(hoffman,r,curropinhematol6,184-91,1999(hoffman,r，《血液学新见》，第6卷，第184-191页，1999年))。

限制hsc移植的治疗应用的另一个问题是在清除移植受体的固有免疫系统清除后，移植的hsc要重建具有功能且成熟的造血谱系(lineage)(即，造血区室)所需要的时间。促进移植的hsc成功植入所需的要素之一是将固有免疫系统移除。按惯例，这通过全身的放射清除或化学清除来实现。该过程的最终结果是导致几乎完全无免疫应答的患者，该患者非常容易遭受人类在日常活动(诸如呼吸和进食)期间通常接触到的环境微生物的机会性感染。随着医源性传染原(它们中的很多对现有抗生素具有高度耐药性)的多样性和不均一性显著提高，该问题更值得关注。hsc移植后成熟造血谱系获得恢复所需的时间对移植受体发生机会性感染并最终死于该感染的风险有显著影响。

成熟造血谱系在hsc移植受体体内重生所需的时间受到若干变量的影响。一个这种变量是hsc移植后不同造血谱系重生所需的不同恢复时间。例如，由单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞构成的骨髓区室在hsc移植后通常需要4到8周才能恢复。人体中的淋巴区室需要明显更长的恢复时间。例如，t细胞、nk细胞和nkt细胞需要的恢复时间介于4到8个月之间，而大多数个体中的b细胞需要的恢复时间超过12个月。骨髓谱系细胞的恢复时间对于最低要求防御食源性微生物和环境微生物而言至关重要。对成熟造血谱系在hsc移植受体体内重生所需的时间造成影响的另一个变量是可用于移植的hsc的数目以及受体的体型/体重。还有一个变量是hsc移植患者在移植之前可能经受过的其他治疗的性质。在大多数罹患某种形式癌症的患者中，患者在接受hsc移植之前将已经接受过若干轮化疗。使用此类细胞毒性药物可能会对移植的hsc所回归并在其中开始分化过程的骨髓小生境(niche)造成影响。在所述小生境已被细胞毒性药物摧毁的一些情况下，可能需要若干hsc移植物来首先重建所述小生境并随后用多能hsc在小生境中播种。

此外，hsc移植后成熟造血谱系的恢复时间在很大程度上依赖于供体hsc找到其前往骨髓小生境的路径的能力。一旦hsc到达骨髓小生境，它们便需要与小生境固有的细胞建立分子交互作用。据认为，该交互作用对hsc内的细胞内在信号的性质和水平进行调节，所述细胞内在信号调节hsc的存活、增殖、自我更新和分化。因此，如果hsc不能找到其前往骨髓小生境的路径、不能恰当地回归小生境或者不能与小生境正确地建立这种分子交互作用，则可能导致hsc植入失败。另外，如果hsc不能找到其前往骨髓小生境的路径，还可能导致成熟造血谱系仅短期恢复或成熟造血谱系仅获得部分重建；由于长期骨髓衰竭，故所述短期恢复或部分重建将缓慢消退。

因此，在患者的固有免疫系统清除和通过hsc移植获得造血谱系重建之间的滞后时间是发生潜在致命性并发症(诸如机会性感染或hsc植入失败)的主要危险因素之一。已尝试了若干方法来缩短hsc移植后重建成熟造血谱系所需的时间。此类方法的例子包括使用更多的hsc来进行移植，进行部分固有免疫系统清除随后使用较少的hsc进行多次移植，预调理供体骨髓以保持其固有的t细胞，在hsc移植后对患者进行生长因子治疗，以及使用以影响e选择素表达的酶为靶标的单克隆抗体和/或小分子调节剂，以便改善hsc移植之后hsc回归骨髓小生境(adamsgbandscaddendt,genether15,96-99,2008(adamsgb和scaddendt，《基因治疗》，第15卷，第96-99页，2008年)；campbelltbandbroxmeyerhe,front.biosc.13,1795-1805,2008(campbelltb和broxmeyerhe，《生物科学前沿》，第13卷，第1795-1805页，2008年)；rochavandboxmeyerh,biologyofbonemarrowtransplantation16,s126-s132,2009(rochav和boxmeyerh，《骨髓移植生物学》，第16卷，第s126-s132页，2009年)；以及hogattj.etal.,blood113,5444-55,2009(hogattj.等人，《血液》，第113卷，第5444-5455页，2009年))。然而，这些解决方案仅对当前方法有适度改善，并不能显著影响病患群体中发生致命机会性感染的频率。

技术实现要素：

因此，需求用于加速造血干细胞(hsc)移植受体体内造血区室重建的改进方法，所述方法导致以下结果中的一者或多者：可供移植用的hsc的数目增加、有成效地回归骨髓小生境的hsc的数目增加、获得机会性感染的风险降低，以及hsc植入失败的风险降低。还需求用于增强需要造血区室自动重建的受试者体内的造血区室自动重建的改进方法。

为满足上述需求，本公开提供了通过在将hsc移植到受试者体内之前用myc组合物(诸如蛋白转导结构域-myc(ptd-myc)融合蛋白)、bcl-2组合物(诸如ptd-bcl-2融合蛋白)或这二者来处理hsc群体，来增强受试者体内的造血区室重建(如，hsc植入)的新型方法；以及通过施用包括myc组合物(诸如蛋白转导结构域-myc(ptd-myc)融合蛋白)、bcl-2组合物(诸如蛋白转导结构域-bcl-2(ptd-bcl-2)融合蛋白)或这二者的组合物来增强受试者体内造血区室细胞形成的新型方法。某些方面涉及通过与hsc移植相结合施用包括myc组合物(诸如蛋白转导结构域-myc(ptd-myc)融合蛋白)、bcl-2组合物(诸如蛋白转导结构域-bcl-2(ptd-bcl-2)融合蛋白)或这二者的组合物来加速造血干细胞(hsc)移植受体体内的造血区室重建的方法。有利的是，此类加速造血区室重建的新型方法可增加有成效地回归移植受体的骨髓小生境的hsc的数目，以及/或者可提高骨髓和淋巴区室的重建率，从而降低移植受体发生机会性感染的风险并降低hsc植入失败的风险。

另外，本公开至少部分地基于以下令人惊奇的发现：在hsc移植后施用包括含有myc多肽和蛋白转导结构域(ptd)(诸如hivtat蛋白转导结构域)的融合蛋白(tat-myc融合蛋白)的组合物加快了hsc移植受体体内成熟造血谱系的恢复时间。不希望受理论束缚，据信，向hsc移植受体施用myc组合物(诸如ptd-myc融合蛋白)增加受体的造血区室中的myc活性，导致回归受体体内骨髓小生境的hsc增多，以及在造成hsc回归的可能性增大的移植后hsc的存活率提高。hsc回归的增强提高可与骨髓小生境处的细胞基质成功地相互作用(即，回归具有成效)的移植hsc的数目，提高了在骨髓小生境处自我更新且生成相关祖细胞类型的移植hsc的数目，并且改善回归骨髓小生境的动力学，这导致造血区室重建加速。不希望受理论束缚，还据信，向hsc移植受体施用myc组合物(诸如ptd-myc融合蛋白)增加了移植hsc中的myc活性，从而增加了自我更新且生成用于重建具有功能且成熟的造血谱系(即，造血区室)的相关祖细胞类型和亚型的hsc的数目。此外，在进行移植前大致约10分钟至约24小时用myc组合物(诸如ptd-myc融合蛋白)处理待移植的hsc也加快了hsc移植受体体内成熟造血谱系的恢复时间。在一些实施例中，将myc组合物转导入或以其他方式引入hsc中所需的时间量足以实现hsc移植受体体内成熟造血谱系的恢复时间加快。

本公开的其他方面还涉及通过施用包括myc组合物(诸如蛋白转导结构域-myc(ptd-myc)融合蛋白)、bcl-2组合物(诸如蛋白转导结构域-bcl-2(ptd-bcl-2)融合蛋白)或这二者的组合物来增强需要造血区室自动重建的受试者体内的造血区室自动重建的新型方法，所述方法诱导内源性hsc在受试者体内自动重建造血区室。有利的是，此类增强造血区室自动重建的新型方法可保护患者的造血区室免受诸如化疗和放疗带来的损害，或有利于患者的造血区室从诸如化疗和放疗带来的损害中恢复。此类新型方法还可用于治疗骨髓衰竭综合征。不希望受理论束缚，据信，向需要造血区室自动重建的受试者施用myc组合物(诸如ptd-myc融合蛋白)、bcl-2组合物(诸如ptd-bcl-2融合蛋白)或这二者增强了内源性hsc中的myc活性、bcl-2活性或这二者，从而增加了自我更新且生成用于自动重建具有功能且成熟的造血谱系(即，造血区室)的相关祖细胞类型和亚型的hsc的数目。

此外，不希望受理论束缚，还据信，myc活性还增强了hsc向骨髓小生境的定位。

虽然refaeli等人声明原癌基因myc可破坏b细胞耐受性(refaelietal.procnatacadsci102(11):4097-4102,2005(refaeli等人，《美国国家科学院院刊》，第102卷，第11期，第4097-4102页，2005年))，但refaeli等人未提供与ptd-myc融合蛋白的使用或myc在增强hsc形成造血区室细胞的能力中所起的作用有关的指导。此外，虽然us2007/0116691、us2010/0297763、wo2007/047583、us2010/0047217和wo2010/011644公开了有条件地永生化的长期干细胞以及用于制备分化细胞的方法，但这些申请均未公开myc增强外源性添加的hsc在hsc移植受体体内重建造血区室的能力，或内源性hsc在受试者体内自动重建造血区室的能力。

与refaeli等人的us2007/0116691、us2010/0297763、wo2007/047583、us2010/0047217和wo2010/011644相对比，本发明人已令人惊讶地证实，在hsc移植受体体内施用myc组合物(诸如ptd-myc融合蛋白)24小时后，通过使成熟造血谱系恢复所需的时间缩短至少50％，而加速造血区室重建。本发明人还令人惊讶地证实，在造血区室减少的受试者体内施用myc组合物(诸如ptd-myc融合蛋白)增强了造血区室在受试者体内的自动重建。

因此，本公开涉及通过如下操作增强需要造血干细胞移植的受试者的造血区室重建的方法：用包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理造血干细胞群体短于约13天；随后向受试者施用治疗有效量的处理过的造血干细胞群体，以重建受试者的造血区室，其中造血区室重建与被施用了未经包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理的造血干细胞群体的受试者体内的造血区室重建相比得到增强。有利的是，也可以将本公开的包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物施用至接受了预处理过的造血干细胞的受试者，以便保持和/或进一步增强受试者体内的造血区室重建。

在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，将所述造血干细胞群体用包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理短于约12天、短于约11天、短于约10天、短于约9天、短于约8天、短于约7天、短于约6天、短于约5天、短于约4天、短于约2天或短于约1天。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，将所述造血干细胞群体用包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理短于约24小时、短于约23小时、短于约22小时、短于约21小时、短于约20小时、短于约19小时、短于约18小时、短于约17小时、短于约16小时、短于约15小时、短于约14小时、短于约13小时、短于约12小时、短于约11小时、短于约10小时、短于约9小时、短于约8小时、短于约7小时、短于约6小时、短于约5小时、短于约4小时、短于约3小时、短于约2小时或短于约1小时。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，将所述造血干细胞群体用包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理短于约60分钟、短于约55分钟、短于约50分钟、短于约45分钟、短于约40分钟、短于约35分钟、短于约30分钟、短于约29分钟、短于约28分钟、短于约27分钟、短于约26分钟、短于约25分钟、短于约24分钟、短于约23分钟、短于约22分钟、短于约21分钟、短于约20分钟、短于约19分钟、短于约18分钟、短于约17分钟、短于约16分钟、短于约15分钟、短于约14分钟、短于约13分钟、短于约12分钟、短于约11分钟或短于约10分钟。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，将所述造血干细胞群体用包括myc组合物的组合物进行处理。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，将所述造血干细胞群体用包括bcl-2组合物的组合物进行处理。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，将所述造血干细胞群体用包括myc组合物的组合物和包括bcl-2组合物的组合物进行处理。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，治疗有效量的包括myc组合物的组合物为至少0.5μ/ml、至少0.6μ/ml、至少0.7μ/ml、至少0.8μ/ml、至少0.9μ/ml、至少1μ/ml、至少2μ/ml、至少3μ/ml、至少4μ/ml、至少5μ/ml、至少6μ/ml、至少7μ/ml、至少8μ/ml、至少9μ/ml、至少10μ/ml、至少15μ/ml、至少20μ/ml、至少25μ/ml、至少30μ/ml、至少35μ/ml、至少40μ/ml、至少45μ/ml、至少50μ/ml、至少55μ/ml、至少60μ/ml、至少65μ/ml、至少70μ/ml、至少75μ/ml、至少80μ/ml、至少85μ/ml、至少90μ/ml、至少95μ/ml或至少100μ/ml。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，bcl-2组合物包含bcl-2多肽、其同系物、其类似物或其生物活性片段。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，bcl-2组合物包含蛋白转导结构域(ptd)。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，bcl-2组合物是ptd-bcl-2融合蛋白。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，bcl-2组合物是tat-bcl-2融合蛋白。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，包括bcl-2组合物的组合物的治疗有效量为至少0.5μ/ml、至少0.6μ/ml、至少0.7μ/ml、至少0.8μ/ml、至少0.9μ/ml、至少1μ/ml、至少2μ/ml、至少3μ/ml、至少4μ/ml、至少5μ/ml、至少6μ/ml、至少7μ/ml、至少8μ/ml、至少9μ/ml、至少10μ/ml、至少15μ/ml、至少20μ/ml、至少25μ/ml、至少30μ/ml、至少35μ/ml、至少40μ/ml、至少45μ/ml、至少50μ/ml、至少55μ/ml、至少60μ/ml、至少65μ/ml、至少70μ/ml、至少75μ/ml、至少80μ/ml、至少85μ/ml、至少90μ/ml、至少95μ/ml或至少100μ/ml。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，包括myc组合物的组合物还包含药学上可接受的载体。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，将所述造血干细胞群体在施用于有需要的受试者之前进行洗涤。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，在未对所述造血干细胞群体进行洗涤的情况下，将所述造血干细胞群体施用于有需要的受试者。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，所述受试者患有或曾患有血液恶性肿瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、惰性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、舒-戴二氏综合征、脑肿瘤、尤因氏肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、复发性生殖细胞肿瘤、血液病、血红蛋白病、自身免疫病、幼年特发性关节炎、系统性红斑狼疮、重症综合性免疫缺陷、干细胞缺陷导致的先天性嗜中性粒细胞减少、重型再生障碍性贫血、镰状细胞病、骨髓增生异常综合征、慢性肉芽肿性疾病、代谢紊乱、赫尔利综合征、戈谢病、骨硬化病、恶性婴儿骨硬化病、心脏疾病、hiv或aids。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者进行过器官移植。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，所述造血干细胞群体得自骨髓、得自外周血细胞、得自经历过单采血液成分术的外周血细胞、得自经历过白细胞单采术的外周血细胞、得自脐带血、得自羊水、得自经培养的hsc细胞、得自永生化的hsc细胞系或得自有条件地永生化的hsc细胞系。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，所述处理过的造血干细胞群体作为造血干细胞(hsc)移植程序中的步骤施用。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，hsc移植程序是清髓性hsc移植程序。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，hsc移植程序是非清髓性hsc移植程序。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，hsc移植是自体hsc移植或异源hsc移植。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用所述处理过的造血干细胞群体加速hsc移植后受试者体内的造血区室重建。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，与被施用了未经包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理的造血干细胞群体的受试者体内的造血区室重建相比，施用所述处理过的造血干细胞群体实现造血区室重建加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，与被施用了未经包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理的造血干细胞群体的受试者体内的t细胞重建相比，受试者体内的经加速造血区室重建使得t细胞区室重建加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，与被施用了未经包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理的造血干细胞群体的受试者体内的b细胞重建相比，受试者体内的经加速造血区室重建使得b细胞区室重建加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，与被施用了未经包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理的造血干细胞群体的受试者体内的nk细胞重建相比，受试者体内的经加速造血区室重建使得nk细胞区室重建加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，与被施用了未经包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理的造血干细胞群体的受试者体内的骨髓细胞区室重建相比，受试者体内的经加速造血区室重建使得骨髓细胞区室重建加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，与被施用了未经包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理的造血干细胞群体的受试者体内的嗜中性粒细胞恢复相比，受试者体内的经加速造血区室重建使得嗜中性粒细胞恢复加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，与被施用了未经包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理的造血干细胞群体的受试者相比，施用包括myc组合物的组合物使得hsc有成效地回归受试者体内的骨髓小生境增加50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，还包括施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者以及任选地至少一种细胞因子、生长因子、抗体、和/或小分子调节剂的第三组合物。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，第三组合物还包含药学上可接受的载体。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，所述造血干细胞群体是人造血干细胞群体。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，myc组合物包含myc多肽、其同系物、其类似物或其生物活性片段。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，myc化合物(myc-compound)包含蛋白转导结构域(ptd)。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，myc组合物是ptd-myc融合蛋白。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，myc组合物是tat-myc融合蛋白。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者是人类患者。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者是非人类的动物。

本公开的其他方面涉及一种通过以下操作增强受试者体内的造血区室细胞形成的方法：将治疗有效量的包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物施用于有需要的受试者，其中造血区室形成与未被施用所述组合物的受试者体内的造血区室形成相比得到增强。

在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，所述组合物包括myc组合物。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，所述组合物包括bcl-2组合物。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，所述组合物包括myc组合物和bcl-2组合物。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，bcl-2组合物包含bcl-2多肽、其同系物、其类似物或其生物活性片段。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，bcl-2组合物包含蛋白转导结构域(ptd)。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，bcl-2组合物是ptd-bcl-2融合蛋白。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，bcl-2组合物是tat-bcl-2融合蛋白。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，myc组合物包含myc多肽、其同系物、其类似物或其生物活性片段。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，myc化合物包含蛋白转导结构域(ptd)。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，myc组合物是ptd-myc融合蛋白。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，myc组合物是tat-myc融合蛋白。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者需要或曾需要造血干细胞(hsc)移植。在某些实施例中，所述受试者患有或曾患有血液恶性肿瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、惰性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、舒-戴二氏综合征、脑肿瘤、尤因氏肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、复发性生殖细胞肿瘤、血液病、血红蛋白病、自身免疫病、幼年特发性关节炎、系统性红斑狼疮、重症综合性免疫缺陷、干细胞缺陷导致的先天性嗜中性粒细胞减少、重型再生障碍性贫血、镰状细胞病、骨髓增生异常综合征、慢性肉芽肿性疾病、代谢紊乱、赫尔利综合征、戈谢病、骨硬化病、恶性婴儿骨硬化病、心脏疾病、hiv或aids。在某些实施例中，受试者进行过器官移植。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，所述方法还包括施用治疗有效量的包含hsc的第二组合物，以实现受试者体内的造血区室重建。在某些实施例中，在施用第二组合物之前、之后或之同时，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物。在某些实施例中，在施用第二组合物之前至少5天、至少4天、至少3天、至少2天或至少1天，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物。在某些实施例中，在施用第二组合物的同时，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物。在某些实施例中，在施用第二组合物之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周或至少3周，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物使得第二组合物中包含的hsc扩展。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，将包含hsc的第二组合物在施用第二组合物之前在存在myc组合物、bcl-2组合物或这二者的情况下培养。在某些实施例中，将第二组合物在存在myc组合物、bcl-2组合物或这二者的情况下培养使hsc有条件地永生化。在某些实施例中，hsc的永生化导致hsc扩展。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，所施用的第二组合物由于在存在myc组合物、bcl-2组合物或这二者的情况下进行培养而包含myc组合物、bcl-2组合物或这二者。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，hsc得自骨髓、得自外周血细胞、得自经历过单采血液成分术的外周血细胞、得自经历过白细胞单采术的外周血细胞、得自脐带血、得自羊水、得自经培养的hsc细胞、得自永生化的hsc细胞系或得自有条件地永生化的hsc细胞系。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，hsc存在于骨髓中、外周血细胞中、经历过单采血液成分术的外周血细胞中、经历过白细胞单采术的外周血细胞中、脐带血中或羊水中。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，第二组合物作为hsc移植程序中的步骤施用。在某些实施例中，hsc移植程序是清髓性hsc移植程序。在某些实施例中，hsc移植程序是非清髓性hsc移植程序。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，hsc移植是自体hsc移植或异源hsc移植。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物加速hsc移植后受试者体内的造血区室重建。在某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物实现造血区室重建与未被施用所述组合物的受试者体内的造血区室重建相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经加速造血区室重建使得t细胞区室重建与未被施用所述组合物的受试者体内的t细胞重建相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经加速造血区室重建使得b细胞区室重建与未被施用所述组合物的受试者体内的b细胞重建相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经加速造血区室重建使得nk细胞区室重建与未被施用所述组合物的受试者体内的nk细胞重建相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经加速造血区室重建使得骨髓细胞区室重建与未被施用所述组合物的受试者体内的骨髓细胞区室重建相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经加速造血区室重建使得嗜中性粒细胞恢复与未被施用所述组合物的受试者体内的嗜中性粒细胞恢复相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物使得hsc有成效地回归受试者体内的骨髓小生境增加50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，在施用了包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物时施用至受试者的第二组合物的治疗有效量较之在未施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物时所需要的该量为少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，还包括施用第三组合物，该第三组合物包含至少一种细胞因子、生长因子、抗体、和/或小分子调节剂。在某些实施例中，第三组合物还包含药学上可接受的载体。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，第二组合物中所包含的hsc是人类hsc。在某些实施例中，受试者需要或曾需要造血区室自动重建。在某些实施例中，myc组合物、bcl-2组合物或这二者诱导内源性造血干细胞(hsc)在受试者体内自动重建造血区室。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，造血区室自动重建与未被施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物的受试者体内的造血区室自动重建相比得到增强。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经增强造血区室自动重建使得t细胞区室自动重建增强、b细胞区室自动重建增强、nk细胞区室自动重建增强、骨髓细胞区室自动重建或嗜中性粒细胞恢复增强。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物使得内源性hsc扩展。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者正在经历或已经历了化疗。在某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于化疗造成的造血区室细胞减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于化疗造成的内源性hsc的量减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者正在经历或已经历了放疗。在某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于放疗造成的造血区室细胞减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于放疗造成的内源性hsc的量减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者患有骨髓衰竭综合征。在某些实施例中，骨髓衰竭综合征是再生障碍性贫血或海湾战争综合征。在某些实施例中，骨髓衰竭综合征是遗传性骨髓衰竭综合征(ibmfs)。在某些实施例中，ibmfs选自无巨核细胞性血小板减少症、戴-布二氏贫血、先天性角化不良、范可尼贫血、皮尔逊综合征、重型先天性嗜中性粒细胞减少症、舒-戴二氏综合征、血小板减少-桡骨缺失综合征、ivic综合征、wt综合征、桡尺骨骨性联接、共济失调，以及各类血细胞减少症。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于骨髓衰竭综合征造成的造血区室细胞减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于骨髓衰竭综合征造成的内源性hsc的量减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，包括myc组合物的组合物的治疗有效量为至少0.1mg/kg、至少0.2mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少0.5mg/kg、至少0.6mg/kg、至少0.7mg/kg、至少0.8mg/kg、至少0.9mg/kg、至少1mg/kg、至少2mg/kg、至少3mg/kg、至少4mg/kg、至少5mg/kg、至少6mg/kg、至少7mg/kg、至少8mg/kg、至少9mg/kg、至少10mg/kg、至少20mg/kg、至少30mg/kg、至少40mg/kg或至少50mg/kg受试者体重。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，包括bcl-2组合物的组合物的治疗有效量为至少0.1mg/kg、至少0.2mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少0.5mg/kg、至少0.6mg/kg、至少0.7mg/kg、至少0.8mg/kg、至少0.9mg/kg、至少1mg/kg、至少2mg/kg、至少3mg/kg、至少4mg/kg、至少5mg/kg、至少6mg/kg、至少7mg/kg、至少8mg/kg、至少9mg/kg、至少10mg/kg、至少20mg/kg、至少30mg/kg、至少40mg/kg或至少50mg/kg受试者体重。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物还包含药学上可接受的载体。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者是人类患者。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者是非人类的动物。

本公开的其他方面涉及通过以下操作加速造血干细胞(hsc)移植后受试者体内的造血区室重建的方法：a)施用治疗有效量的包含hsc的第一组合物，以实现有需要的受试者体内的造血区室重建；以及b)向受试者施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的第二组合物，其中与未被施用所述第二组合物的受试者体内的造血区室重建相比，施用所述第二组合物实现造血区室重建加速至少50％。

本公开的其他方面涉及一种通过以下操作增强受试者体内的造血区室自动重建的方法：向需要造血区室自动重建的受试者施用治疗有效量的包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物，其中myc组合物、bcl-2组合物或这二者诱导内源性造血干细胞(hsc)在受试者体内自动重建造血区室，并且其中造血区室自动重建与未被施用所述组合物的受试者体内的造血区室自动重建相比得到增强。

本公开的其他方面涉及一种通过以下操作治疗由于化疗造成的造血区室细胞减少的方法：向正在经历或已经历了化疗的受试者施用治疗有效量的包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物，其中myc组合物、bcl-2组合物或这二者诱导内源性造血干细胞(hsc)在受试者体内自动重建造血区室。

本公开的其他方面涉及一种通过以下操作治疗由于放疗造成的造血区室细胞减少的方法：给正在经历或已经历了放疗的受试者施用治疗有效量的包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物，其中myc组合物、bcl-2组合物或这二者诱导内源性造血干细胞(hsc)在受试者体内自动重建造血区室。

本公开的其他方面涉及一种通过以下操作治疗骨髓衰竭综合征的方法：向患有骨髓衰竭综合征的受试者施用治疗有效量的包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物，其中myc组合物、bcl-2组合物或这二者诱导内源性造血干细胞(hsc)在受试者体内自动重建造血区室。

本公开的其他方面涉及包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物在需要或曾需要造血区室细胞形成的受试者体内用于增强造血区室细胞形成的用途，其中与未接受所述组合物的患者体内的造血区室形成相比，所述组合物的用途增强造血区室形成。

在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者需要或曾需要造血干细胞(hsc)移植。在某些实施例中，所述受试者患有或曾患有血液恶性肿瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、惰性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、舒-戴二氏综合征、脑肿瘤、尤因氏肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、复发性生殖细胞肿瘤、血液病、血红蛋白病、自身免疫病、幼年特发性关节炎、系统性红斑狼疮、重症综合性免疫缺陷、干细胞缺陷导致的先天性嗜中性粒细胞减少、重型再生障碍性贫血、镰状细胞病、骨髓增生异常综合征、慢性肉芽肿性疾病、代谢紊乱、赫尔利综合征、戈谢病、骨硬化病、恶性婴儿骨硬化病、心脏疾病、hiv或aids。在某些实施例中，受试者进行过器官移植。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者正在经历或已经历了hsc移植。在某些实施例中，在hsc移植之前、之后或之同时，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物。在某些实施例中，在hsc移植之前至少5天、至少4天、至少3天、至少2天或至少1天，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物。在某些实施例中，在hsc移植的同时，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物。在某些实施例中，在hsc移植之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周或至少3周，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物使得移植的hsc扩展。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，在hsc移植之前，将移植的hsc在存在myc组合物、bcl-2组合物或这二者的情况下培养。在某些实施例中，将hsc在存在myc组合物、bcl-2组合物或这二者的情况下培养使hsc有条件地永生化。在某些实施例中，hsc的永生化导致hsc扩展。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，由于要在存在myc组合物、bcl-2组合物或这二者的情况下进行培养，所以移植的hsc包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，移植的hsc得自骨髓、得自外周血细胞、得自经历过单采血液成分术的外周血细胞、得自经历过白细胞单采术的外周血细胞、得自脐带血、得自羊水、得自经培养的hsc细胞、得自永生化的hsc细胞系或得自有条件地永生化的hsc细胞系。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，hsc移植程序是或者曾是清髓性hsc移植程序。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，hsc移植程序是或者曾是非清髓性hsc移植程序。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，hsc移植是或者曾是自体hsc移植。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，hsc移植是或者曾是异源hsc移植。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物加速hsc移植后受试者体内的造血区室重建。在某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物实现造血区室重建与未被施用所述组合物的受试者体内的造血区室重建相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经加速造血区室重建使得t细胞区室重建与未被施用所述组合物的受试者体内的t细胞重建相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经加速造血区室重建使得b细胞区室重建与未被施用所述组合物的受试者体内的b细胞重建相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经加速造血区室重建使得nk细胞区室重建与未被施用所述组合物的受试者体内的nk细胞重建相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经加速造血区室重建使得骨髓细胞区室重建与未被施用所述组合物的受试者体内的骨髓细胞区室重建相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经加速造血区室重建使得嗜中性粒细胞恢复与未被施用所述组合物的受试者体内的嗜中性粒细胞恢复相比加速至少50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物使得hsc有成效地回归受试者体内的骨髓小生境增加50％。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，还包括施用第二组合物，该第二组合物包含至少一种细胞因子、生长因子、抗体、和/或小分子调节剂。在某些实施例中，第三组合物还包含药学上可接受的载体。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，移植的hsc是人类hsc。在某些实施例中，受试者需要或曾需要造血区室自动重建。在某些实施例中，myc组合物、bcl-2组合物或这二者诱导内源性造血干细胞(hsc)在受试者体内自动重建造血区室。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，造血区室自动重建与未被施用包括myc组合物、组合物或这二者的组合物的受试者体内的造血区室自动重建相比得到增强。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者体内的经增强造血区室自动重建使得t细胞区室自动重建增强、b细胞区室自动重建增强、nk细胞区室自动重建增强、骨髓细胞区室自动重建或嗜中性粒细胞恢复增强。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物使得内源性hsc扩展。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者正在经历或已经历了化疗。在某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于化疗造成的造血区室细胞减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于化疗造成的内源性hsc的量减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者正在经历或已经历了放疗。在某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于放疗造成的造血区室细胞减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于放疗造成的内源性hsc的量减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者患有骨髓衰竭综合征。在某些实施例中，骨髓衰竭综合征是再生障碍性贫血或海湾战争综合征。在某些实施例中，骨髓衰竭综合征是遗传性骨髓衰竭综合征(ibmfs)。在某些实施例中，ibmfs选自无巨核细胞性血小板减少症、戴-布二氏贫血、先天性角化不良、范可尼贫血、皮尔逊综合征、重型先天性嗜中性粒细胞减少症、舒-戴二氏综合征、血小板减少-桡骨缺失综合征、ivic综合征、wt综合征、桡尺骨骨性联接、共济失调，以及各类血细胞减少症。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于骨髓衰竭综合征造成的造血区室细胞减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物防止由于骨髓衰竭综合征造成的内源性hsc的量减少。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，myc组合物是tat-myc。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，包括myc组合物的组合物的治疗有效量为至少0.1mg/kg、至少0.2mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少0.5mg/kg、至少0.6mg/kg、至少0.7mg/kg、至少0.8mg/kg、至少0.9mg/kg、至少1mg/kg、至少2mg/kg、至少3mg/kg、至少4mg/kg、至少5mg/kg、至少6mg/kg、至少7mg/kg、至少8mg/kg、至少9mg/kg、至少10mg/kg、至少20mg/kg、至少30mg/kg、至少40mg/kg或至少50mg/kg受试者体重。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，bcl-2组合物是tat-bcl-2。

在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，包括bcl-2组合物的组合物的治疗有效量为至少0.1mg/kg、至少0.2mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少0.5mg/kg、至少0.6mg/kg、至少0.7mg/kg、至少0.8mg/kg、至少0.9mg/kg、至少1mg/kg、至少2mg/kg、至少3mg/kg、至少4mg/kg、至少5mg/kg、至少6mg/kg、至少7mg/kg、至少8mg/kg、至少9mg/kg、至少10mg/kg、至少20mg/kg、至少30mg/kg、至少40mg/kg或至少50mg/kg受试者体重。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物还包含药学上可接受的载体。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，所述组合物包括myc组合物，受试者是人类患者。在可与前述实施例中任一项结合的某些实施例中，受试者是非人类的动物。

本公开的其他方面涉及包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物用于已接受了或将接受造血干细胞(hsc)移植的患者中以便加速造血区室重建的用途，其中与未接受所述组合物的受试者体内的造血区室重建相比，所述组合物的用途实现患者体内的造血区室重建加速至少50％。

本公开的其他方面涉及包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的组合物用于现在或过去造血区室细胞减少的患者中以便增强造血区室自动重建的用途，其中myc组合物、bcl-2组合物或这二者诱导内源性造血干细胞(hsc)在患者体内自动重建造血区室，并且其中与未接受所述组合物的患者体内的造血区室自动重建相比，所述组合物的用途增强造血区室自动重建。

附图说明

图1示出facs染色的结果，显示了在用扩展的骨髓细胞移植并用tat-myc处理后4周时小鼠中t细胞的发育情况。各小图示出tcrβ阳性pbmc的流式细胞术分析结果。图1a和图1b示出来自未接受过细胞移植或tat-myc处理的rag-1^-/-(图1a)和c57bl/6(图1b)对照小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图1c和图1d示出来自单独注射了5×10³个扩展的骨髓细胞的rag-1^-/-小鼠(图1c)，或在移植后24小时时还接受了10μgtat-myc注射的这种小鼠(图1d)的细胞的流式细胞术分析结果。

图2示出facs染色的结果，显示了在用扩展的骨髓细胞移植并用tat-myc处理后4周时小鼠中b细胞的发育情况。各小图示出b220阳性pbmc的流式细胞术分析结果。图2a和图2b示出来自未接受过细胞移植或tat-myc处理的rag-1^-/-(图2a)和c57bl/6(图2b)对照小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图2c和图2d示出来自单独注射了5×10³个扩展的骨髓细胞的rag-1^-/-小鼠(图2c)，或在移植后24小时时还接受了10μgtat-myc注射的这种小鼠(图2d)的细胞的流式细胞术分析结果。

图3示出facs染色的结果，显示了在用扩展的骨髓细胞移植并用tat-myc处理后8周时小鼠中t细胞的发育情况。各小图示出tcrβ阳性pbmc的流式细胞术分析结果。图3a和图3b示出来自未接受过细胞移植或tat-myc处理的rag-1^-/-(图3a)和c57bl/6(图3b)对照小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图3c和图3d示出来自单独注射了5×10³个扩展的骨髓细胞的rag-1^-/-小鼠(图3c)，或在移植后24小时时还接受了10μgtat-myc注射的这种小鼠(图3d)的细胞的流式细胞术分析结果。

图4示出facs染色的结果，显示了在用扩展的骨髓细胞移植并用tat-myc处理后8周时小鼠中b细胞的发育情况。各小图示出b220阳性pbmc的流式细胞术分析结果。图4a和图4b示出来自未接受过细胞移植或tat-myc处理的rag-1^-/-(图4a)和c57bl/6(图4b)对照小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图4c和图4d示出来自单独注射了5×10³个扩展的骨髓细胞的rag-1^-/-小鼠(图4c)，或在移植后24小时时还接受了10μgtat-myc注射的这种小鼠(图4d)的细胞的流式细胞术分析结果。

图5示出facs染色的结果，显示了在用刚分离的全骨髓细胞移植并用tat-myc处理后4周时小鼠中t细胞的发育情况。各小图示出分离出的pbmc针对cd8xcd4阳性细胞设门得到的流式细胞术分析结果。图5a和图5b示出来自未接受过细胞移植或tat-myc处理的rag-1^-/-(图5a)和c57bl/6(图5b)对照小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图5c和图5d示出来自单独注射了1×10⁶个全骨髓细胞的rag-1^-/-小鼠(图5c)，或在移植后24小时时还接受了10μgtat-myc注射的这种小鼠(图5d)的细胞的流式细胞术分析结果。

图6图解示出图5所示整个小鼠同龄组的t细胞百分比。图6a示出c57bl/6对照小鼠(未处理过的；第一列)、仅用10⁶个骨髓细胞处理的rag-1^-/-小鼠(中间列)以及用10⁶个骨髓细胞处理并且接着在24小时后用10μgtat-myc处理的rag-1^-/-小鼠(最后一列)中的cd4阳性t细胞％。图6b示出c57bl/6对照小鼠(未处理过的；第一列)、仅用10⁶个骨髓细胞处理的rag-1^-/-小鼠(中间列)以及用10⁶个骨髓细胞处理并且接着在24小时后用10μgtat-myc处理的rag-1^-/-小鼠(最后一列)中的cd8t细胞％。

图7示出facs染色的结果，显示了在用刚分离的全骨髓细胞移植并用tat-myc处理后4周时小鼠中b细胞的发育情况。各小图示出分离出的pbmc针对b220xcd19阳性细胞设门得到的流式细胞术分析结果。图7a和图7b示出来自未接受过细胞移植或tat-myc处理的rag-1^-/-(图7a)和c57bl/6(图7b)对照小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图7c和图7d示出来自单独注射了1×10⁶个全骨髓细胞(图7c)或者在移植后24小时时还接受了10μgtat-myc注射(图7d)的rag-1^-/-小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。

图8图解示出图7所示整个小鼠同龄组的b细胞百分比。该图示出c57bl/6对照小鼠(未处理过的；第一列)、仅用10⁶个骨髓细胞处理的rag-1^-/-小鼠(中间列)以及用10⁶个骨髓细胞处理并且接着在24小时后用10μgtat-myc处理的rag-1^-/-小鼠(最后一列)中的cd19xb220阳性b细胞％。

图9图解示出来自图5-图8中所示的rag-1^-/-小鼠同龄组的脾t细胞和b细胞的激活。图9a和图9b示出来自用10⁶个新鲜骨髓细胞移植但未用tat-myc处理过的rag-1^-/-小鼠的t细胞(图9a)和b细胞(图9b)的激活。图9c和图9d示出来自在用新鲜骨髓细胞移植后再用10μgtat-myc处理的rag-1^-/-小鼠的t细胞(图9c)和b细胞(图9d)的激活。

图10示出facs染色的结果，显示了在用5fu进行非致死剂量的攻毒处理并且接着用tat-myc处理后2周时小鼠中t细胞的重建情况。各小图示出分离出的pbmc针对cd8xcd4阳性细胞设门得到的流式细胞术分析结果。图10a示出来自未接受tat-myc处理的c57bl/6对照小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图10b示出来自用10μgtat-cre处理的c57bl/6小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图10c示出来自用5fu进行攻毒处理后24小时时用10μgtat-myc处理的c57bl/6小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。

图11图解示出图10所示的用5fu攻毒处理过的小鼠的整个同龄组中重建的cd4t细胞的百分比。该图示出c57bl/6对照小鼠(未处理过的；第一列)、用10μgtat-myc处理的c57bl/6小鼠(中间列)以及用10μgtat-cre处理的c57bl/6小鼠(最后一列)中的cd4阳性t细胞％。

图12图解示出图10所示的用5fu攻毒处理过的小鼠的整个同龄组中重建的cd8t细胞的百分比。该图示出c57bl/6对照小鼠(未处理过的；第一列)、用10μgtat-myc处理的c57bl/6小鼠(中间列)以及用10μgtat-cre处理的c57bl/6小鼠(最后一列)中的cd8阳性t细胞％。

图13示出facs染色的结果，显示了在进行亚致死剂量辐照接着用刚分离的全骨髓细胞移植并用tat-myc处理后4周时小鼠中t细胞的重建情况。各小图示出分离出的pbmc针对cd4xtcrβ阳性细胞设门得到的流式细胞术分析结果。图13a和图13b示出来自未接受过细胞移植或tat-myc处理的rag-1^-/-(图13a)和c57bl/6(图13b)对照小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图13c、图13d和图13e示出来自单独注射了1×10⁶个全骨髓细胞(图13c)或者在移植后24小时时还接受了10μgtat-myc静脉注射(图13d)或肌内注射(图13e)的rag-1^-/-小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。

图14图解示出图13所示的用5fu攻毒处理过的小鼠的整个同龄组中重建的cd4t细胞的百分比。该图示出rag-1^-/-对照小鼠(未处理过的；第一列)、用10μgtat-myc静脉注射处理的rag-1^-/-小鼠(中间列)以及用10μgtat-cre肌内注射处理的rag-1^-/-小鼠(最后一列)中的cd4阳性t细胞％。

图15示出facs染色的结果，显示了在进行亚致死剂量辐照接着用刚分离的全骨髓细胞移植并用tat-myc处理后4周时小鼠中b细胞的重建情况。各小图示出分离出的pbmc针对igmxcd19阳性细胞设门得到的流式细胞术分析结果。图15a和图15b示出来自未接受过细胞移植或tat-myc处理的rag-1^-/-(图15a)和c57bl/6(图15b)对照小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图15c、图15d和图15e示出来自单独注射了1×10⁶个全骨髓细胞(图15c)或者在移植后24小时时还接受了10μgtat-myc静脉注射(图15d)或肌内注射(图15e)的rag-1^-/-小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。

图16图解示出接受了hsc移植然后用tat-myc或tat-cre处理的经亚致死剂量辐照的小鼠的整个同龄组中或图15所示的移植后24小时时的对照小鼠中重建的b细胞的百分比。该图示出rag-1^-/-对照小鼠(未处理过的；第一列)、用10μgtat-myc静脉注射处理的rag-1^-/-小鼠(中间列)以及用10μgtat-cre肌内注射处理的rag-1^-/-小鼠(最后一列)中的cd19xb220阳性b细胞％。

图17示出源自人脐带血的蛋白质转导的长效(ptlt)-hsc的体内功能分析。图17a示出facs分析的结果，显示了接受了在细胞因子混合物中体外扩展的10⁶个脐血细胞(第一张小图；fcb)，或者在补充有tat-myc和tat-bcl-2的细胞因子混合物中体外扩展的10⁶个脐血细胞(第二张小图；fcbtmtb)，或者5×10⁶个新鲜的、未经操纵过的脐血细胞(第三张小图；新鲜fcb)的移植的经亚致死剂量辐照的nsg小鼠的同龄组中骨髓细胞的重建情况。图17b示出来自用图17a的第二小张图所示的ptlt-hsc重建的异种嵌合小鼠的骨髓细胞、脾细胞和胸腺细胞的facs分析结果。将所有细胞针对人cd45进行染色。对cd45+细胞设门显示出骨髓中的人cd34+cd38lo细胞(第一张小图；bm)；脾中的人cd19+和人cd3+淋巴细胞(第二张小图；脾)；以及胸腺中的人cd3+细胞(第三张小图；胸腺)。图17c示出在图17a的第二张小图所示的nsg小鼠中发育的人脾b细胞的facs分析结果。脾b细胞用cfse标记并且在存在抗人cd40和igm的单克隆抗体的情况下培养。来自该小鼠的人b细胞在其抗原受体的刺激后经历增殖。图17d示出来自接种于甲基纤维素上之后的人cd34+cd38^lo细胞的髓红样细胞集落(类红细胞爆发集落形成单位(bfu-e)、巨核细胞集落形成单位(cfu-m)、粒细胞集落形成单位(cfu-g)和粒细胞-单核细胞集落形成单位(cfu-gm))的定量分析的图示。人cd34+cd38^lo细胞是从图17a的第二张小图所示并且在图17b的第一张小图中进一步分析的nsg异种嵌合小鼠的骨髓中获得的。图17e示出对重新接种于甲基纤维素上之后的髓红样细胞集落的发育情况的定量分析的图示。图17f示出对来自图17a的第二张小图所示的nsg小鼠的cd45阳性骨髓细胞群体中骨髓细胞和淋巴细胞分化(cd11b、cd33、cd3和cd19表达)的定量分析的图示。图17g示出对来自图17a的第二张小图所示的nsg小鼠的cd45阳性脾细胞群体中骨髓细胞和淋巴细胞分化(cd11b、cd33、cd3和cd19表达)的定量分析的图示。

图18示出facs染色的结果，显示了在经过亚致死剂量辐照然后用新鲜的胎儿脐血细胞移植并用tat-myc或tat-cre对照蛋白处理后8周时nsg小鼠中外周血的重建情况。各小图示出分离出的pbmc针对人cd45阳性细胞设门得到的流式细胞术分析结果。图18a-图18c示出来自接受了5×10⁵个(图18a)、1×10⁶个(图18b)或5×10⁶个(图18c)刚分离的胎儿脐血细胞并在24小时后注射10tat-cre的nsg小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图18d-图18f示出来自接受了5×10⁵个(图18d)、1×10⁶个(图18e)或5×10⁶个(图18f)刚分离的胎儿脐血细胞并在24小时后注射10μgtat-myc的nsg小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。

图19示出facs染色的结果，显示了在经过亚致死剂量辐照然后用新鲜的胎儿脐血细胞移植并用tat-myc或tat-cre对照蛋白处理后8周时nsg小鼠中骨髓的重建情况。各小图示出分离出的骨髓针对人cd45阳性细胞设门得到的流式细胞术分析结果。图19a-图19c示出来自接受了5×10⁵个(图19a)、1×10⁶个(图19b)或5×10⁶个(图19c)刚分离的胎儿脐血细胞并在24小时后注射10μgtat-cre的nsg小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图19d-图19f示出来自接受了5×10⁵个(图19d)、1×10⁶个(图19e)或5×10⁶个(图19f)刚分离的胎儿脐血细胞并在24小时后注射10μgtat-myc的nsg小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。

图20示出facs染色的结果，显示了在经过亚致死剂量辐照然后用新鲜的胎儿脐血细胞移植并用tat-myc或tat-cre对照蛋白处理后8周时nsg小鼠中脾的重建情况。各小图示出分离出的脾细胞针对人cd45阳性细胞设门得到的流式细胞术分析结果。图20a-图20c示出来自接受了5×10⁵个(图20a)、1×10⁶个(图20b)或5×10⁶个(图20c)刚分离的胎儿脐血细胞并在24小时后注射10μgtat-cre的nsg小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图20d-图20f示出来自接受了5×10⁵个(图20d)、1×10⁶个(图20e)或5×10⁶个(图20f)刚分离的胎儿脐血细胞并在24小时后注射10μgtat-myc的nsg小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。

图21示出facs染色的结果，显示了在经过亚致死剂量辐照然后用在注射至小鼠中之前已用tat-myc体外处理1小时的新鲜胎儿脐血细胞移植后8周时nsg小鼠中外周血的重建情况。各小图示出分离出的pbmc针对人cd45阳性细胞设门得到的流式细胞术分析结果。图21a示出来自接受了5×10⁶个刚分离的胎儿脐血细胞的nsg小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。图21b示出来自接受了5×10⁶个在注射至小鼠中之前已用tat-myc体外处理1小时的刚分离的胎儿脐血细胞的nsg小鼠的细胞的流式细胞术分析结果。

图22示出facs染色的结果，显示了在经过亚致死剂量辐照然后用在注射至小鼠中之前已用tat-myc体外处理1小时的新鲜胎儿脐血细胞移植后8周时nsg小鼠中骨髓、脾和胸腺的长期重建。各小图示出分离出的骨髓细胞、脾细胞和胸腺细胞对人cd45阳性细胞设门得到的流式细胞术分析结果。图22a示出来自接受了5×10⁶个刚分离的胎儿脐血细胞的nsg小鼠的骨髓细胞的流式细胞术分析结果。图22b示出来自接受了5×10⁶个在注射至小鼠中之前已用tat-myc体外处理1小时的刚分离的胎儿脐血细胞的nsg小鼠的骨髓细胞的流式细胞术分析结果。图22c示出来自接受了5×10⁶个刚分离的胎儿脐血细胞的nsg小鼠的脾细胞的流式细胞术分析结果。图22d示出来自接受了5×10⁶个在注射至小鼠中之前已用tat-myc体外处理1小时的刚分离的胎儿脐血细胞的nsg小鼠的脾细胞的流式细胞术分析结果。图22e示出来自接受了5×10⁶个刚分离的胎儿脐血细胞的nsg小鼠的胸腺细胞的流式细胞术分析结果。图22f示出来自接受了5×10⁶个在注射至小鼠中之前已用tat-myc体外处理1小时的刚分离的胎儿脐血细胞的nsg小鼠的胸腺细胞的流式细胞术分析结果。

图23示出来自对照nsg小鼠(图23a)、接受了在细胞因子混合物中体外扩展的5x10⁶个c-gsf动员成人血细胞移植的经亚致死剂量辐照nsg小鼠(图23b)或者接受了在补充有tat-myc和tat-bcl-2的细胞因子混合物中扩展的5x10⁶个c-gsf动员成人血细胞移植的经亚致死剂量辐照nsg小鼠(图23c)的外周血的facs分析。

图24示出tat-myc多肽的一些实施例的氨基酸序列和核酸序列。

图25示出bcl-2结构域多肽的一些实施例的氨基酸序列和核酸序列。

具体实施方式

本公开部分地涉及通过施用包括myc组合物(诸如蛋白转导结构域-myc(ptd-myc)融合蛋白)的组合物、包括bcl-2组合物(诸如蛋白转导结构域-bcl-2(ptd-bcl-2)融合蛋白)的组合物或这二者来增强有需要的受试者体内造血区室细胞的形成。在某些方面，本公开涉及通过施用包括myc组合物(诸如蛋白转导结构域-myc(ptd-myc)融合蛋白)的组合物、包括bcl-2组合物(诸如蛋白转导结构域-bcl-2(ptd-bcl-2)融合蛋白)的组合物或这二者来加速造血干细胞(hsc)移植受体体内的hsc植入和造血区室重建。在一些实施例中，还向hsc移植受体施用包括myc组合物(诸如蛋白转导结构域-myc(ptd-myc)融合蛋白)的组合物、包括bcl-2组合物(诸如蛋白转导结构域-bcl-2(ptd-bcl-2)融合蛋白)的组合物或这二者来保持或进一步加速hsc移植受体体内的hsc植入和造血区室重建。如本文所用，hsc移植包括但不限于骨髓移植。

此外，本公开至少部分地基于以下发现：在骨髓移植后施用包括含有myc多肽和ptd(诸如hivtat蛋白转导结构域)的融合蛋白的组合物缩短了成熟造血谱系恢复所需的时间。例如，已证实，在骨髓移植后施用myc组合物的经致死剂量辐照小鼠体内，t细胞恢复所需的时间从约9周缩短至约4周，并且b细胞恢复所需的时间从约10周缩短至约4周(实例1)。因此，本公开的一个方面提供通过以下操作加速受试者体内造血干细胞(hsc)移植后造血区室重建的方法：a)施用治疗有效量的包含hsc的第一组合物，以实现有需要的受试者体内的造血区室重建；以及b)向受试者施用包括myc组合物、bcl-2组合物或这二者的第二组合物，其中与未被施用所述第二组合物的受试者体内的造血区室重建相比，施用所述第二组合物实现造血区室重建加速至少50％。

在其他方面，本公开涉及通过施用含有蛋白转导结构域-myc(ptd-myc)融合蛋白的组合物来增强有需要的受试者体内的造血区室自动重建。本公开还至少部分地基于以下新发现：施用myc组合物可以在经历化疗和/或放疗的受试者遭受由于该治疗造成的造血区室细胞减少后增强该受试者的恢复。例如，已证实，向用化疗药物5-氟尿嘧啶治疗后的受试者施用myc组合物加速了在由于5-氟尿嘧啶治疗造成的造血区室细胞(例如，cd8+t细胞)减少后造血区室细胞的恢复(图14)。

本公开的另一个方面提供了通过以下操作增强受试者体内造血区室自动重建的方法：向需要造血区室自动重建的受试者施用治疗有效量的包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者，其中myc组合物、bcl-2组合物或这二者诱导内源性hsc在受试者体内自动重建造血区室，并且其中造血区室自动重建与未被施用所述组合物的受试者体内的造血区室自动重建相比得到增强。

在其他方面，本公开部分地涉及在将hsc施用至受试者之前，通过用myc组合物(诸如蛋白转导结构域-myc(ptd-myc)融合蛋白)、bcl-2组合物(诸如ptd-bcl-2融合蛋白)或这二者预处理hsc群体，以增强需要造血干细胞移植的受试者体内的造血区室重建。在某些方面，本公开涉及在将造血干细胞(hsc)施用至受试者之前，通过用蛋白转导结构域-myc(ptd-myc)融合蛋白、蛋白转导结构域-bcl-2(ptd-bcl-2)融合蛋白或这二者预处理hsc，以加速hsc移植受体体内的hsc植入和造血区室重建。令人惊讶的是，在移植之前预处理hsc至少仅1小时(以及可能仅约10分钟)就足以使myc组合物、bcl-2组合物或这二者实现对造血区室重建的增强。

因此，某些优选的实施例涉及通过以下操作对需要造血干细胞移植的受试者增强造血区室重建的方法：用包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理造血干细胞群体短于约13天；随后向该受试者施用治疗有效量的处理过的造血干细胞群体，以重建该受试者的造血区室，其中造血区室重建与被施用了未经包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理的造血干细胞群体的受试者体内的造血区室重建相比得到增强。在一些实施例中，用包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理造血干细胞群体约12天或短于约12天到约1天或短于约1天，例如，约12天或短于约12天、约11天或短于约11天、约10天或短于约10天、约9天或短于约9天、约8天或短于约8天、约7天或短于约7天、约6天或短于约6天、约5天或短于约5天、约4天或短于约4天、约2天或短于约2天或者约1天或短于约1天。在一些实施例中，用包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理造血干细胞群体约24小时或短于约24小时到约1小时或短于约1小时，例如，约24小时或短于约24小时、约23小时或短于约23小时、约22小时或短于约22小时、约21小时或短于约21小时、约20小时或短于约20小时、约19小时或短于约19小时、约18小时或短于约18小时、约17小时或短于约17小时、约16小时或短于约16小时、约15小时或短于约15小时、约14小时或短于约14小时、约13小时或短于约13小时、约12小时或短于约12小时、约11小时或短于约11小时、约10小时或短于约10小时、约9小时或短于约9小时、约8小时或短于约8小时、约7小时或短于约7小时、约6小时或短于约6小时、约5小时或短于约5小时、约4小时或短于约4小时、约3小时或短于约3小时、约2小时或短于约2小时或者约1小时或短于约1小时。在一些实施例中，用包括myc组合物的组合物、包括bcl-2组合物的组合物或这二者处理造血干细胞群体约60分钟或短于约60分钟到约10分钟或短于约10分钟，例如，约60分钟或短于约60分钟、约55分钟或短于约55分钟、约50分钟或短于约50分钟、约45分钟或短于约45分钟、约40分钟或短于约40分钟、约35分钟或短于约35分钟、约30分钟或短于约30分钟、约29分钟或短于约29分钟、约28分钟或短于约28分钟、约27分钟或短于约27分钟、约26分钟或短于约26分钟、约25分钟或短于约25分钟、约24分钟或短于约24分钟、约23分钟或短于约23分钟、约22分钟或短于约22分钟、约21分钟或短于约21分钟、约20分钟或短于约20分钟、约19分钟或短于约19分钟、约18分钟或短于约18分钟、约17分钟或短于约17分钟、约16分钟或短于约16分钟、约15分钟或短于约15分钟、约14分钟或短于约14分钟、约13分钟或短于约13分钟、约12分钟或短于约12分钟、约11分钟或短于约11分钟或者约10分钟或短于约10分钟。

如本文所用，术语“造血区室”是指受试者体内含有全部血细胞谱系的细胞区室，血细胞谱系包括但不限于髓谱系，髓谱系包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板细胞和树突细胞；以及淋巴谱系，淋巴谱系包括但不限于t细胞、b细胞、nkt细胞和nk细胞。“造血区室”可含有全部不成熟的、成熟的、未分化的和分化的白血细胞群体和亚群体，包括组织特异的和特化的变体。

如本文所用，术语受试者体内的“造血区室细胞形成”是指在造血区室中源自造血干细胞(hsc)分化、hsc增殖和/或hsc存活的一个或多个属于造血区室的任何血细胞谱系的细胞的产生和/或扩展。“造血区室细胞形成”可以是用外源性hsc进行hsc植入的结果，诸如hsc移植受体体内的造血区室重建。作为另一种选择，“造血区室细胞形成”可以是内源性hsc分化、内源性hsc增殖和/或内源性hsc存活的结果，诸如源自受试者体内的造血区室自动重建。在一些实施例中，“造血区室细胞形成”包括但不限于以下的一者或多者：髓谱系形成、髓谱系祖细胞形成、单核细胞形成、巨噬细胞形成、嗜中性粒细胞形成、嗜碱性粒细胞形成、嗜酸性粒细胞形成、红细胞形成、巨核细胞形成、血小板细胞形成、树突细胞形成、淋巴谱系形成、淋巴谱系祖细胞形成、t细胞形成、b细胞形成、nkt细胞形成和nk细胞形成。

如本文所用，在受试者体内“增强造血区室细胞形成”是指以下的一者或多者：i)与被施用了未用myc组合物、bcl-2组合物或这二者处理过的外源性hsc的受试者体内的造血区室细胞形成速率相比，或者与未施用myc组合物的受试者体内源自hsc的造血区室细胞形成的速率相比，使造血区室细胞形成速率加快(例如，用外源性hsc加速造血区室重建或用内源性hsc加速自动重建)约或至少约5％到约或至少约500％；ii)与被施用了未用myc组合物、bcl-2组合物或这二者处理过的外源性hsc的受试者体内的造血区室中形成的造血区室细胞量相比，或者与未施用myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的造血区室中形成的造血区室细胞量相比，使源于外源性或内源性hsc的在受试者的造血区室中形成的造血区室细胞量增加约或至少约5％到约或至少约500％；或者iii)与被施用了未用myc组合物、bcl-2组合物或这二者处理过的外源性hsc的受试者体内损失的造血区室细胞量相比，或者与未施用myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内损失的造血区室细胞量相比，使受试者的造血区室细胞损失减少约或至少约5％到约或至少约500％。此外，在受试者体内“增强造血区室细胞形成”包括但不限于增强源自外源性hsc(例如，hsc植入)的造血区室重建，以及增强源自内源性hsc的造血区室自动重建。如本文所用，受试者体内“造血区室细胞的损失”是指由于细胞坏死、细胞凋亡等等造成的造血区室细胞量的减少。

类似地，在以下情况下，受试者体内的造血区室细胞形成得到增强：i)与被施用了未用myc组合物、bcl-2组合物或这二者处理过的外源性hsc的受试者体内的造血区室细胞形成速率相比，或者与未施用myc组合物的受试者体内源自hsc的造血区室细胞形成的速率相比，造血区室细胞形成速率被提高(例如，用外源性hsc进行的造血区室重建被加速或用内源性hsc进行的自动重建被加速)例如约或至少约5％到约或至少约500％；ii)与被施用了未用myc组合物、bcl-2组合物或这二者处理过的外源性hsc的受试者体内的造血区室中形成的造血区室细胞量相比，或者与未施用myc组合物的受试者体内的造血区室中形成的造血区室细胞量相比，受试者的造血区室中形成的造血区室细胞量被增加例如约或至少约5％到约或至少约500％；并且/或者iii)与被施用了未用myc组合物、bcl-2组合物或这二者处理过的外源性hsc的受试者体内损失的造血区室细胞量相比，或者与未施用myc组合物的受试者体内损失的造血区室细胞量相比，受试者的造血区室细胞损失被减少例如约或至少约5％到约或至少约500％。

可以使用本领域中已知的和本文所公开的，用于测量源自hsc的造血区室细胞形成(例如，造血区室重建或自动重建)的速率、用于测量受试者的造血区室中形成的造血区室细胞量和/或用于测量受试者体内的造血区室细胞损失的任何方法。在一个非限制性例子中，采用了对血细胞谱系标志物具有特异性的荧光标记抗体和荧光活化流式细胞术(facs)分析。

在某些实施例中，与被施用了未用myc组合物、bcl-2组合物或这二者处理过的外源性hsc的受试者体内的造血区室细胞形成速率相比，或者与未施用myc组合物的受试者体内源自hsc的造血区室细胞形成的速率相比，当造血区室细胞形成速率被提高例如约或至少约5％、约或至少约10％、约或至少约15％、约或至少约20％、约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％或者更高百分比时，认为造血区室细胞形成速率得到提高。

在某些实施例中，与被施用了未用myc组合物、bcl-2组合物或这二者处理过的外源性hsc的受试者体内的造血区室中形成的造血区室细胞量相比，或者与未施用myc组合物的受试者体内的造血区室中形成的造血区室细胞量相比，当形成的造血区室细胞量被增加例如约或至少约5％、约或至少约10％、约或至少约15％、约或至少约20％、约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％或者更高百分比时，认为受试者的造血区室中形成的造血区室细胞量得到增加。

在某些实施例中，与被施用了未用myc组合物、bcl-2组合物或这二者处理过的外源性hsc的受试者体内损失的造血区室细胞量相比，或者与未施用myc组合物的受试者体内损失的造血区室细胞量相比，当细胞损失被减少例如约或至少约5％、约或至少约10％、约或至少约15％、约或至少约20％、约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％或者更高百分比时，认为受试者体内的造血区室细胞损失得到减少。

myc组合物

本公开的某些方面涉及用包括myc组合物的组合物处理造血干细胞(hsc)群体，以增强造血区室重建。本公开的hsc可以单独用myc组合物处理，或者结合使用本公开的bcl-2组合物处理。可以使用本领域中已知的和本文所公开的用组合物(诸如融合蛋白)处理细胞的任何方法。例如，可以在存在myc组合物的情况下培养造血干细胞群体。本公开的其他方面涉及向有需要的受试者施用包括myc组合物的组合物，以增强受试者体内的造血区室形成。

如本文所用，“myc组合物”是指myc多肽；myc多肽的变异体或突变体、经修饰的myc多肽、myc多肽的同系物；myc多肽的类似物；myc多肽的生物活性片段；myc多肽的下游靶标、其同系物、其类似物或其生物活性片段；以及包含myc多肽的融合蛋白、其同系物、其类似物、及其生物活性片段。本公开的myc组合物包括本领域中已知的任何myc多肽、其变异体、其突变体、其同系物、其类似物或其生物活性片段(例如，美国专利申请公布no.us2007/0116691、us2009/0291094、us2010/0047217、us2010/0055129和us2010/0279351)。

在某些优选的实施例中，本公开的myc组合物为包含已偶接(例如，融合)至蛋白转导结构域(ptd)的myc多肽、其变异体、其突变体、其同系物、其类似物或其生物活性片段的融合蛋白。

myc多肽

在一些实施例中，本公开的myc组合物为myc多肽。本公开的myc多肽包括但不限于具有全长myc蛋白的一种或多种活性的任何多肽。

如本文所用，“myc”和“myc蛋白”可互换使用，并且是指作为bhlh(碱性螺旋-环-螺旋)转录因子的myc家族的成员的蛋白。本公开的myc蛋白是调节myc应答基因的表达的转录因子，并且因此需要进入细胞的细胞核中以发挥转录因子的作用。myc活性可激活某些myc应答基因的表达，同时阻遏其他myc应答基因的表达。myc活性可调节各种细胞功能，所述细胞功能包括但不限于细胞增殖、细胞生长和细胞凋亡。

本公开的myc组合物使得可以通过外源添加myc来提高需要造血区室细胞形成的受试者体内的myc活性，而无需通过基因操作来过度表达内源性myc或重组表达myc。

本公开的myc多肽包括但不限于全长myc蛋白，保留全长myc蛋白的至少一种活性的myc蛋白片段，保留全长myc蛋白的至少一种活性的myc蛋白同系物，以及保留全长myc蛋白的至少一种活性的myc蛋白类似物。本公开的myc多肽可以用本领域中已知的任何合适的方法制备。例如，myc多肽可以从天然来源纯化，可通过重组表达，或者可以是化学合成的。

myc蛋白

适用于本公开的任一方法中的全长myc蛋白的例子包括但不限于c-myc、n-myc、l-myc和s-myc。

在某些优选的实施例中，myc多肽为全长c-myc多肽。c-myc多肽可具有下列特征中的一个或多个：该多肽可为439个氨基酸组成的聚合物，该多肽的分子量可为48,804kda，该多肽可包含碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(bhlh/lz)结构域，或者该多肽可结合到包含cacgtg的序列(即，e框序列)。优选地，c-myc多肽为人c-myc多肽，其ncbi登录号为np_002458.2。此外，本公开的c-myc多肽可为未经历任何翻译后修饰的c-myc多肽。作为另一种选择，本公开的c-myc多肽可为已经历翻译后修饰的c-myc多肽。

在一些实施例中，myc多肽为包含蛋白转导结构域(ptd)的融合蛋白。在某些实施例中，myc多肽为本公开的包含tat蛋白或其片段的融合蛋白。在一些实施例中，myc多肽为具有以下氨基酸序列(seqidno:1)的tat-myc融合蛋白：

mrkkrrqrrrmplnvsftnrnydldydsvqpyfycdeeenfyqqqqqselqppapsediwkkfellptpplspsrrsglcspsyvavtpfslrgdndggggsfstadqlemvtellggdmvnqsficdpddetfikniiiqdcmwsgfsaaaklvseklasyqaarkdsgspnparghsvcstsslylqdlsaaasecidpsvvfpyplndssspkscasqdssafspssdsllsstesspqgspeplvlheetppttssdseeeqedeeeidvvsvekrqapgkrsesgspsagghskpphsplvlkrchvsthqhnyaappstrkdypaakrvkldsvrvlrqisnnrkctsprssdteenvkrrthnvlerqrrnelkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqkliseedllrkrreqlkhkleqlrkgelnsklegkpipnpllgldstrtghhhhhh

在seqidno:1的tat-myc多肽中，氨基酸2-10对应于hivtat蛋白转导结构域，氨基酸11-454对应于c-myc的氨基酸序列，氨基酸455-468对应于含14个氨基酸的v5表位，氨基酸472-477对应于6组氨酸标签。

生物活性myc片段

在其他实施例中，本公开的myc组合物为保留全长myc蛋白的至少一种活性的全长myc蛋白生物活性片段。myc多肽可为c-myc、n-myc、l-myc或s-myc的片段。

本公开的myc片段可包含myc蛋白的氨基酸序列中的至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个或更多个连续的氨基酸残基。

myc同系物

在其他实施例中，本公开的myc组合物为myc蛋白的同系物或保留全长myc蛋白的至少一种活性的myc蛋白片段的同系物。

例如，本公开的myc多肽可包含与myc蛋白或其片段具有至少40％到100％的同一性，例如，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或者在约40％到约100％的范围内的任何其他百分比的同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，myc多肽为c-myc、n-myc、l-myc、s-myc或它们的片段的同系物。

本公开的myc多肽还包括ncbi登录号为np_002458.2的人c-myc多肽或其片段的功能同系物或类似物。在某些实施例中，c-myc同系物或类似物包含与ncbi登录号为np_002458.2的c-myc多肽序列或其片段具有至少40％到100％的同一性，例如，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或者在约40％到约100％的范围内的任何其他百分比的同一性的氨基酸序列。

在其他实施例中，c-myc同系物或类似物包含长度为至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少350个氨基酸、至少400个氨基酸或更多个氨基酸的多肽序列，该多肽序列与ncbi登录号为np_002458.2的c-myc多肽序列或其片段具有至少50％到100％，例如，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或者在约50％到约100％的范围内的任何其他百分比的同一性。

如本文所用，“同系物”是指在参考序列和第二序列的至少一个片段之间具有氨基酸序列相似性的蛋白或多肽。可用本领域中已知的任何方法辨别同系物，优选地通过使用blast工具将参考序列与单个第二序列或某一序列的片段，或者与序列数据库进行比较来辨别。如下文所述，blast将基于同一性和相似性百分比来比较序列。

在两个或更多个序列(例如，氨基酸序列)的情形中，术语“同一的”或“同一性”百分比是指相同的两个或更多个序列或子序列。当使用下列序列比较计算法中的一种或者通过手动比对和目测在比较窗口或所测量的指定区域上进行比较和比对以获得最大对应时，如果两个序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域上或者当未指定时在整个序列上具有29％的同一性，任选地30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性)，则这两个序列是基本上同一的。任选地，同一性存在于长度为至少约10个氨基酸的区域上，或者更优选地存在于长度为20个、50个、200个或更多个氨基酸的区域上。

对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，将测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如有必要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定可选参数。然后，序列比较计算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。当比较两个序列的同一性时，序列不必为连续的，但是任何空位都会带有将减少同一性总百分比的罚分。对于blastp，默认参数为空位开放罚分＝11并且空位延伸罚分＝1。对于blastn，默认参数为空位开放罚分＝5并且空位延伸罚分＝2。

如本文所用，“比较窗口”包括指涉任何一个连续位置数目的区段，所述连续位置数目包括但不限于从20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150，其中将一个序列与具有相同的连续位置数目的参考序列进行最佳比对后，可以对这两个序列进行比较。将序列进行比对以便进行比较的方法是本领域所熟知的。可以例如使用smith和waterman的局部同源性算法(1981年)，使用needleman和wunsch的同源性比对算法(1970年)jmolbiol48(3):443-453(《分子生物学杂志》，第48卷，第3期，第443-453页)，使用pearson和lipman的寻找相似性方法(1988年)procnatlacadsciusa85(8):2444-2448(《美国国家科学院院刊》，第85卷，第8期，第2444-2448页)，使用这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传学软件包(wisconsingeneticssoftwarepackage)中的gap、bestfit、fasta和tfasta，威斯康星州麦迪逊575sciencedr.的遗传学计算机小组(geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wi))，或者使用手动比对和目测[参见例如brentetal.,(2003)currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,inc.(ringboued)(brent等人，2003年，《最新分子生物学实验方法汇编》，约翰·威利父子出版公司(ringbou编辑)]来进行序列的最佳比对以便进行比较。

适用于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的两个例子为blast和blast2.0算法，这两种算法分别在altschuletal.(1997)nucleicacidsres25(17):3389-3402(altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第17期，第3389-3402页)和altschuletal.(1990)j.molbiol215(3)-403-410(altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第3期，第403-410页)中有描述。用于进行blast分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中确定长度为w的短字串来确定高打分序列对(highscoringsequencepair,hsp)，该短字串当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某取正值的阈值分数t。t被称为邻近字串分数阈值(altschul等人，出处同上)。这些最初的邻近命中字串充当“种子”来引发对含有它们的更长的hsp的搜索。命中字串沿每条序列的两个方向延伸至累积比对分数不能增加为止。对于核苷酸序列，累积分数是使用参数m(一对匹配残基的奖励分数；始终大于0)和n(不匹配残基的罚分；始终小于0)来计算的。对于氨基酸序列，使用打分矩阵计算累积分数。命中字串在每个方向上的延伸在如下情况时停止：累积比对分数从其最大达到值下降达数量x；由于一个或多个负分残基比对的累积而使累积分数达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定比对的灵敏度和速度。对于氨基酸序列，blastp程序使用以下默认值：字长为3，期望值(e)为10，以及blosum62打分矩阵[参见henikoffandhenikoff,(1992)procnatlacadsciusa89(22):10915-10919(henikoff和henikoff，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第22期，第10915-10919页]比对(b)为50，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4，以及对两条链的比较。对于核苷酸序列，blastn程序使用以下默认值：字长(w)为11，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4，以及对两条链的比较。

blast算法还执行对两条序列之间的相似性的统计分析(参见例如karlinandaltschul,(1993)procnatlacadsciusa90(12):5873-5877(karlin和altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第12期，第5873-5877页)。blast算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallestsumprobability,p(n))，其指示两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的概率。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小合计概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。

与上述序列同一性百分比不同，两个多肽是基本上同一的另一指示是第一多肽与针对第二多肽而产生的抗体是免疫交叉反应性的。因此，例如如果某条多肽与第二多肽差别仅在于保守置换的话，这两种多肽通常是基本上同一的。

如本文所公开，合适的myc多肽还包括本公开的myc多肽的保守修饰变体。本文所用的“保守修饰变体”包括对被编码的氨基酸序列的各个置换、缺失或添加，从而导致氨基酸被与其化学性质相似的氨基酸所置换。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。下列八个组含有相互间为保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；以及8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)(参见例如creighton,proteins(1984)(creighton，《蛋白质》，1984年)。

myc类似物

在其他实施例中，本公开的myc组合物为myc蛋白的类似物或保留全长myc蛋白的至少一种活性的myc蛋白片段的类似物。在某些实施例中，myc多肽为c-myc、n-myc、l-myc、s-myc或它们的片段的类似物。

如本文所用，“类似物”是指与目的蛋白(诸如myc多肽)在结构上或功能上类似的蛋白。相比于起始蛋白，类似物可表现出相同的、类似的或改善的活性和/或功能。筛选类似物和/或合成类似物的方法是本领域所熟知的。

本公开的合适的myc类似物包括但不限于hif-1a和icn-1。

myc的下游蛋白

在其他实施例中，本公开的myc组合物为在myc途径中位于myc的下游的蛋白质。本领域中已知的任何下游蛋白适合与本公开的方法一起使用。位于myc下游的合适的蛋白的例子包括但不限于akt和akt相关蛋白，诸如pdk-1、mtorc2、pi3k-δ。myct的下游蛋白还可包括蛋白转导结构域(ptd)。因此，在某些实施例中，myc的下游蛋白为akt-ptd融合蛋白、ptd-pdk-1融合蛋白、ptd-mtorc2融合蛋白或ptd-pi3k-δ融合蛋白。

在其他实施例中，通过施用已用抑制剂(例如，基因分子、化学分子、小分子等)预处理的hsc来增强有需要的受试者体内的造血区室重建，所述抑制剂抑制拮抗hsc存活和/或增殖并且位于myc下游的蛋白质。相似地，通过施用治疗有效量的包含抑制剂(例如，基因分子、化学分子、小分子等)的组合物来增强有需要的受试者体内的造血区室形成，所述抑制剂抑制拮抗hsc存活和/或增殖并且位于myc下游的蛋白质。施用治疗有效量的组合物(诸如包含抑制剂的那些)和确定治疗量的方法是本领域所熟知的并在本文中有描述。拮抗hsc存活和/或增殖并且位于myc下游的蛋白质的例子包括但不限于pten、pp2a、phlpp、ctmp。可以使用本领域中已知的抑制蛋白质和/或基因表达、活性和/或功能的任何方法，所述方法包括但不限于本文所公开的方法。非限制性例子包括基因抑制剂、小分子抑制剂、rna干扰和抗体。

全长myc蛋白的活性

在其他实施例中，本公开的myc组合物包括具有至少一种myc活性的全长myc多肽，保留全长myc蛋白的至少一种活性的myc蛋白片段，保留全长myc蛋白的至少一种活性的myc蛋白同系物，或者保留全长myc蛋白的至少一种活性的myc蛋白类似物。

本公开的全长myc蛋白具有多种活性。此类活性的例子包括但不限于转录因子活性、蛋白结合活性、核酸结合活性、细胞增殖调节活性、细胞生长调节活性、细胞凋亡调节活性、形态发生调节活性、发育调节活性以及增强的造血区室重建活性。

在一些实施例中，本公开的myc组合物具有增强hsc移植受体体内的造血区室重建的myc活性，所述hsc移植受体包括但不限于骨髓移植受体。不希望受理论束缚，据信，myc活性增强移植的hsc有成效地回归受体体内的骨髓小生境。hsc移植后成熟造血谱系的恢复时间在很大程度上依赖于所施用的hsc回归骨髓小生境的能力。一旦hsc到达骨髓小生境，它们便需要与小生境固有的细胞建立分子交互作用。据认为，该分子交互作用对hsc内的细胞内在信号的性质和水平进行调节，所述细胞内在信号调节hsc的存活、增殖、自我更新和分化。虽然尚未充分了解调节骨髓小生境和hsc之间的回归和极化细胞分裂过程的表面分子，但显然若干粘附分子(诸如p-选择素和e-选择素)参与了该过程。不希望受理论束缚，据信，在hsc在骨髓小生境的回归和维持中，除了psgl1、vla4、vla5、lfa1和cd26之外，myc是p-选择素和e-选择素的表达的关键调节因子。还据信，myc是hsc中存活和分化信号的调节因子。此外，据信，myc调节涉及hsc多能性和自我更新的维持的若干其他途径(诸如wnt途径)的表达和/或功能。这种分子相互作用使hsc能够恢复到接近静态，该状态支持hsc的不对称细胞分裂，从而使得可以生成产生成熟造血谱系的短期hsc，并且使得可以生成使造血谱系能够在hsc移植受体的生命周期内成功重建的长期hsc区室。因此，向hsc移植受体施用本公开的myc组合物使得hsc有成效地回归受体体内的骨髓小生境增加至少50％。

在另外的实施例中，本公开的myc组合物包含myc多肽，该myc多肽的活性增强需要造血区室自动重建的受试者体内的造血区室自动重建。不希望受理论束缚，据信，myc活性增强内源性hsc自我更新和分化成全部造血区室谱系的能力，从而增强造血区室自动重建。不希望受理论束缚，还据信，myc活性增强hsc回归其骨髓小生境。

有利的是，以myc组合物的形式施用myc导致受试者体内的瞬时myc活性。这种瞬时myc活性避免长时期myc活性的潜在负面影响，诸如致癌性。

另外，本公开的myc组合物可增加内源性和外源性移植的hsc以及定向谱系(committedlineage)前体中的细胞内myc水平。因此，在某些实施例中，向需要造血区室自动重建的受试者施用本公开的myc组合物导致内源性hsc的扩展。在其他实施例中，向hsc移植受体(诸如，骨髓移植受体)施用本公开的myc组合物导致移植的hsc的扩展。

如本文所公开，本公开的myc组合物的治疗有效量为约或至少约0.5μ/ml到约或至少约100μ/ml，例如约或至少约0.5μ/ml、约或至少约0.6μ/ml、约或至少约0.7μ/ml、约或至少约0.8μ/ml、约或至少约0.9μ/ml、约或至少约1μ/ml、约或至少约2μ/ml、约或至少约3μ/ml、约或至少约4μ/ml、约或至少约5μ/ml、约或至少约6μ/ml、约或至少约7μ/ml、约或至少约8μ/ml、约或至少约9μ/ml、约或至少约10μ/ml、约或至少约15μ/ml、约或至少约20μ/ml、约或至少约25μ/ml、约或至少约30μ/ml、约或至少约35μ/ml、约或至少约40μ/ml、约或至少约45μ/ml、约或至少约50μ/ml、约或至少约55μ/ml、约或至少约60μ/ml、约或至少约65μ/ml、约或至少约70μ/ml、约或至少约75μ/ml、约或至少约80μ/ml、约或至少约85μ/ml、约或至少约90μ/ml、约或至少约95μ/ml或者约或至少约100μ/ml的myc组合物。

bcl-2组合物

本公开的某些方面涉及用包含bcl-2组合物的组合物处理造血干细胞(hsc)群体，以增强造血区室重建。本公开的hsc可以单独用bcl-2组合物处理，或者结合使用本公开的myc组合物处理。可以使用本领域中已知的和本文所公开的用组合物(诸如融合蛋白)处理细胞的任何方法。例如，可以在存在bcl-2组合物的情况下培养造血干细胞群体。在一些实施例中，可用本公开的myc组合物与本公开的bcl-2组合物的组合处理造血干细胞群体。本公开的其他方面涉及向有需要的受试者施用包含bcl-2组合物的组合物，以增强受试者体内的造血区室形成。

在一些实施例中，可以将本公开的包含bcl-2组合物的组合物施用至有需要的受试者，以增强受试者体内的造血区室形成。不希望受理论束缚，据信，bcl-2组合物可以使更多的外源性和/或内源性造血干细胞保持存活(即，增加细胞存活)足够长的时间，以增强造血细胞区室形成(例如，使用外源性hsc进行造血区室重建和/或植入或者使用内源性hsc进行造血区室自动重建)。用于确定造血细胞区室形成的示例性方法在本文中公开并且是本领域中已知的。除了本公开的myc组合物之外或者作为本公开的myc组合物的替代，可以施用bcl-2组合物。

如本文所用，“bcl-2组合物”是指bcl-2多肽；bcl-2多肽的变异体或突变体、经修饰的bcl-2多肽、bcl-2多肽的同系物；bcl-2多肽的类似物；bcl-2多肽的生物活性片段；bcl-2多肽的下游靶标、其同系物、其类似物或其生物活性片段；以及包含bcl-2多肽的融合蛋白、其同系物、其类似物、及其生物活性片段。本公开的bcl-2组合物包括本领域中已知的任何bcl-2多肽、其变异体、其突变体、其同系物、其类似物或其生物活性片段(例如，美国专利申请公布no.us2007/0116691、no.us2010/0047217和no.us2010/0279351)。

在某些优选的实施例中，本公开的bcl-2组合物为包含已偶接(例如，融合)至蛋白转导结构域(ptd)的bcl-2多肽、其变异体、其突变体、其同系物、其类似物或其生物活性片段的融合蛋白。

bcl-2多肽

在一些实施例中，本公开的bcl-2组合物为bcl-2多肽。本公开的bcl-2多肽包括但不限于具有bcl-2蛋白活性的任何多肽。

如本文所用，“bcl-2”、“bcl-2多肽”和“bcl-2蛋白”可互换使用，并且是指作为具有一个或多个和/或全部bcl-2同源(bh)结构域(诸如但不限于bh1、bh2、bh3和bh4)的bcl-2蛋白家族的成员的蛋白。bcl-2蛋白家族的成员通常形成异型二聚体或同型二聚体，并且充当细胞凋亡的调节因子。在某些优选的实施例中，本公开的bcl-2多肽具有抗细胞凋亡活性。

本公开的bcl-2组合物可使得可以通过外源添加bcl-2来增强需要造血区室细胞形成的受试者体内的bcl-2活性，而无需通过基因操作来过度表达内源性bcl-2或重组表达bcl-2。

本公开的bcl-2多肽包括但不限于全长bcl-2蛋白、保留全长bcl-2蛋白的活性的片段、全长bcl-2蛋白的同系物和类似物。在一些实施例中，保留全长bcl-2蛋白的活性的bcl-2片段包括已缺失非结构化环结构域的截短形式的bcl-2(anderson,m.,etal.(1999).refolding,purificationandcharacterizationofaloopdeletionmutantofhumanbcl-2frombacterialinclusionbodies.protexpr.purif.15,162-70(anderson,m.等人，1999年，源自细菌包涵体的人bcl-2的环缺失突变体的重折叠、纯化和表征，《蛋白表达与纯化》，第15卷，第162-170页))。本公开的bcl-2多肽可以用本领域中已知的任何合适的方法生产。例如，bcl-2多肽可以从天然来源纯化，可通过重组表达，或者可以是化学合成的。

bcl-2蛋白

适用于本公开的任一方法中的全长bcl-2蛋白的例子包括但不限于bcl-2、bcl-x、bcl-xl、mcl-1、ced-9、bcl-2相关蛋白a1、bfl-1和bcl-w。

在某些优选的实施例中，bcl-2多肽为已缺失非结构化环结构域的全长人bcl-2多肽。人bcl-2多肽可具有下列特征中的一个或多个：该多肽可为239个氨基酸组成的聚合物，该多肽的分子量可为大约26.3kda，或者该多肽可包含至少一个bcl-2同源(bh)结构域，诸如bh1、bh2、bh3和bh4。优选地，人bcl-2多肽是ncbi登录号为np_000624.2的bcl-2多肽。此外，本公开的bcl-2多肽可为未经历任何翻译后修饰的bcl-2多肽。作为另一种选择，本公开的bcl-2多肽可为已经历翻译后修饰的bcl-2多肽。

在一些实施例中，bcl-2多肽为包含蛋白转导结构域(ptd)的融合蛋白。在某些实施例中，bcl-2多肽为本公开的包含tat蛋白或其片段的融合蛋白。在一些实施例中，bcl-2多肽为tat-bcl-2δ融合蛋白，其中bcl-2多肽缺失非结构化环结构域。在某些实施例中，tat-bcl-2δ融合蛋白具有以下氨基酸序列(seqidno:3)：

mrkkrrqrrrmahagrsgydnreivmkyihyklsqratsgisieaagpalspvppvvhltlrqagddfsrryrrdfaemssqlhltpftargcfatvveelfrdgvnwgrivaffefggvmcvesvnremsplvdnialwmteylnrhlhtwiqdnggwdafvelygpsmrplfdfswlslktllslalvgacitlgaylshkkgelnsklegkpipnpllgldstrtghhhhhh

在seqidno:3的tat-bcl-2δ多肽中，氨基酸2-10对应于hivtat蛋白转导结构域，氨基酸11-212对应于bcl-2δ的氨基酸序列，氨基酸4213-226对应于含14个氨基酸的v5表位，氨基酸230-235对应于6组氨酸标签。

生物活性bcl-2片段

在其他实施例中，本公开的bcl-2组合物为保留全长bcl-2蛋白的至少一种活性的全长bcl-2蛋白生物活性片段。bcl-2多肽可为bcl-2、bcl-x、bcl-xl、mcl-1、ced-9、bcl-2相关蛋白a1、bfl-1或bcl-w的片段。

本公开的bcl-2片段可包含bcl-2蛋白的氨基酸序列中的至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个、至少170个、至少180个、至少190个、至少200个、至少210个、至少220个、至少230个或更多个连续的氨基酸残基。

bcl-2同系物和类似物

在其他实施例中，本公开的bcl-2组合物为bcl-2蛋白或其片段的同系物或类似物。例如，本公开的bcl-2多肽可包含与bcl-2蛋白或其片段具有至少40％到100％的同一性，例如，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或者在约40％到约100％的范围内的任何其他百分比的同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，bcl-2多肽为bcl-2、bcl-x、bcl-xl、mcl-1、ced-9、bcl-2相关蛋白a1、bfl-1、bcl-w或它们的片段的同系物或类似物。

本公开的bcl-2多肽还包括ncbi登录号为np_00624.2的人bcl-2多肽或其片段的功能同系物或类似物。在某些实施例中，bcl-2同系物或类似物包含与ncbi登录号为np_00624.2的bcl-2多肽序列或其片段具有至少40％到100％的同一性，例如，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或者在约40％到约100％的范围内的任何其他百分比的同一性的氨基酸序列。

在其他实施例中，bcl-2同系物或类似物包含长度为至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸、至少110个氨基酸、至少120个氨基酸、至少130个氨基酸、至少140个氨基酸、至少150个氨基酸、至少160个氨基酸、至少170个氨基酸、至少180个氨基酸、至少190个氨基酸、至少200个氨基酸、至少210个氨基酸、至少220个氨基酸、至少230个氨基酸或更多个氨基酸的多肽序列，该多肽序列与ncbi登录号为np_00624.2的bcl-2多肽序列或其片段具有至少50％到100％的同一性，例如，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或者在约50％到约100％的范围内的任何其他百分比的同一性。

如本文所公开，合适的bcl-2多肽还包括本公开的bcl-2多肽的保守修饰变体。

全长bcl-2蛋白的活性

在其他实施例中，本公开的bcl-2组合物包含具有至少一种bcl-2活性的全长bcl-2多肽，保留全长bcl-2蛋白的至少一种活性的bcl-2蛋白片段，保留全长bcl-2蛋白的至少一种活性的bcl-2蛋白同系物，或者保留全长bcl-2蛋白的至少一种活性的bcl-2蛋白类似物。

本公开的全长bcl-2蛋白具有多种活性。此类活性的例子包括但不限于细胞凋亡调节活性、细胞存活调节活性、蛋白结合活性、线粒体膜通透性调节活性、胱天蛋白酶调节活性、电压依赖性阴离子通道调节活性、g2检查点调节活性、线粒体外膜通道(vdac)调节活性、线粒体膜电位调节活性、蛋白通道活性和细胞色素c调节活性。

在一些实施例中，本公开的bcl-2组合物具有bcl-2活性，当在hsc移植之前用该bcl-2组合物单独地或者与myc组合物结合地处理hsc时，将增强hsc移植受体体内的造血区室重建，所述hsc移植受体包括但不限于骨髓移植受体。

如本文所公开，本公开的bcl-2组合物的治疗有效量为约或至少约0.5μ/ml到约或至少约100μ/ml，例如约或至少约0.5μ/ml、约或至少约0.6μ/ml、约或至少约0.7μ/ml、约或至少约0.8μ/ml、约或至少约0.9μ/ml、约或至少约1μ/ml、约或至少约2μ/ml、约或至少约3μ/ml、约或至少约4μ/ml、约或至少约5μ/ml、约或至少约6μ/ml、约或至少约7μ/ml、约或至少约8μ/ml、约或至少约9μ/ml、约或至少约10μ/ml、约或至少约15μ/ml、约或至少约20μ/ml、约或至少约25μ/ml、约或至少约30μ/ml、约或至少约35μ/ml、约或至少约40μ/ml、约或至少约45μ/ml、约或至少约50μ/ml、约或至少约55μ/ml、约或至少约60μ/ml、约或至少约65μ/ml、约或至少约70μ/ml、约或至少约75μ/ml、约或至少约80μ/ml、约或至少约85μ/ml、约或至少约90μ/ml、约或至少约95μ/ml或者约或至少约100μ/ml的bcl-2组合物。

蛋白转导结构域

本公开的某些方面涉及包含蛋白转导结构域的融合蛋白。在一些实施例中，本公开的myc组合物为融合蛋白，该融合蛋白包含融合至myc多肽的蛋白转导结构域。在其他实施例中，本公开的bcl-2组合物为融合蛋白，该融合蛋白包含融合至bcl-2多肽的蛋白转导结构域。

如本文所用，术语“肽转导结构域”、“蛋白转导结构域”和“ptd”可互换使用，是指蛋白的肽序列或结构域，该肽序列或结构域促进蛋白渗透至哺乳动物细胞中和/或哺乳动物细胞内的区室中。在一个非限制性例子中，ptd促进偶联的肽和/或蛋白渗透至细胞的细胞核中。

本公开的ptd可以通过本领域中已知的用于分离蛋白结构域的任何方法从含ptd的蛋白中分离，所述方法诸如标准分子生物学和生物化学技术。作为另一种选择，本公开的ptd可以是合成的。本公开的合适的ptd可具有约8至约30个氨基酸残基的长度，并且富含碱性氨基酸残基，诸如精氨酸(arg)和赖氨酸(lys)。

本公开的合适的ptd并不具有强烈的免疫原性，并且因此当施用至受试者时不会引起强烈的免疫响应。此外，当施用至无免疫应答的受试者时，诸如已接受、正接受或者将接受骨髓或hsc移植的受试者，本公开的ptd也不会引起免疫响应。

如本文所公开，本公开的ptd偶联(例如，融合、缀合、交联等)至肽和/或蛋白质，以有利于该肽和/或蛋白质渗透至哺乳动物细胞中和/或哺乳动物细胞内的区室中。例如，在某些实施例中，本公开的ptd偶联至myc蛋白。

适用于本公开的任一方法中的蛋白转导结构域包括本领域中已知的任何ptd(例如，美国专利申请公布no.us2007/0116691和no.us2010/0055129)。例如，合适的ptd可从蛋白质获得或衍生，所述蛋白质包括但不限于慢病毒tat(转录反式激活因子)蛋白、慢病毒vpr蛋白、疱疹病毒vp22蛋白和同源异型蛋白。

从慢病毒tat蛋白获得或衍生的合适的ptd的例子包括但不限于含tat蛋白的病毒的tat蛋白中的ptd、含tat蛋白的慢病毒的tat蛋白中的ptd、hiv-1tat蛋白中的ptd、hiv-2tat蛋白中的ptd、sivtat蛋白中的ptd、灵长类慢病毒tat蛋白中的ptd、绵羊慢病毒tat蛋白中的ptd、牛慢病毒tat蛋白中的ptd、马慢病毒tat蛋白中的ptd、猫慢病毒tat蛋白中的ptd、hiv、siv、灵长类慢病毒、绵羊慢病毒、牛慢病毒、马慢病毒或猫慢病毒的亚变种的tat蛋白中的ptd，以及这些ptd的同系物。在某些实施例中，ptd为hivtat蛋白的氨基酸残基48-57(tat[48-57])。在其他实施例中，ptd为hivtat蛋白的氨基酸残基57-48(tat[57-48])。

可从慢病毒vpr蛋白获得或衍生的合适的ptd的例子包括但不限于含vpr蛋白的病毒的vpr蛋白中的ptd、含vpr蛋白的慢病毒的vpr蛋白中的ptd、hiv-1vpr蛋白中的ptd、hiv-2vpr蛋白中的ptd、sivvpr蛋白中的ptd、灵长类慢病毒vpr蛋白中的ptd、绵羊慢病毒vpr蛋白中的ptd、牛慢病毒vpr蛋白中的ptd、马慢病毒vpr蛋白中的ptd、猫慢病毒vpr蛋白中的ptd、hiv、siv、灵长类慢病毒、绵羊慢病毒、牛慢病毒、马慢病毒或猫慢病毒的亚变种的vpr蛋白中的ptd，以及这些ptd的同系物。

可从疱疹病毒vp22蛋白获得或衍生的合适的ptd的例子包括但不限于人疱疹病毒1型(hsv-1)vp22蛋白中的ptd、人疱疹病毒2型(hsv-2)vp22蛋白中的ptd、bhv-1vp22蛋白中的ptd、鹦鹉疱疹病毒1型vp22蛋白中的ptd、马疱疹病毒1型vp22蛋白中的ptd、马疱疹病毒4型vp22蛋白中的ptd、禽疱疹病毒2型vp22蛋白中的ptd、水痘-带状疱疹病毒vp22蛋白中的ptd，以及这些ptd的同系物。

可从同源异型结构域转录因子获得或衍生的合适的ptd的例子包括但不限于果蝇属触角足(antp)蛋白中的同源异型结构域(hd)、果蝇属fushitarazu(ftz)蛋白中的hd、果蝇属engrailed(en)蛋白中的hd、chickengrailed-2蛋白中的hd、哺乳动物同源异型蛋白中的hd、人同源异型蛋白中的hd、人hox-a5同源异型蛋白中的hd、人hox-a4同源异型蛋白中的hd、人hox-b5同源异型蛋白中的hd、人hox-b6同源异型蛋白中的hd、人hox-b7同源异型蛋白中的hd、人hox-d3同源异型蛋白中的hd、人gox同源异型蛋白中的hd、人mox-2同源异型蛋白中的hd、人hoxc-8同源异型蛋白中的hd、人islet-1(isl-1)同源异型蛋白中的hd，以及这些hd的同系物。

另外，合适的ptd包括但不限于衍生自kaposi-fgf(k-fgf或fgf-4)的ptd、衍生自fgf-2的ptd、衍生自fgf-1的ptd，以及fgf蛋白家族的其他成员中的ptd。

其他合适的ptd包括合成的ptd(例如，beerens,amjetal.currgenether.2003oct；3(5):486-94(beerens,amj等人，《现代基因治疗》，2003年10月，第3卷，第5期，第486-494页))。

另外的合适的ptd包括但不限于chariot^tm

肽(加利福尼亚州卡尔斯巴德的activemotif公司(activemotif,carlsbad,ca))。

在一些实施例中，本公开的ptd通过重组方法而制备，而在其他实施例中，ptd通过合成方法而制备或者从天然来源纯化而得。

ptd融合蛋白修饰

在一些实施例中，本公开的含ptd的融合蛋白包括ptd-myc融合蛋白和ptd-bcl-2融合蛋白，这些融合蛋白包含一个或多个将ptd连接至myc或bcl-2多肽的分子。在一些实施例中，该一个或多个连接分子为氨基酸肽。

本公开的含ptd的融合蛋白还可包含至少一种促进融合蛋白的纯化的氨基酸序列。例如，ptd-myc融合蛋白可包含蛋白标签，诸如聚组氨酸标签，诸如六组氨酸表位标签。作为另一种选择，含ptd的融合蛋白可包含v5结构域。因此，在某些实施例中，本公开的含ptd的融合蛋白还包含聚组氨酸标签。优选地，聚组氨酸标签为6组氨酸标签。更优选地，组氨酸标签包含序列hhhhhh。

另外，可通过本领域中已知的任何合适的方法将组氨酸标签添加至本公开的含ptd的融合蛋白。例如，可将序列克隆到编码聚组氨酸标签的表达载体中。作为另一种选择，可以通过pcr(即，包含聚组氨酸序列的pcr引物)添加聚组氨酸标签。

此外，本公开的含ptd的融合蛋白还可包含至少一个蛋白标签。在一些实施例中，该至少一个蛋白标签为表位标签。优选地，表位标签为v5表位标签。在一些实施例中，v5表位标签包含氨基酸序列：gkpipnpllgldst，而在其他实施例中，v5表位标签包含氨基酸序列：ipnpllgld。该氨基酸可为d型或l型。在一些实施例中，第一多个氨基酸为d型，并且第二多个氨基酸为l型。另外，可通过本领域中已知的任何合适的方法将本公开的v5表位标签添加至本公开的含ptd的融合蛋白。例如，可将含ptd的融合蛋白序列克隆到编码v5表位标签的表达载体中。作为另一种选择，可以通过pcr(即，包含v5表位序列的pcr引物)添加v5表位标签。

在某些实施例中，本公开的含ptd的融合蛋白还包含聚组氨酸标签和表位标签。优选地，含ptd的融合蛋白包含6组氨酸标签和v5表位标签。

在一些实施例中，本公开的含ptd的融合蛋白可以任何所需顺序排列。在一些实施例中，含ptd的融合蛋白可按以下顺序排列：a)蛋白转导结构域符合读框地连接至myc或bcl-2多肽，b)myc或bcl-2多肽符合读框地连接至v5结构域，并且c)v5结构域符合读框地连接至六组氨酸表位标签。在一些实施例中，含ptd的融合蛋白具有如下顺序的组分：a)myc或bcl-2多肽符合读框地连接至蛋白转导结构域，b)蛋白转导结构域符合读框地连接至v5结构域，并且c)v5结构域符合读框地连接至六组氨酸表位标签。在一些实施例中，另外的居间氨基酸序列可被包括在所述序列的每一个之间。在一些实施例中，另外的氨基酸序列可被包括在所述序列的起始和/或末端处。

在一些实施例中，含ptd的融合蛋白包含蛋白转导结构域、myc或bcl-2多肽，以及短肽结构域。该短肽结构域可变。在一些实施例中，短肽结构域选自以下的至少一者：v5、组氨酸标签、ha(血凝素)标签、flag标签、cbp(钙调蛋白结合肽)、cyd(共价但可解离的norpd肽)、strepii或hpc(蛋白c的重链)。在一些实施例中，短肽结构域为约10个或20个氨基酸长。在一些实施例中，短肽结构域为2至20个氨基酸长，例如6至20个氨基酸长。在一些实施例中，上列项中的两个(例如，v5和组氨酸标签)可以一起用作短肽结构域。

含ptd的融合蛋白的构造

本公开的含ptd的融合蛋白可用本领域中已知的任何合适的方法来构造(例如，美国专利公布no.us2010/0055129)。

在一个非限制性例子中，可以通过pcr生成编码本公开的ptd-myc融合蛋白的核酸序列。这可以通过为myc序列设计正向引物和反向引物来完成，所述正向引物包含符合读框的ptd序列，诸如tat的rkkrrqrrr9-氨基酸序列，所述反向引物设计用于移除止密码子。使用此类引物从pcr反应获得的pcr产物随后可被克隆到本领域中已知的任何合适的表达载体中。

在一个非限制性例子中，可以通过pcr生成编码本公开的ptd-bcl-2融合蛋白的核酸序列。这可以通过为bcl-2序列设计正向引物和反向引物来完成，所述正向引物包含符合读框的ptd序列，诸如tat的rkkrrqrrr9-氨基酸序列，所述反向引物设计用于移除止密码子。使用此类引物从pcr反应获得的pcr产物随后可被克隆到本领域中已知的任何合适的表达载体中。可使用定点诱变试剂盒从bcl-2编码序列中移除bcl-2非结构化环。

含ptd的组合物

在其他实施例中，本公开的含ptd的融合蛋白包含在组合物中。对于治疗方法而言，此类含融合蛋白的组合物可包含药学上可接受的载体，该载体包含药学上可接受的赋形剂和/或递送介质，用于将含ptd的融合蛋白递送至受试者，诸如hsc移植受体。

在一些实施例中，含ptd的融合蛋白为ptd-myc，并且将治疗有效量的含ptd-myc融合蛋白的组合物(ptd-myc组合物)施用至受试者以实现与未施用该第二组合物的受试者体内的造血区室重建相比，造血区室重建加速至少50％。在其他实施例中，将治疗有效量的ptd-myc组合物施用至受试者以实现与未施用ptd-myc组合物的受试者体内的造血区室自动重建相比，造血区室自动重建增强。有利的是，当施用至受试者时，本公开的ptd-myc组合物具有低毒性。因此，ptd-myc组合物可以按从约0.1mg/kg至约50mg/kg受试者体重的范围内的量来施用。在某些实施例中，包含ptd-myc融合蛋白的组合物的治疗有效量为至少0.1mg/kg、至少0.2mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少0.5mg/kg、至少0.6mg/kg、至少0.7mg/kg、至少0.8mg/kg、至少0.9mg/kg、至少1mg/kg、至少2mg/kg、至少3mg/kg、至少4mg/kg、至少5mg/kg、至少6mg/kg、至少7mg/kg、至少8mg/kg、至少9mg/kg、至少10mg/kg、至少20mg/kg、至少30mg/kg、至少40mg/kg或至少50mg/kg受试者体重。

在其他实施例中，含ptd的融合蛋白为ptd-bcl-2，并且将治疗有效量的含ptd-bcl-2融合蛋白的组合物(ptd-bcl-2组合物)施用至受试者以实现与未施用该第二组合物的受试者体内的造血区室重建相比，造血区室重建加速至少50％。在其他实施例中，将治疗有效量的ptd-bcl-2组合物施用至受试者以实现与未施用ptd-bcl-2组合物的受试者体内的造血区室自动重建相比，造血区室自动重建增强。有利的是，当施用至受试者时，本公开的ptd-bcl-2组合物具有低毒性。因此，ptd-bcl-2组合物可以按从约0.1mg/kg至约50mg/kg受试者体重的范围内的量来施用。在某些实施例中，包含ptd-bcl-2融合蛋白的组合物的治疗有效量为至少0.1mg/kg、至少0.2mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg、至少0.5mg/kg、至少0.6mg/kg、至少0.7mg/kg、至少0.8mg/kg、至少0.9mg/kg、至少1mg/kg、至少2mg/kg、至少3mg/kg、至少4mg/kg、至少5mg/kg、至少6mg/kg、至少7mg/kg、至少8mg/kg、至少9mg/kg、至少10mg/kg、至少20mg/kg、至少30mg/kg、至少40mg/kg或至少50mg/kg受试者体重。

本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物可以每天施用至少一次、每天施用至少两次、每天施用至少三次、每天施用至少四次、每天施用至少五次或每天施用更多次。作为另一种选择，本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物可以每两天施用至少一次、每三天施用至少一次、每四天施用至少一次、每五天施用至少一次或每六天施用至少一次，每周施用至少一次、每两周施用至少一次、每三周施用至少一次或每四周施用至少一次。

有利的是，当在hsc移植之前约或至少约5天到约或至少约12小时时、与hsc移植同时或者在hsc移植之后约或至少约12小时到约或至少约3周时施用时，本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物可以加速受试者体内源自hsc移植(例如，hsc植入)的造血区室重建，所述hsc移植诸如骨髓移植。本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物可在任何合适的位置施用，所述位置包括但不限于发生hsc移植的相同位置处、与发生hsc移植的位置分开的诊所或医生办公室，以及接受hsc移植的受试者的家或住所。可以使用本领域中已知的和本文所公开的用于施用本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物的任何方法。在一些实施例中，用本领域中已知的和本文所公开的任何合适的药学上可接受的载体来共同施用ptd-myc组合物和/或ptd-bcl-2组合物。在其他实施例中，以本领域中已知的合适剂型来施用ptd-myc组合物和/或ptd-bcl-2组合物，所述合适剂型包括但不限于静脉注射剂型。

如本文所用，当本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物以与待移植的hsc相同的混合物和/或剂型施用，或者以独立于待移植的hsc的单独的混合物和/或剂型施用时，则所述组合物的施用与hsc移植“同时”发生。当ptd-myc组合物和/或ptd-bcl-2组合物以单独的混合物和/或剂型施用时，施用本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物与hsc移植“同时”发生包括但不限于在hsc移植之前约或至少约11小时到约或至少约1分钟时，或者在hsc移植之后约或至少约1分钟到约或至少约11小时时施用ptd-myc组合物和/或该ptd-bcl-2组合物。如本文所用，当在hsc移植之前约或至少约5天到约或至少约12小时，以独立于待移植的hsc的单独的混合物和/或剂型施用本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物时，则所述组合物的施用发生在hsc移植“之前”。如本文所用，当在hsc移植之后约或至少约12小时到约或至少约3周，以独立于待移植的hsc的单独的混合物和/或剂型施用本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物时，则所述组合物的施用发生在hsc移植“之后”。

因此，在某些实施例中，本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物在受试者的hsc移植之前、之后或者同时发生。在一些实施例中，ptd-myc组合物和/或ptd-bcl-2组合物在hsc移植之前约或至少约5天、约或至少约4天、约或至少约3天、约或至少约2天、约或至少约1天、约或至少约23小时、约或至少约22小时、约或至少约21小时、约或至少约20小时、约或至少约19小时、约或至少约18小时、约或至少约17小时、约或至少约16小时、约或至少约15小时、约或至少约14小时、约或至少约13小时或者约或至少约12小时时施用。在其他实施例中，ptd-myc组合物和/或ptd-bcl-2组合物与hsc移植同时施用。在其他实施例中，ptd-myc组合物和/或ptd-bcl-2组合物在hsc移植之后约或至少约12小时、约或至少约13小时、约或至少约14小时、约或至少约15小时、约或至少约16小时、约或至少约17小时、约或至少约18小时、约或至少约19小时、约或至少约20小时、约或至少约21小时、约或至少约22小时或者约或至少约23小时，约或至少约1天、约或至少约2天、约或至少约三天、约或至少约4天、约或至少约5天、约或至少约6天、约或至少约1周、约或至少约2周或者约或至少约3周时施用。

治疗用途

本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物在多种病症、疾病和综合征的治疗中有多种治疗用途。此类用途包括但不限于加速hsc移植受体(诸如骨髓移植受体)的造血区室重建；增强造血区室自动重建；治疗由于化疗或放疗造成的造血区室减少；治疗骨髓衰竭综合征；以及治疗长期的hsc植入失败。

如本文所用，“防止”由于化疗、放疗、骨髓衰竭和/或导致造血区室细胞损耗的任何其他病症所造成的“造血区室细胞减少”是指减少和/或抑制由于因为化疗、放疗、骨髓衰竭和/或导致造血区室细胞损耗的病症所造成的细胞坏死、细胞凋亡等而损耗的本公开的任何造血区室细胞的量的减少。可以使用本领域中已知的和本文所公开的用于定量分析细胞损耗(例如，定量分析细胞坏死、细胞凋亡等)的任何方法。在一个非限制性例子中，使用dna插入染料定量分析细胞损耗。在一些实施例中，“防止造血区室细胞的减少”可包括但不限于由于化疗、放疗、骨髓衰竭和/或导致造血区室细胞损耗的病症所造成的造血区室细胞损耗的约或至少约25％到约或至少约99％，或者更多的减少。

在某些实施例中，本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物可用于通过加速hsc移植受体体内的造血区室重建来减少该受体的植入失败和机会性感染的风险。

作为另一种选择，本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物可用于治疗受试者的骨髓衰竭综合征。骨髓衰竭综合征可被遗传，或者可因为例如传染病或者慢性疲劳综合征而发生。另外，hsc移植受体可因为例如移植数量不足的hsc、移植不相合的hsc或者受体的健康状况而发生骨髓衰竭。

获得性的骨髓衰竭综合征可包括但不限于再生障碍性贫血和海湾战争综合征。

遗传性骨髓衰竭综合征(ibmfs)可包括但不限于无巨核细胞性血小板减少症、戴-布二氏贫血、先天性角化不良、范可尼贫血、皮尔逊综合症、重型先天性嗜中性粒细胞减少症、舒-戴二氏综合征、血小板减少-桡骨缺失综合征、ivic综合征、wt综合征、桡尺骨骨性联接、共济失调，以及各类血细胞减少症。

在其他实施例中，本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物可用于治疗在初始植入经移植的hsc之后造血嵌合状态失效(即，长期hsc植入失败)的hsc移植受体。

暴露于毒素(诸如化学品、化疗药物或辐射)可导致受试者的造血区室减少或损耗。如本文所用，造血区室的减少可在造血区室中细胞总量减少或者造血区室中的特定细胞群体或子群体减少时发生。造血区室中的特定细胞群体或子群体的例子包括但不限于骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板、树突细胞、淋巴细胞、t细胞祖细胞、原t细胞、前t细胞、双阳性t细胞、不成熟t细胞、成熟t细胞、b细胞祖细胞、原b细胞、早期原b细胞、晚期原b细胞、大前b细胞、小前b细胞、不成熟b细胞、成熟b细胞、nkt细胞，以及nk细胞。

因此，在某些实施例中，本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物可用于治疗已暴露于此类毒素的受试者。在一些实施例中，用本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物治疗受试者防止正在经历或已经历了化疗或放疗的受试者体内的造血区室细胞减少或损耗。在其他实施例中，用本公开的ptd-myc组合物和/或本公开的ptd-bcl-2组合物治疗受试者防止正在经历或已经历了化疗或放疗的受试者体内的内源性hsc的量减少或损耗。

造血干细胞

本公开的其他方面涉及在将hsc移植于有需要的受试者体内之前，用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者处理造血干细胞(hsc)群体，以增强造血区室重建。本公开的其他方面涉及通过施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者以诱导hsc生成造血区室细胞，来增强有需要的受试者体内的造血区室细胞形成。待用本公开的方法治疗的“受试者”、“患者”或“宿主”可为需要造血区室细胞形成(例如，造血区室重建或自动重建)增强的人或非人，诸如本文公开的任何非人动物。如本文所公开，用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预先处理的本公开的hsc可在施用至需要造血区室重建的受试者之前进行洗涤。作为另一种选择，预先处理过的hsc可在未在施用之前洗涤的情况下施用至受试者，因为myc组合物和/或bcl-2组合物的瞬态效应对受试者无害。如本文所公开的、本领域中已知的任何合适的溶液都可用于洗涤经预先处理过的hsc。在一个非限制性例子中，在将预先处理过的hsc施用至受试者之前，使用ph值平衡的盐水溶液洗涤该hsc。可在将预先处理过的hsc施用至受试者之前约或短于约1分钟到约1小时、约4小时、约6小时、约8小时、约12小时、约24小时或更长时间时洗涤该hsc。

本公开的hsc能够产生所有细胞类型的造血区室，包括但不限于髓谱系，髓谱系包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板和树突细胞；以及淋巴谱系，淋巴谱系包括但不限于t细胞、b细胞、nkt细胞和nk细胞。

在一些实施例中，本公开的myc组合物加速hsc移植受体体内的造血区室重建。如本文所公开，hsc移植受体可接受骨髓移植、富含hsc的骨髓的移植、脐带血的移植、富含hsc的脐带血的移植、胎盘来源的血的移植、经纯化或经部分纯化的hsc的移植、源自hsc细胞系的hsc的移植或者有条件地永生化的hsc的移植。在此类实施例中，可以作为hsc移植程序过程中的步骤来施加hsc。如本文所公开，hsc可被包括但不限于在移植的骨髓、移植的脐带血或移植的细胞系中。在某些优选的实施例中，移植受体为人类受试者。可以通过本领域中已知的任何合适的技术来获得合适的hsc。例如，hsc可存在于供体的骨髓中，所述供体包括股骨、髋骨、肋骨、胸骨以及其他骨。可以使用本领域中已知的用于提取或收集骨髓细胞的任何方法。在一个非限制性例子中，通过使用针和注射器从髋骨的髓腔抽吸细胞，可直接从该髓腔获得hsc。通过执行多次微量抽吸可以从髋骨获得大量的骨髓。

适用于本公开的方法的hsc可由胚胎干(es)细胞和/或诱导多能干(ips)细胞制得。可以使用本领域中已知的用于从es细胞和/或ips细胞制备hsc的任何方法(例如，keller,g.genesdev.200519:1129-1155(keller,g.，《基因与发育》，2005年，第19卷，第1129-1155页)；和papapetrousadelain,f1000medrep.2010jun16；2(papapetrousadelain，《f1000医学报告》，2010年6月16日，第2卷))。例如，可通过使es细胞培养物的造血发育模仿早期胚胎中的造血定型而从es细胞制备hsc(例如，keller,g.genesdev.200519:1129-1155(keller,g.，《基因与发育》，2005年，第19卷，第1129-1155页))。

另外，适用于本公开的方法的hsc可以用本领域中已知的任何合适的技术获得。例如，hsc可存在于供体的骨髓中，所述供体包括股骨、髋骨、肋骨、胸骨以及其他骨。可以使用本领域中已知的用于提取或收集骨髓细胞的任何方法。在一个非限制性例子中，通过使用针和注射器从髋骨的髓腔抽吸细胞，可直接从该髓腔获得hsc。通过执行多次微量抽吸可以从髋骨获得大量的骨髓。

合适的hsc还可以从供体的血液中存在的外周血细胞中获得，通常是在用诸如g-csf(粒细胞集落刺激因子)的细胞因子进行预先处理后获得，所述细胞因子诱导hsc从供体的骨髓区室中释放出来。hsc还可以从已经历单采血液成分术程序以富集hsc的外周血中获得。可以使用本领域中已知的任何单采血液成分术程序。在某些实施例中，单采血液成分术程序为白细胞单采术程序。

另外，合适的hsc可从脐带血、胎盘和动员后的外周血获得。出于实验性目的，动物的胎肝、胎脾和agm(主动脉-性腺-中肾)也是可用的hsc来源。另外，hsc可得自从供体的骨髓、外周血、脐带或胚胎组织获得hsc的来源。作为另一种选择，hsc可包含在供体的骨髓、外周血、脐带或胚胎组织样品中。

在一些实施例中，hsc从人脐带或胎盘获得。可以利用的另一个hsc来源为动物胚胎的发育中的造血组织。对于人类而言，hsc可存在于约12至18周大的人类胚胎的循环血中。在一些实施例中，人hsc从任何来源获得，例如，血型为a+、a-、b+、b-、o+、o-、ab+和ab-的供体的骨髓、脐带、外周血或胚胎血液组织。在其他实施例中，人hsc从任何来源获得，例如，全适供体或具有罕见血型的供体的骨髓、脐带、外周血或胚胎血液组织。罕见血型是本领域中已知的，包括但不限于oh、cde/cde、cde/cde、c^wd-/c^wd-、-d-/-d-、rhnull、rh:-51、lw(a-b+)、lw(a-b-)、s-s-u-、s-s-u(+)、pp、pk、lu(a+b-)、lu(a-b-)、kp(a+b-)、kp(a-b-)、js(a+b-)、ko、k:-11、fy(a-b-)、jk(a-b-)、di(b-)、i-、yt(a-)、sc:-1、co(a-)、co(a-b-)、do(a-)、vel-、ge-、lan-、lan(+)、gy(a-)、hy-、at(a-)、jr(a-)、in(b-)、tc(a-)、cr(a-)、er(a-)、ok(a-)、jmh-和en(a-)。

在其他实施例中，人hsc从任何来源获得，例如，患有自体免疫病、免疫缺陷或者将受益于hsc移植的任何其他疾病或障碍的供体的骨髓、脐带、外周血或胚胎血液组织。此类供体也可以是受体。有利的是，从此类供体获得的hsc可用于个体化的hsc治疗。

在一个非限制性例子中，人hsc可以通过以下步骤获得：麻醉干细胞供体，用针穿刺髂后上棘，并用注射器进行骨髓细胞抽吸。在另一个非限制性例子中，hsc可从供体的外周血获得，其中在从外周血收集干细胞之前的几天中向供体注射g-csf以将干细胞动员到外周血。

因此，在一些实施例中，hsc从自体供体获得，也就是说，该供体还将是从此类hsc衍生的hsc的受体。本领域中已知的和本文所述的任何方法可用于从自体供体获得hsc。由此衍生或制备的hsc和/或任何治疗产物随后被移植、施用和/或输注回初始供体。相似地，hsc可以从异源供体获得，诸如需要hsc移植的受试者的兄弟姐妹、父母或其他亲属。在一个非限制性例子中，异源hsc通过从不同的血型或主要组织相容性复合体(mhc)或人白细胞抗原(hla)匹配来源收集hsc而获得。自体和/或异源hsc移植可在献血后的任何时间进行，诸如献血数天后、献血数月后或者甚至献血数年后。当需要hsc的受试者会对来自任何其他供体(包括异源供体和/或全适供体)的hsc的移植和/或输注具有阴性反应、有害反应或毒性反应时，自体献血可能特别有用。可受益于自体和/或异源献血的患者的例子是本领域所熟知的，包括但不限于患有自体免疫病、血液疾病或障碍、免疫疾病或障碍或者其他相关的疾病或病症的那些患者。

从例如骨髓、外周血或脐带血获得的细胞通常在提取或收集后进行处理。可以使用本领域中已知的用于处理提取的或收集的细胞的任何方法。处理步骤的例子包括但不限于过滤、离心、血液病理学筛选、病毒和/或微生物感染筛选、红细胞去除、t细胞去除(以减少异源干细胞移植受体体内移植物抗宿主病的发生率)、体积减小、细胞分离、在适用于后续处理的培养基或缓冲液中重悬细胞、从非干细胞中分离干细胞(例如，干细胞富集)、使用生长因子、细胞因子和/或激素的离体或体外干细胞扩展、以及低温保存。

可以使用本领域中已知的用于干细胞富集的任何合适的方法。干细胞富集的方法的例子包括但不限于荧光活化细胞分选法(facs)和磁性活化细胞分选法(macs)。

因此，在某些实施例中，适用于本公开的方法的hsc为人hsc。在其他实施例中，适用于本公开的方法的hsc是与受试者自体同源的。在其他实施例中，适用于本公开的方法的hsc是与受试者异源的。

可通过本领域中已知的任何合适的干细胞鉴别和富集方法，诸如通过利用某些表型或基因型标志物，来鉴别和/或富集从供体获得的hsc。例如，在一些实施例中，hsc的鉴别包括使用与hsc相关联的或与系统的终末分化细胞特异性地相关连的细胞表面标志物。合适的表面标志物可包括但不限于以下的一者或多者：c-kit、sca-1、cd4、cd34、cd38、thy1、cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd43、cd45、cd59、cd90、cd105、cd133、cd135、abcg2、nk1.1、b220、ter-119、flk-2、cdcp1、内皮粘蛋白、gr-1、cd46、mac-1、thy1.1、以及受体的信号传导淋巴细胞活化分子(slam)家族。slam受体的例子包括但不限于cd150、cd48和cd244。

另外，可通过本领域中已知的任何合适的方法从非干细胞分离从供体获得的hsc，所述方法包括但不限于荧光活化细胞分选法(facs)和磁性活化细胞分选法(macs)。

在一个非限制性例子中，用识别c-kit、sca-1、cd34、cd38、thy1、cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd43、cd45、cd59、cd90、cd105、cd133、abcg2、nk1.1、b220、ter-119、flk-2、cdcp1、内皮粘蛋白或gr-1的抗体温育人外周血细胞。用磁珠缀合cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、nk1.1、b220、ter-119和gr-1的抗体。将表达cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、nk1.1、b220、ter-119或gr-1的细胞保留在配备用于捕集磁珠和附接到磁珠缀合抗体的细胞的柱中。将未被macs柱捕集的细胞进行facs分析。用本领域中已知的荧光材料缀合c-kit、sca-1、cd34、cd38、thy1的抗体。根据与细胞相连的荧光抗体的类型将cd34⁺、cd38^low/-、c-kit^-/low、thy1+等细胞与样品的其余部分分离。这些细胞被提供作为适用于本公开的任一方法的人长期hsc。

在另一个非限制性例子中，用与上述相同的磁珠缀合抗体组(针对cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、nk1.1、b220、ter-119或gr-1中的一者或多者的抗体)和荧光缀合的cd150、cd244和/或cd48抗体标记从受试者获得的细胞。从样品中去除通过磁珠缀合抗体捕集的细胞后，通过facs分析样品，并将cd150+、cd244^-和cd48^-细胞作为长期hsc保留。

在一些实施例中，本公开的方法中使用的hsc含有以下标志物中的一者或多者：c-kit⁺、sca-l⁺、cd34^low/-、cd38⁺、thy1^+/low、cd34⁺、cd38^low/-、c-kit^-/low和/或thy1⁺。在一些实施例中，本公开的方法中使用的hsc不含以下标志物中的一者或多者：cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、nk1.1、b220、ter-119和/或gr-1。在某些实施例中，本公开的方法中使用的hsc为a⁺、a-、b⁺、b-、o⁺、o^-、ab⁺或ab^-型。

作为另一种选择，合适的hsc可从非人类来源获得。合适的非人hsc可从非人类的动物的股骨、髋骨、肋骨、胸骨以及其他骨骼分离，所述非人类的动物包括但不限于实验/研究动物、啮齿类动物、宠物、家畜、农场动物、役用动物、驮载动物、稀有或频临灭绝的物种、竞技动物以及动物园动物。合适的非人类的动物的另外的例子包括但不限于猴、灵长类动物、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、犬、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡。例如，hsc可通过用识别细胞表面分子的抗体温育骨髓细胞而从鼠骨髓细胞获得，所述细胞表面分子诸如以下的一者或多者：c-kit、sca-1、cd34、cd38、thy1、cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd43、cd45、cd59、cd90、cd105、cd133、abcg2、nk1.1、b220、ter-119、flk-2、cdcp1、内皮粘蛋白或gr-1。用磁珠缀合cd2、cd3、cd4、cd5、cds、nk1.i、b220、ter-119和gr-1的抗体。在macs设备中，表面上具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、nk1.1、b220、ter-119或gr-1的细胞保留在配备用于捕集磁珠和附接到磁珠缀合抗体的细胞的柱中。将未被macs柱捕集的细胞进行facs分析。对于facs分析，用荧光材料缀合诸如c-kit、sca-1、cd34、cd38、thy1的表面分子的抗体。根据与细胞相连的荧光抗体的类型将c-kit+、sca-1+、cd34^low/-、cd38⁺、thy1^+/low等细胞与样品的其余部分分离。这些细胞被提供作为适用于本公开的任一方法的鼠长期hsc。在其他实施例中，使用不同的标志物组从骨髓、脐带血、胎儿组织和外周血的细胞分离鼠长期hsc。

在一些实施例中，从骨髓获得hsc包括首先用5-氟尿嘧啶(5-fu)注射hsc供体(诸如小鼠)以诱导hsc增殖，从而在供体的骨髓中富集hsc。

此外，无论是获自脐带血、骨髓、外周血或其他来源还是存在于脐带血、骨髓、外周血或其他来源中，适用于本公开的任一方法的hsc可根据需要在有或没有血清的情况下在任何合适的、市售或定制的培养基中生长或扩展(例如，hartshornetal.,celltechnologyforcellproducts,pages221-224,r.smith,editor；springernetherlands,2007(hartshorn等人，《细胞产品的细胞技术》，第221-224页，r.smith编辑，springernetherlands出版社，2007年))。例如，不含血清的培养基可利用白蛋白和/或转铁蛋白，已证实其可用于使cd34+细胞在不含血清的培养基中生长和扩展。另外，可包含细胞因子，诸如flt-3配体、干细胞因子(scf)和促血小板生成素(tpo)等等。另外，hsc可在诸如生物反应器的容器中生长(例如，liuetal.,journalofbiotechnology124:592-601,2006(liu等人，《生物技术杂志》，第124卷，第592-601页，2006年))。用于离体扩展hsc的合适的培养基还可含有hsc支持细胞，诸如基质细胞(例如，淋巴网状基质细胞)，所述hsc支持细胞可衍生自例如淋巴组织的解聚，并且已证实其支持hsc以及其子代的体外、离体和体内的维持、生长和分化。

可根据本领域中已知的常规技术体外或体内测量hsc生长或扩展。例如，wo2008/073748描述了用于测量hsc的体内和体外扩展，以及用于对在潜在不均一性群体(例如骨髓)中hsc的生长/扩展与其他细胞(诸如中间祖细胞)的生长/扩展进行区分的方法。

hsc细胞系

在其他实施例中，适用于本公开的任一方法的hsc还可衍生自hsc细胞系。合适的hsc细胞系包括本领域中已知的任何培养的造血干细胞系。非限制性例子包括美国专利申请公布no.us2007/0116691和us2010/0047217中所述的有条件地永生化的长期干细胞系。

在某些实施例中，适用于本公开的方法的hsc在将施用至受试者之前进行有条件地永生化。例如，通过本文所公开的任何方法获得的hsc可用以下物质进行处理：促进细胞存活和增殖的可调节的(例如可诱导的、可控制的)原癌基因，诸如myc；和/或抑制hsc细胞凋亡的蛋白，诸如bcl-2(例如，美国专利申请公布no.us2007/0116691)。在一些实施例中，可调节的原癌基因为myc组合物。优选地，myc组合物为tat-myc融合蛋白。抑制hsc细胞凋亡的蛋白也可为可调节的。例如，可调节蛋白可为ptd-bcl-2融合蛋白，诸如tat-bcl-2融合蛋白。

在其他实施例中，适用于本公开的方法的hsc在施用至受试者之前，在存在本公开的myc组合物(例如，tat-myc融合蛋白)、本公开的bcl-2组合物(例如，tat-bcl-2融合蛋白)或这二者的情况下进行培养。优选地，在存在myc组合物和/或bcl-2组合物的情况下培养第一组合物使hsc有条件地永生化，从而使得所培养的hsc扩展。

如本文所用，“造血干细胞的扩展”或“hsc的扩展”是指与未用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者培养或处理过的hsc相比，细胞增殖和/或细胞存活的增加。例如，在hsc增殖、hsc存活或这二者增加约或至少约10％到约或至少约500％时，发生hsc扩展。可使用本领域中已知的和本文所公开的用于测量hsc增殖和/或存活的增加的任何方法。

因此，适用于本公开的任一方法的hsc可得自骨髓、得自单采血液成分术程序、得自外周血细胞、得自经历过白细胞单采术的外周血细胞、得自脐带血、得自羊水、得自培养的hsc细胞、得自永生化的hsc细胞系或得自有条件地永生化的hsc细胞系。作为另一种选择，适用于本公开的任一方法的hsc可存在于骨髓中、外周血细胞中、经历过白细胞单采术的外周血细胞中、脐带血中、羊水中、以及细胞系中。

转基因方法

在一些实施例中，使用本领域中已知的任何转基因方法(例如，美国专利申请公布no.us2007/0116691和no.us2010/0047217)建立用于本公开的方法的有条件地永生化的hsc。例如，可通过以下操作使hsc永生化：获得hsc的扩展群体，用编码例如myc多肽和/或bcl-2多肽(例如，可诱导和/或可控制)的载体转染(转导)hsc，用编码myc多肽和/或bcl-2多肽的载体转染(转导)hsc，并且在存在干细胞生长因子的组合的情况下，在其中myc多肽和/或bcl-2多肽被诱导和/或有活性的条件下扩展所转染的hsc。

myc多肽和/或bcl-2多肽是可调节的(例如，可诱导或可控制的)，使得多肽可根据需要活化或灭活(即，开启或关闭)，以将hsc维持在永生化状态或让其分化成所需要的细胞类型。

在一些实施例中，myc多肽和/或bcl-2多肽已经过修饰，使得活性可被诱导或可被阻遏。例如，myc多肽和/或bcl-2多肽还可包含可诱导的受体。在某些实施例中，重组蛋白包含雌激素受体(er)。在某些实施例中，促进细胞存活和/或增殖并且包含雌激素受体的重组蛋白为myc-er多肽和/或bcl-2-er多肽。在某些实施例中，通过4-羟基他莫昔芬(4-oht)诱导包含雌激素受体的蛋白。作为另一种选择，所述蛋白可包含糖皮质激素受体(gr)，例如对米非司酮(mifeprex)敏感的糖皮质激素受体。在某些实施例中，包含糖皮质激素受体的蛋白为myc-gr多肽和/或bcl-2-gr多肽。

可使用本领域中已知的用于获得hsc的扩展群体的任何方法。例如，可以用一种或多种促进细胞增殖和/或细胞分裂的生长因子培养hsc。

优选地，载体为整合型载体，其具有整合到细胞的基因组中的能力(例如，逆转录病毒载体)。可使用任何合适的用于转染细胞并且特别是哺乳动物细胞的方法，包括通过使用技术的组合，来用载体转染和/或转导hsc。合适的载体的例子包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、细小病毒载体、牛痘病毒载体、冠状病毒载体、杯状病毒载体、乳头状瘤病毒载体、黄病毒载体、正粘病毒载体、披膜病毒载体、小核糖核酸病毒载体、腺病毒载体以及经修饰的且减毒的疱疹病毒载体。任何此类病毒载体还可用将这些载体靶向hsc的特异性表面表达的分子进行修饰，所述特异性表面表达的分子诸如膜结合型scf或其他干细胞特异性生长因子配体。转染哺乳动物细胞的其他方法包括但不限于哺乳动物表达载体的直接电穿孔，诸如通过使用nucleofector^tm技术(amaxabiosystems公司)。该技术是用于大多数原代细胞并且用于难以转染的细胞系的高度有效的非病毒基因转移方法，其基于使用电流与溶液的细胞类型特异性组合将多阴离子大分子直接转移到细胞核中，是对早已众所周知的电穿孔方法的改进。另外，合适的转染方法可包括任何细菌、酵母或本领域中已知的其他人工基因递送方法。

内源性表达的增强

在一些实施例中，用于本公开的方法的有条件地永生化的hsc可通过增强促进细胞存活和/或增殖的内源性蛋白的表达来建立，所述内源性蛋白包括但不限于本公开的任何myc蛋白。另外，用于本公开的方法的有条件地永生化的hsc还可通过增强抑制细胞凋亡的内源性蛋白的表达来建立，所述内源性蛋白包括但不限于本公开的任何bcl-2蛋白。

蛋白转导方法

在一些实施例中，通过本文所公开的任何方法获得和/或产生的hsc可用促进细胞存活和/或增殖的基因产物和/或抑制hsc细胞凋亡的蛋白进行处理，所述基因产物包括但不限于本公开的任何myc蛋白，所述蛋白包括但不限于本公开的bcl-2蛋白。在一些实施例中，myc蛋白为包含ptd的融合蛋白。在一些实施例中，bcl-2蛋白为包含ptd的融合蛋白。在一些实施例中，通过本文所公开的任何方法获得和/或产生的hsc可用一种或多种使得本公开的myc蛋白的至少一种功能能够瞬时上调的化合物(任选地外源性蛋白质)进行处理。在一些实施例中，myc蛋白为ptd-myc融合蛋白。在某些实施例中，ptd-myc融合蛋白为tat-myc融合蛋白。

在一些实施例中，通过本文公开的任何方法获得的hsc可用一种或多种使得本公开的bcl-2蛋白的至少一种功能能够瞬时上调的化合物(任选地外源性蛋白)进行处理。在一些实施例中，外源性bcl-2蛋白为ptd-bcl-2融合蛋白。在一些实施例中，ptd-bcl-2融合蛋白为tat-bcl-2融合蛋白。

在其他实施例中，适用于本公开的任一方法的hsc用以下物质进行处理：含有包含融合至ptd的本公开myc蛋白的融合蛋白(例如，ptd-myc融合蛋白)的组合物、含有包含融合至ptd的本公开bcl-2蛋白的融合蛋白(例如，ptd-bcl-2融合蛋白)的组合物或这二者。

因此，适用于本公开的任一方法的hsc可得自胚胎干细胞(es细胞)、胎儿干细胞、诱导多能干细胞(ips细胞)、骨髓、得自外周血细胞、得自经历过单采血液成分术的外周血细胞、得自经历过白细胞单采术的外周血细胞、得自脐带血、得自羊水、得自经培养的hsc细胞、得自永生化的hsc细胞系或得自有条件地永生化的hsc细胞系。

hsc组合物

在其他实施例中，适用于本公开的任一方法的hsc包含在组合物中。合适的含hsc的组合物可含有但不限于分离的和/或纯化的hsc、全骨髓、富集hsc的骨髓(例如，经5-fu处理过的骨髓)、外周血、以及脐带血。在一些实施例中，此类组合物包含药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体可包括药学上可接受的赋形剂和/或递送介质，用于将hsc递送至受试者，诸如患者。另外，药学上可接受的载体可含有支持hsc活力的培养基。培养基通常将不含血清，以避免在受体中引发免疫响应。载体通常将被缓冲和/或不含热原。

在一些实施例中，将治疗有效量的含hsc的组合物施用至受试者，以在受试者体内实现造血区室重建。通常，施用10⁴至10⁶个hsc足以实现造血区室重建。在某些实施例中，将本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者施用至hsc移植受体可减少实现造血区室重建所需要的hsc的数量。例如，将治疗有效量的本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者施用至hsc移植受体，可使实现造血区室重建所需要的本公开的hsc组合物中的hsc的治疗有效量较之要实现在未被施用myc组合物和/或bcl-2组合物的hsc移植受体体内的造血区室重建所需要的hsc的量减少约或至少约10％到约或至少约75％。

在某些实施例中，将治疗有效量的本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者施用至hsc移植受体，可使实现造血区室重建所需要的本公开的hsc组合物中的hsc的治疗有效量较之要实现在未被施用myc组合物和/或bcl-2组合物的hsc移植受体体内的造血区室重建所需要的hsc的量减少约或至少约10％到约或至少约75％，例如，约或至少约10％、约或至少约15％、约或至少约20％、约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约70％、约或至少约75％，或更高的百分比。

在某些实施例中，在将hsc移植到有需要的受试者之前用治疗有效量的myc组合物、bcl-2组合物或这二者来处理hsc群体，可使实现造血区室重建所需要的hsc的治疗有效量较之要实现在未接受用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc的hsc移植受体体内的造血区室重建所需要的hsc的量减少约或至少约10％到约或至少约75％，例如约或至少约10％、约或至少约15％、约或至少约20％、约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约70％、约或至少约75％，或更高的百分比。

本公开的hsc组合物和hsc群体一般通过本领域中已知的任何合适的方法(包括但不限于注射和植入)被施用到受试者(诸如患者)体内。例如，可使用装有本公开的hsc组合物的注射器将hsc直接注射到预期该hsc将在其中起作用的组织内。作为另一种选择，本公开的hsc组合物可经由附接到装有hsc组合物的注射器的导管(诸如中心静脉导管)递送。

hsc移植

在另外的实施例中，将本公开的含有hsc的组合物和hsc群体施用至需要造血干细胞(hsc)移植的受试者，作为hsc移植程序过程中的步骤。在某些优选的实施例中，受试者为需要hsc移植的人类患者。在其他实施例中，受试者为任何非人类的动物，包括但不限于实验/研究动物、啮齿类动物、宠物、家畜、农场动物、役用动物、驮载动物、稀有或频临灭绝的物种、竞技动物、动物园动物、猴、灵长类动物、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、犬、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡。

hsc移植程序可以是清髓性hsc移植。清髓一般是指清除或抑制hsc移植受体的内源性造血区室。清髓在hsc移植之前进行。在患有血液疾病(诸如血液癌症)的hsc移植受体体内，可执行清髓以帮助根除该疾病。还可以执行清髓来抑制hsc移植受体的内源性免疫系统，以帮助降低移植的hsc被排斥(例如，移植物抗宿主疾病)的风险。可使用本领域中已知的进行清髓的任何方法。清髓程序的例子包括但不限于化疗、放疗、以及它们的组合。

作为另一种选择，hsc移植程序可以是非清髓性的。在非清髓性程序中，在hsc移植之前对受体施用较低剂量的化疗和/或放疗。

需要hsc移植的受试者包括呈现hsc移植指征的受试者。hsc移植指征的例子包括但不限于血液恶性肿瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、惰性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、舒-戴二氏综合征、脑肿瘤、尤因氏肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、复发性生殖细胞肿瘤、血液病、血红蛋白病、自身免疫病、幼年特发性关节炎、系统性红斑狼疮、重症综合性免疫缺陷、干细胞缺陷导致的先天性嗜中性粒细胞减少、重型再生障碍性贫血、镰状细胞病、骨髓增生异常综合征、慢性肉芽肿性疾病、代谢紊乱、赫尔利综合征、戈谢病、骨硬化病、恶性婴儿骨硬化病、心脏疾病、hiv，以及aids。另外，需要hsc移植的受试者还可以包括进行过器官移植的受试者。

增强造血区室细胞形成

本公开的其他方面涉及通过以下操作增强有需要的受试者体内的造血区室细胞形成：施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者；以及/或者施用已用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc群体。在一些实施例中，增强造血区室细胞形成包括增强造血区室重建。在一些实施例中，增强造血区室细胞形成包括增强造血区室自动重建。

增强造血区室重建

在某些实施例中，将已用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc群体施用至需要hsc移植的受试者增强受试者体内的造血区室重建。在其他实施例中，将本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者施用至已接受或将接受hsc移植的受试者增强受试者体内的造血区室重建。例如，用myc组合物、bcl-2组合物或这二者预处理hsc，然后再施用所述hsc；或者施用myc组合物、bcl-2组合物或这二者，与被施用了未用myc组合物、bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc，或未被施用myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者相比，可以提高造血区室重建的速率、增加所形成的造血区室细胞的数量或减轻受试者体内的造血区室细胞的损耗。

优选地，在将hsc施用至受试者之前用myc组合物、bcl-2组合物或这二者预处理hsc；或将myc组合物、bcl-2组合物或这二者施用至受试者，与尚未被施用预处理过的hsc，或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的造血区室重建相比，加速受试者体内的造血区室重建(即，增加造血区室重建的速率)。

如本文所用，“造血区室重建加速”是指重建造血区室中的一种或多种血细胞谱系的约或至少约25％到约100％所需的时间缩短，该血细胞谱系包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板和树突细胞；以及淋巴谱系，该淋巴谱系包括但不限于t细胞、b细胞、nkt细胞和nk细胞。例如，重建造血区室所需的时间从8周缩短至4周将构成50％的加速。

用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者进行预处理；或施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者，可实现已接受或将接受hsc移植的受试者体内的造血区室重建与未被施用预处理过的hsc或者本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的受试者体内的造血区室重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％或更高百分比。

如本文所公开，造血区室重建包括但不限于t细胞区室重建、b细胞区室重建、nk细胞区室重建、骨髓细胞区室重建、以及嗜中性粒细胞恢复。如本文所用，术语“t细胞区室”是指受试者体内的含有全部不成熟的、成熟的、未分化的和分化的t细胞的细胞区室。“t细胞区室”包括但不限于t细胞祖细胞、原t细胞、前t细胞、双阳性t细胞、不成熟t细胞、成熟t细胞、辅助性t细胞、细胞毒性t细胞、记忆性t细胞、调控性t细胞、天然杀伤t细胞(nkt细胞)、以及γδt细胞。如本文所用，术语“b细胞区室”是指受试者体内的含有全部不成熟的、成熟的、未分化的和分化的b细胞的细胞区室。“b细胞区室”包括但不限于b细胞祖细胞、原b细胞、早期原b细胞、晚期原b细胞、大前b细胞、小前b细胞、不成熟b细胞、成熟b细胞、血浆b细胞、记忆性b细胞、b-1细胞、b-2细胞、边缘区b细胞、以及滤泡性b细胞。如本文所用，术语“nk细胞区室”是指受试者体内的含有全部不成熟的、成熟的、未分化的和分化的天然杀伤(nk)细胞和nk细胞祖细胞的细胞区室。“nk细胞区室”nk细胞。如本文所用，术语“骨髓细胞区室”是指受试者体内的含有全部不成熟的、成熟的、未分化的和分化的骨髓细胞群体和骨髓细胞群体的祖细胞的细胞区室。“骨髓细胞区室”包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板和树突细胞。

因此，在某些实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致t细胞区室重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的t细胞区室重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致nkt细胞重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的nkt细胞重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致b细胞区室重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的b细胞区室重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致nk细胞区室重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的nk细胞区室重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致骨髓细胞区室重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的骨髓细胞区室重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致单核细胞重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的单核细胞重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致巨噬细胞重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的巨噬细胞重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致嗜碱性粒细胞重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的嗜碱性粒细胞重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致嗜酸性粒细胞重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的嗜酸性粒细胞重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致红细胞重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的红细胞重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致巨核细胞重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的巨核细胞重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致血小板重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的血小板重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致树突细胞重建与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的树突细胞重建相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

在其他实施例中，已被施用用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者预处理过的hsc或已被施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的hsc移植受体体内的经加速造血区室重建，导致嗜中性粒细胞恢复与未被施用预处理过的hsc或者myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的嗜中性粒细胞恢复相比加速约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更高的百分比。

增强的造血区室自动重建

在其他实施例中，将本公开的myc组合物施用至需要自动重建的受试者增强该受试者体内的造血区室自动重建。例如，与未被施用myc组合物的受试者相比，施用myc组合物可提高自动重建的速率、增加所形成的造血区室细胞的数量或减轻受试者体内的造血区室细胞的损耗。

施用本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者，与未被施用myc组合物、bcl-2组合物或这二者的受试者体内的造血区室自动重建相比，可将造血区室自动重建增强约或至少约25％到约或至少约500％，例如，约或至少约25％、约或至少约30％、约或至少约31％、约或至少约32％、约或至少约33％、约或至少约34％、约或至少约35％、约或至少约40％、约或至少约45％、约或至少约50％、约或至少约55％、约或至少约60％、约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约75％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约100％、约或至少约150％、约或至少约200％、约或至少约250％、约或至少约300％、约或至少约400％、约或至少约500％，或更多。

如本文所公开，造血区室自动重建包括但不限于t细胞区室自动重建、b细胞区室自动重建、nkt细胞自动重建、以及nk细胞区室自动重建；骨髓细胞区室自动重建，诸如单核细胞自动重建、巨噬细胞自动重建、嗜碱性粒细胞自动重建、嗜酸性粒细胞自动重建、红细胞自动重建、巨核细胞自动重建、血小板自动重建和树突细胞自动重建；以及嗜中性粒细胞恢复。

组合物制剂

本公开的某些方面涉及包括本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的用于预处理本公开的hsc且用于治疗需要hsc移植的受试者的组合物。其他方面涉及包含hsc的用于在有需要的受试者体内实现造血区室重建的第一组合物，以及包括本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的用于增强受试者体内的造血区室重建的第二组合物。本公开的其他方面涉及包括本公开的myc组合物、本公开的bcl-2组合物或这二者的用于在有需要的受试者体内增强造血区室自动重建的组合物。

在一些实施例中，使用一种或多种生理上可接受的载体以常规方式配制本公开的组合物，所述生理上可接受的载体包括(例如)有利于活性化合物被加工成适用于医药用途的制剂的赋形剂和助剂。合适的药学上可接受的载体包括但不限于盐水、含水的缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。这类载体的使用在本领域中是熟知的。载体优选地是无菌的。在一些实施例中，载体在制造和储存条件下是稳定的，并且通过使用例如但不限于对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸或硫柳汞来加以保存，以防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。

可充当药学上可接受的载体的材料和溶液的例子包括但不限于：(1)糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇类，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)ph缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及(22)在药物制剂中采用的其他无毒相容的物质。

本公开组合物的适当制剂可取决于所选择的施用途径。本文所述的药物组合物的概述可见于(例如)remington:thescienceandpracticeofpharmacy,nineteenthed(easton,pa.:mackpublishingcompany,1995)(《雷明顿：药剂学科学与实践》，第19版，美国宾夕法尼亚州伊斯顿马克出版公司，1995年)；hoover,johne.,remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.,easton,pa.1975(hoover,johne.，《雷明顿医药科学》，美国宾夕法尼亚州伊斯顿马克出版公司，1975年)；liberman,h.a.andlachman,l.,eds.,pharmaceuticaldosageforms,marceldecker,newyork,n.y.,1980(liberman,h.a.和lachman,l.编辑，《医药剂型》，美国纽约州纽约马塞尔德克尔出版公司，1980年)；以及pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,seventhed.(lippincottwilliams&wilkins1999)(《医药剂型与药物递送系统》，第7版，利平科特威廉斯和威尔金斯出版公司，1999年)。

本公开的组合物可方便本公开的化合物(例如，hsc或myc组合物或bcl-2组合物)向受试者或细胞的施用。在本公开的方法的某些实施例中，在药物组合物中将治疗有效量的本文所述的化合物施用至患有待治疗的障碍、疾病或病症的受试者。在一些实施例中，受试者为人类患者。在其他实施例中，受试者为非人类的动物，包括但不限于犬、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、猴、大鼠、小鼠等。

本公开的hsc组合物、包含myc组合物的组合物、和/或包含bcl-2组合物的组合物可被单独利用，或者与一种或多种另外的治疗剂结合利用。例如，可将已知有助于缩短在hsc移植后重建成熟造血谱系所需的时间的细胞因子、生长因子、抗体和/或小分子调节剂与hsc组合物、包含myc组合物的组合物、和/或包含bcl-2组合物的组合物结合施用。例如，以影响e选择素表达的酶为靶标的单克隆抗体和/或小分子调节剂可改善hsc移植之后hsc回归骨髓小生境。其他例子包括但不限于影响黏附蛋白的抗体或小分子，诸如β6整联蛋白、g-mcsf、g-csf以及epo。因此，本公开的方法的某些实施例还包括施用含有至少一种细胞因子、生长因子、抗体和/或小分子调节剂的第三组合物。在一些实施例中，细胞因子和/或生长因子组合物还含有药学上可接受的载体。

本公开的组合物可以任何合适的方式被施用至受试者，所述方式包括但不限于多种施用途径中的一种或多种，诸如口服给药、肠胃外给药(例如，静脉注射、皮下注射、肌内注射)、鼻内给药、口腔给药、直肠给药或透皮施用途径。

本公开的组合物制剂包括但不限于含水液体分散剂、油乳剂、自乳化分散剂、固体溶液剂、脂质体分散剂、气溶胶剂、固体剂型、散剂、速释型制剂、控释型制剂、快速熔化制剂、片剂、胶囊剂、丸剂、延释型制剂、缓释型制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂以及混合型速释和控释制剂。

本公开的药物组合物(例如，ptd-myc组合物、ptd-bcl-2组合物或细胞因子和/或生长因子组合物)任选地以常规方式制造，所述常规方式包括但不限于常规的混合、溶解、制粒、制锭、研碎、乳化、包胶囊、包封或压缩工艺。

在一些实施例中，本公开的药物组合物(例如，ptd-myc组合物、ptd-bcl-2组合物或细胞因子和/或生长因子组合物)是适用于精确剂量的单次施用的单位剂型。在单位剂型中，所述制剂被分成含有适当量的一种或多种化合物的单位剂量。在一些实施例中，单位剂量是装有分立量的所述制剂的包装的形式。非限制性例子包括包装好的片剂或胶囊剂，以及小瓶或安瓿中的粉剂。含水混悬剂组合物被任选地包装在单剂量的不可重新盖紧的容器中。在一些实施例中，使用多剂量的可重新盖紧的容器。在某些实施例中，多剂量容器在组合物中包含防腐剂。用于肠胃外注射的制剂可以单位剂型(包括但不限于安瓿)或具有添加的防腐剂的多剂量容器提供。

以下实例仅仅是例示性的，并且不意在以任何方式限制本公开的任何方面。

实例

实例1：小鼠体内的加速造血重建

以下实例描述在用扩展的骨髓细胞(例如，蛋白转导的长期造血干细胞(ptlt-hsc))移植之后用tat-myc融合蛋白处理小鼠的结果。

材料与方法

4-6周龄的雌性c57bl/6j小鼠的同龄组获自美国缅因州巴尔港的杰克森实验室(jacksonlaboratories(barharbor,me))。对每只小鼠用5mg5-氟尿嘧啶(5fu)进行静脉内处理。在5fu处理后5天时，从胫骨和股骨收集骨髓(bm)细胞。通过在5ml无菌tac缓冲液(135mmnh4cl,17mmtris(ph7.65))中温育，使红血细胞裂解。将骨髓细胞置于补充有5μg/ml重组tat-myc和10μg/ml重组tat-bcl-2的bm培养基(含有15％fcs、100单位/ml青霉素/链霉素、memneaa(吉必可公司(gibco))、10mmhepes和重组鼠类il-3、il-6和scf的dmem)中扩展。将细胞培养21天，在该过程中每48小时更换一次bm培养基以更新tat融合蛋白。

通过将293ft细胞以12×10⁶个细胞/板的密度接种在150mm板的d10培养基(含有10％fbs、100单位/ml青霉素/链霉素、memneaa(吉必可公司)和2mml-谷氨酰胺(吉必可公司)的dmem)中，来制备细胞因子。使用磷酸钙，用由10μgpcdna3.1-scf、10μgpcdna3.1-il3、10μgpcdna3.1-il6或10μgpcdna3.1-tpo、10μgpcdna3.1-flt3-l和10μgpcdna3.1-gm-csf组成的每板30μg总dna将所述细胞转染(young,r.m.,etal.(2008).futureoncology,4,591-4.(young,r.m.等人，2008年，《未来肿瘤学》，第4卷，第591-594页))。第二天，将培养基移除，并用100mld10培养基替换。将细胞在37℃/5％co2下温育4至5天。收集培养基，进行无菌过滤，随后在-20℃下以30ml等分试样冷冻。

21天后，将5×10³个扩展的骨髓细胞移植到经亚致死量辐照的以c57/bl6为背景的rag-1^-/-小鼠(杰克森实验室(jacksonlaboratory))体内，这些小鼠在即将经由尾静脉被注射骨髓细胞之前接受350拉德的辐射。将扩展的细胞置于pbs中洗涤3次，随后在200μlpbs中经由尾静脉注射。

24小时后，对一个同龄组的小鼠肌内注射10μg在玉米油中乳化的tat-myc。该乳液通过将30μgtat-myc添加到1ml玉米油中而制得。在即将注射之前，使含有tat-myc的玉米油从第一注射器数次通过两通旋塞阀转到第二注射器。将含有10μgtat-myc的300μl所述乳液肌内注射到小鼠体内，注射位置刚好在鼠尾的一侧。

通过对在移植后4周和8周时由穿刺尾静脉所获得的外周血样品进行流式细胞术分析(facs)，来监测淋巴区室的重建情况。通过facs监测外周血单核细胞(pbmc)的tcrβ和b220表达。

结果

如图1和图3所示，在用离体扩展的骨髓细胞进行骨髓移植后，在用tat-myc处理过的小鼠体内看到了t细胞的加速发育。对rag-1^-/-小鼠的同龄组进行亚致死量辐照，随后移植5×10³个扩展的骨髓细胞(图1c和图1d；图3c和图3d)。在移植后24小时时，用10μgtat-myc对每个同龄组中的半数经辐照和移植的小鼠进行注射(图1d和图3d)。还提供了对野生型(未处理过且未经辐照的)rag-1^-/-小鼠(图1a：0.9％tcrβ+细胞；图3a：0.8％tcrβ+细胞)和c57bl/6小鼠(图1b：34.3％tcrβ+细胞；图3b：34.3％tcrβ+细胞)的facs分析结果作为对照。

在4周(图1)和8周(图3)时，通过对小鼠的外周血进行facs分析，测试小鼠的t细胞重建情况。图1d示出与未注射tat-myc的对照(图1c)(0.2％tcrβ+细胞)相比，用tat-myc处理过的小鼠的外周血中t细胞的4周水平(5.6％tcrβ+细胞)。图3d示出与未注射tat-myc的对照(图3c)(4.2％tcrβ+细胞)相比，用tat-myc处理过的小鼠的外周血中t细胞的8周水平(13.1％tcrβ+细胞)。在4周时，注射了tat-myc的小鼠表现出与未注射tat-myc的对照小鼠在8周时的t细胞水平类似的t细胞水平。由于t细胞恢复的平均时间为8至10周，所以这表示加速约50-60％。

如图2和图4所示，在用扩展的骨髓细胞进行骨髓移植后，在用tat-myc处理过的小鼠体内还看到了b细胞的加速发育。对以c57/bl6为背景的rag-1^-/-小鼠的同龄组进行亚致死量辐照，随后移植5×10³个扩展的骨髓细胞。在移植后24小时时，对每个同龄组中的半数经辐照和移植的小鼠注射10μgtat-myc(图2d和图4d)。还提供了对野生型(未处理过且未经辐照的)rag-1^-/-小鼠(图2a：1.15％b220+细胞；图4a：1％b220+细胞)和c57bl/6小鼠(图2b：21.4％b220+细胞；图4b：29.2％b220+细胞)的facs分析结果作为对照。

在4周(图2)和8周(图4)时，通过对小鼠的外周血进行facs分析，测试小鼠的b细胞重建情况。图2d示出与未注射tat-myc的对照(图2c)(0.3％b220+细胞)相比，用tat-myc处理过的小鼠的外周血中b细胞的4周水平(12.1％b220+细胞)。图4d示出与未注射tat-myc的对照(图4c)(1.2％b220+细胞)相比，用tat-myc处理过的小鼠的外周血中b细胞的8周水平(5.4％b220+细胞)。在4周时，注射了tat-myc的小鼠表现出比未注射tat-myc的对照小鼠在8周时的b细胞水平高的b细胞水平。由于b细胞恢复的平均时间为8至12周，所以这表示加速约50-67％。

实例2：小鼠体内的加速造血重建

以下实例描述在新分离的全骨髓移植之后用tat-myc融合蛋白处理小鼠的结果。

材料与方法

对于小鼠体内的全骨髓移植，供体和受体均以c57/bl6为背景。

从获自两只野生型c57/bl6供体小鼠的股骨和胫骨中冲出骨髓细胞。将所收获的细胞转移到d10完全培养基(补充有10％热灭活的胎牛血清、100单位/ml青霉素/链霉素、10μg/mll-谷氨酰胺以及memneaa的dmem)中。将骨髓抽出物解离成单细胞悬液，随后通过离心沉淀。通过在低渗缓冲液(135mmnh4cl,17mmtris(ph7.65))中温育细胞悬液，使红血细胞裂解。然后将剩余的细胞置于d10培养基中洗涤，之后用pbs洗涤两次，并保持冷却直到于当天将其移植到rag-1^-/-小鼠体内时。

用350拉德辐照受体rag-1^-/-小鼠(全身照射)。经由尾静脉注射给予受体小鼠1×10⁶个全骨髓细胞。在骨髓细胞移植后24小时时，如实例1中所述，给予小鼠10μg的在300μl玉米油中乳化的tat-myc。经由肌内注射递送tat-myc。

通过对由穿刺尾静脉所获得的外周血样品进行流式细胞术分析(facs)，来监测淋巴区室的重建情况。具体来说，监测样品的表达cd4或cd8的t细胞(tcrβ)、以及b细胞(表达cd19和b220的细胞)的出现。

还测量来自嵌合体小鼠的脾细胞样品对促有丝分裂刺激作出响应的能力。用cfse标记源自脾的t细胞和b细胞，然后用针对cd3(t细胞)的抗体或针对igm和cd40(b细胞)的抗体将所述t细胞和b细胞活化。评估细胞的增殖情况，这在刺激后72小时时使用facs通过cfse信号的稀释所测得。

结果

对各5只小鼠(rag-1^-/-小鼠)的同龄组进行亚致死量辐照，随后移植10⁶个获自雌性c57/bl6供体小鼠的全骨髓细胞。移植受体小鼠要么在24小时后接受tat-myc注射，要么不接受处理。将嵌合体小鼠饲养在生态饲养场中，观察4周。届时，使小鼠安乐死，并收集pbmc和脾。使用脾来生成单细胞悬液。然后，用针对鼠类cd4和cd8的荧光素化的抗体对这些细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。

图5和图6示出新分离的全骨髓移植后，在用tat-myc处理过的小鼠体内t细胞的加速发育。对以c57/bl6为背景的rag-1^-/-小鼠的同龄组进行亚致死量辐照，随后移植1×10⁶个全骨髓细胞。在移植后24小时时，用tat-myc注射移植过的同龄组的一半。

图5a示出未接受辐照、细胞移植，也未用tat-myc处理过的对照rag-1^-/-小鼠体内的外周血cd4和cd8t细胞的水平(0.03％cd4⁺和0.8％cd8⁺细胞)。图5b示出作为对照的未处理过且未被辐照的野生型c57bl/6小鼠体内的外周血cd4和cd8t细胞的水平(13.1％cd4⁺和11.1％cd8⁺细胞)。图5d示出与未注射tat-myc的小鼠(图5c)(4.2％cd4⁺和3.2％cd8细胞)相比，用tat-myc处理过的小鼠的外周血中cd4与cd8t细胞的检测结果(14.9％cd4+和8.6％cd8细胞)。在4周时，在全骨髓移植后24小时时用tat-myc处理过的小鼠具有与野生型c57bl/6小鼠大致相同的cd4和cd8t细胞水平。

图6图解示出以上描述且在图5中示出的整个小鼠同龄组的t细胞百分比。图6a示出在移植后4周时，在野生型c57bl/6体内(第一栏)、经辐照和移植但未用tat-myc处理过的rag-1^-/-小鼠体内(第二栏)、以及经辐照和移植且被注射了10μgtat-myc的rag-1^-/-小鼠体内(第三栏)的外周血中的cd4⁺细胞的百分比。图6b示出在移植后4周时，在野生型c57bl/6体内(第一栏)、经辐照和移植但未用tat-myc处理过的rag-1^-/-小鼠体内(第二栏)、以及经辐照和移植且被注射了10μgtat-myc的rag-1^-/-小鼠体内(第三栏)的外周血中的cd8⁺细胞的百分比。

图7和图8示出新分离的骨髓移植后，在用tat-myc处理过的小鼠体内b细胞的加速发育。对以c57/bl6为背景的rag-1^-/-小鼠的同龄组进行亚致死量辐照，随后移植1×10⁶个全骨髓细胞。在移植后24小时时，用tat-myc注射移植过的同龄组的一半。

图7a示出未接受辐照、细胞移植，也未用tat-myc处理过的对照rag-1^-/-小鼠体内的外周血cd19xb220b细胞的水平(0.2％cd19⁺×b220⁺细胞)。图7b示出作为对照的未处理过且未被辐照的野生型c57bl/6小鼠体内的外周血cd19xb220b细胞的水平(25.8％cd19⁺×b220⁺细胞)。图7d示出与未注射tat-myc的小鼠(图7c)(1.4％cd19⁺×b220⁺细胞)相比，用tat-myc处理过的小鼠的外周血中cd19xb220b细胞的检测结果(5.2％cd19⁺×b220⁺细胞)。在4周时，与未用tat-myc处理过的接受了移植的对照小鼠相比，在全骨髓移植后24小时时用tat-myc处理过的小鼠具有显著更高的cd19×b220b细胞水平。

图8图解示出以上描述且在图7中示出的整个小鼠同龄组的b细胞百分比。图8a示出在移植后4周时，在野生型c57bl/6体内(第一栏)、经辐照和移植但未用tat-myc处理过的rag-1^-/-小鼠体内(第二栏)、以及经辐照和移植且被注射了10μgtat-myc的rag-1^-/-小鼠体内(第三栏)的外周血中的cd19×b220+细胞的百分比。

图9示出在移植了全骨髓且在移植后24小时时用tat-myc进行了处理的嵌合体小鼠体内发育的t细胞和b细胞是有功能的，并且在它们的抗原受体的刺激之后发生增殖。用cfse标记源自脾的t细胞和b细胞，然后用针对cd3(t细胞)的抗体或针对igm和cd40(b细胞)的抗体将所述t细胞和b细胞活化。评估细胞的增殖情况，这在刺激后72小时时使用facs通过cfse信号的稀释所测得。

如图9a所示，来自被移植了1×10⁶个全骨髓细胞但未用tat-myc处理过的小鼠的脾细胞的33.3％表现出t细胞在用抗cd3刺激时成为母细胞(blasting)。来自被移植了1×10⁶个全骨髓细胞且用tat-myc处理过的嵌合体小鼠的脾细胞表现出36.6％的t细胞在cd3刺激后成为母细胞(图9c)。相似地，图9b示出来自被移植了1×10⁶个全骨髓细胞但未用tat-myc处理过的小鼠的脾细胞的6.92％表现出b细胞在用抗cd40和抗igm刺激时成为母细胞。来自被移植了1×10⁶个全骨髓细胞且用tat-myc处理过的嵌合体小鼠的脾细胞表现出15.8％的b细胞在cd40和igm刺激后成为母细胞(图9d)。这些数据表明获自接受了tat-myc处理的hsc嵌合体小鼠的成熟淋巴样细胞在通过其抗原受体活化后能够成为母细胞并发生细胞分裂。

实例3：在用5-氟尿嘧啶处理过的小鼠体内的造血重建诱导

以下实例描述在施用5-氟尿嘧啶(5-fu)(一种已知对造血区室具有毒性的化疗剂)后，用tat-myc融合蛋白处理小鼠的结果。

介绍

用于逆转由各种环境损害或疾病等引起的骨髓衰竭的当前方法基本上依赖于施用生长因子和红血细胞输注来进行支持性治疗。这些方法的最终目标是促使剩余的内源性hsc移动并使造血区室重生(自动重建)。然而，当前方法的效率低下，并且在许多情况下仅将对清髓性骨髓移植的需求延迟。

另外，hsc对化疗药物以及辐射的敏感性历来限制了可被施用于患有例如实体肿瘤的患者的每种疗法的剂量。hsc和造血区室的损耗是癌症患者的治疗相关毒性的早期征兆之一。若能够使hsc区室免受用于癌症的治疗剂损害，则可以显著改变当前用于递送此类治疗的方法。

在用少量供体细胞进行hsc移植的情形中，利用tat-myc的实例1和实例2的以上结果示出tat-myc还可用于促进具有骨髓衰竭综合征的患者体内的造血区室自动重建。虽然无意于受理论的约束，但据信用tat-myc处理将以少量的剩余固有hsc为靶标，并诱导此类hsc分裂并产生分化的造血谱系。

材料与方法

使用4-6周龄的雌性c57/bl6野生型(wt)小鼠的同龄组完成这些实验。单独地用5-氟尿嘧啶(每只小鼠5mg)对5只小鼠的同龄组进行静脉内处理，或之后对每只小鼠用10μgtat-myc或对每只小鼠用10μgtat-cre进行处理(在5fu攻击后24小时时)。两种蛋白质在即将进行肌内注射之前先在玉米油中乳化。在一些实验中，对每只小鼠用10μgtat-myc或tat-cre进行预处理(在5fu攻击前48小时时)。

通过对由穿刺尾静脉所获得的外周血样品进行流式细胞术分析(facs)，来监测淋巴区室的重建情况。具体来说，监测样品的表达cd4或cd8的t细胞(tcrβ)、以及b细胞(表达cd19和b220的细胞)的出现。

结果

用5-氟尿嘧啶进行攻击不仅被用作环境损害的模型，并且更广泛地被用作任何骨髓衰竭的治疗模型。图10、图11和图12示出在5-氟尿嘧啶攻击后24小时时用tat-myc进行处理的小鼠在2周时体内的t细胞的加速自动重建。用5fu攻击c57bl/6小鼠的同龄组，随后要么不加以处理(图10a)，要么在5fu攻击后24小时时肌内注射对照蛋白tat-cre(图10b)或tat-myc(图10c)。

图10a示出在5fu攻击后未接受tat-cre或tat-myc处理的被5fu攻击的c57/bl6小鼠在2周时体内的外周血cd4和cd8阳性t细胞的水平(3.9％cd4⁺和2.4％cd8⁺细胞)。图10b示出在5fu攻击后接受了10μgtat-cre处理的被5fu攻击的c57/bl6小鼠体内的外周血cd4和cd8阳性t细胞的水平(5.5％cd4⁺和2.55％cd8⁺细胞)。图5c示出在5fu攻击后接受了10μgtat-myc处理的被5fu攻击的c57/bl6小鼠体内的外周血cd4和cd8阳性t细胞的水平(14.9％cd4⁺和9.69％cd8⁺细胞)。

图11和图12图解示出以上描述且在图10中示出的整个小鼠同龄组的t细胞百分比。图11示出在5fu攻击后2周时，在未用任一种蛋白处理过的c57bl/6小鼠体内(第一栏)、注射了10μgtat-myc的c57bl/6小鼠体内(第二栏)以及注射了10μgtat-cre的c57bl/6小鼠体内(第三栏)的外周血中的cd4⁺细胞的百分比。图12示出在5fu攻击后2周时，在未用任一种蛋白处理过的c57bl/6小鼠体内(第一栏)、注射了10μgtat-myc的c57bl/6小鼠体内(第二栏)以及注射了10μgtat-cre的c57bl/6小鼠体内(第三栏)的外周血中的cd8⁺细胞的百分比。

在其他实验中，用5-氟尿嘧啶进行攻击被用作防护环境损害(包括用于保护hsc免受化疗或放疗的副作用影响)的模型。

对c57bl/6小鼠的同龄组不进行处理、用tat-myc进行肌内处理或用对照蛋白(tat-cre)进行肌内处理。在24小时后，静脉内施用5mg5-fu。在5fu攻击后的不同时间(任选地第3天、第5天、第7天或更多天)，通过facs分析外周血样品，以评估血液中t细胞(cd4⁺t细胞和cd8⁺t细胞)的频率。用tat-myc或对照蛋白tat-cre预处理的小鼠之间的比较将表明tat-myc是否能够赋予造血谱系化学保护。

实例4：用基因毒性应激剂处理过的小鼠体内的造血重建诱导

在以下实例中，使用了两种形式的针对造血干细胞的基因毒性应激，即化学应激和放射性应激。用tat-myc或对照蛋白处理年龄和性别匹配的c57/bl6小鼠，然后使其暴露于化疗剂诸如(5fu)或环磷酰胺(ctx)，或亚致死剂量的辐射。在暴露于特定的刺激后5-7天时开始监测小鼠外周血中的成熟t细胞和b细胞的频率波动。

tat-myc的使用赋予体内造血谱系化学保护

对10只c57/bl6小鼠的同龄组进行tat-myc注射、阴性对照(如tat-cre)注射或不进行处理。在24小时、48小时或72小时后(任选地在1小时和72小时之间的任何时间点)，我们将对每个同龄组中的5只小鼠用针对每只小鼠5mg5fu或针对每只小鼠4mg环磷酰胺(ctx)进行处理。对所述同龄组中的另外5只小鼠将只进行tat-myc、tat-cre的初始处理，或不进行注射。通过静脉穿刺获得外周血，随后通过facs分析血液中的成熟t细胞和b细胞的频率。

对在用5fu、白消安a或环磷酰胺(ctx)攻击之前用tat-myc处理过的小鼠外周血中的鼠类t细胞和b细胞的频率变化减少进行评估，其与在暴露于这些化疗剂的所有其他小鼠体内观察到成熟t细胞和b细胞的频率显著下降形成对照。作为另一种选择，对恢复在用5fu、白消安a或ctx攻击之前用tat-myc处理过的小鼠外周血中的鼠类t细胞和b细胞的频率的恢复时间缩短进行评估，将其与看到在暴露于这些化疗剂的所有其他小鼠体内观察到的成熟t细胞和b细胞的频率恢复所需要的时间长度进行比较。

另外的研究涉及对用tat-myc处理过的小鼠进行5fu、白消安a或ctx的剂量递增(或递减)处理，以确定tat-myc处理所能够实现的化疗剂的剂量增加参数。

tat-myc的使用赋予体内造血谱系辐射防护

实验设置与如上所述基本相同。唯一的差别是在用tat-myc、tat-cre处理小鼠之后或在不对小鼠进行处理的情况下，将小鼠暴露于一定剂量范围的辐射，而不是化疗剂。因此，可对c57/bl6j小鼠使用350拉德和600拉德的辐射。通过facs监测外周血的成熟淋巴样细胞或骨髓细胞的波动。

对在用亚致死或致死辐射攻击之前用tat-myc处理过的小鼠外周血中的鼠类t细胞和b细胞的频率变化减少进行评估，其与在暴露于辐射的所有其他小鼠体内观察到成熟t细胞和b细胞的频率显著下降形成对照。作为另一种选择，对恢复在用辐射攻击之前用tat-myc处理过的小鼠外周血中的鼠类t细胞和b细胞的频率的恢复时间缩短进行评估，将其与看到在暴露于辐射的所有其他小鼠体内观察到的成熟t细胞和b细胞的频率恢复所需要的时间长度进行比较。

另外的研究涉及对用tat-myc处理过的小鼠进行辐射剂量的剂量递增(或递减)处理，以确定tat-myc处理以及辐射和化疗剂的可能组合所能够实现的辐射的剂量增加参数。

实例5：在不同的施用途径之后小鼠体内的加速造血重建

以下实例描述在新分离的全骨髓移植之后，用肌内或静脉内施用的tat-myc融合蛋白处理小鼠的结果。

材料和方法

如实例2所述的那样进行实验，例外的是使用不同的施用途径提供tat-myc。

简单地说，小鼠供体和受体均以c57bl/6为背景。从获自两只野生型c57/bl6供体小鼠的股骨和胫骨中冲出骨髓细胞。将骨髓抽出物解离成单细胞悬液，通过离心沉淀，随后使红血细胞裂解。然后洗涤剩余的细胞，并保持冷却直到于当天将其移植到rag-1^-/-小鼠体内时。

用350拉德辐照受体rag-1^-/-小鼠(全身照射)。经由尾静脉注射给予受体小鼠1×10⁶个全骨髓细胞。在骨髓细胞移植后24小时时，小鼠接受溶解于200μlpbs中的10μgtat-myc的静脉注射或如实例1所述的乳化于300μl玉米油中的10μgtat-myc的肌内注射。

通过对由穿刺尾静脉所获得的外周血样品进行流式细胞术分析(facs)，来监测淋巴区室的重建情况。具体地讲，监测样品的表达cd4或cd8的t细胞(cd4xtcrβ)、以及b细胞(表达igmxcd19的细胞)的出现。

结果

对各5只小鼠(rag-1^-/-小鼠)的同龄组进行亚致死量辐照，随后移植10⁶个获自雌性c57/bl6供体小鼠的全骨髓细胞。移植受体小鼠要么在24小时后接受tat-myc注射，要么不接受处理。将嵌合体小鼠饲养在生态饲养场中，观察至少4周；届时，通过静脉穿刺获得外周血，并通过facs评估t细胞和b细胞的水平。

图13和图14示出新分离的全骨髓移植后，在用tat-myc处理过的小鼠体内t细胞的加速发育。对以c57/bl6为背景的rag-1^-/-小鼠的同龄组进行亚致死量辐照，随后移植1×10⁶个全骨髓细胞(图13c、图13d和图13e)。在移植后24小时时，同龄组中的移植过的小鼠的三分之二接受10μgtat-myc的静脉注射(图13d)或肌内注射(图13e)。还提供了对野生型(未处理过且未经辐照的)rag-1^-/-小鼠(图13a，0.579％cd4×tcrβ⁺细胞)和c57bl/6小鼠(图13b，17.5％cd4×tcrβ⁺细胞)的facs分析结果作为对照。

图13d和图13e示出与未注射tat-myc的对照(图13c)(6.39％cd4×tcrβ⁺细胞)相比，接受了静脉注射tat-myc(32.8％cd4×tcrβ⁺细胞)或肌内注射tat-myc(18.2％cd4×tcrβ⁺细胞)的小鼠的外周血中cd4×tcrβ⁺t细胞的检测结果。通过任一途径注射的tat-myc导致小鼠具有与野生型c57bl/6小鼠大致相同的cd4×tcrβ⁺t细胞水平。

图14图解示出以上描述且在图13中示出的整个小鼠同龄组的t细胞百分比。图中示出在移植后4周时，在野生型rag-1^-/-小鼠体内(nt)、经辐照和移植且接受了tat-myc的静脉注射的rag-1^-/-小鼠体内(iv)、以及经辐照和移植且接受了tat-myc的肌内注射的rag-1^-/-小鼠体内(im)的外周血中cd4⁺细胞的百分比。

图15和图16示出新分离的全骨髓移植后，在用tat-myc处理过的小鼠体内的b细胞的加速发育。对以c57/bl6为背景的rag-1^-/-小鼠的同龄组进行亚致死量辐照，随后移植1×10⁶个全骨髓细胞(图15c、图15d和图15e)。在移植后24小时时，同龄组中的移植过的小鼠的三分之二接受10μgtat-myc的静脉注射(图15d)或肌内注射(图15e)。还提供了对野生型(未处理过且未经辐照的)rag-1^-/-小鼠(图15a，0.071％igm×cd19⁺细胞)和c57bl/6小鼠(图15b，23.5％igm×cd19⁺细胞)的facs分析结果作为对照。

图15d和图15e示出与未注射tat-myc的对照(图15c)(1.49％igmxcd19⁺细胞)相比，接受了静脉注射tat-myc(图15d，2.41％igmxcd19⁺细胞)或肌内注射tat-myc(图15e，6.53％igmxcd19⁺细胞)的小鼠的外周血中igmxcd19⁺b细胞的检测结果。通过任一途径注射的tat-myc导致小鼠具有比移植了全骨髓但未用tat-myc处理过的rag-1^-/-小鼠更高的igmxcd19⁺b细胞水平。

图16图解示出以上描述且在图15中示出的整个小鼠同龄组的b细胞百分比。图中示出在移植后4周时，在野生型rag-1^-/-小鼠体内(nt)、经辐照和移植且接受了tat-myc的静脉注射的rag-1^-/-小鼠体内(iv)、以及经辐照和移植且接受了tat-myc的肌内注射的rag-1^-/-小鼠体内(im)的外周血中cd19×b220⁺细胞的百分比。

实例6：在移植了用tat-myc和tat-bcl-2扩展的源自人类脐带血的hsc的小鼠体内的加速造血重建

以下实例描述了在将源自脐带血的hsc移植到经亚致死量辐照的小鼠体内之前，使用tat-myc和tat-bcl-2在体外扩展源自脐带血的hsc以形成蛋白转导的长期造血干细胞(ptlt-hsc)的结果。

材料和方法

新鲜的脐带血细胞得自从当地的脐带血库丢弃的样本。所有人类细胞均被消除识别信息且免受irb监督。将脐带血的总体积分成20ml的等分试样，随后在pbs中1:1稀释。将稀释的脐带血(20ml)轻轻地置于20mlficoll-paqueplus(安盛生物科学公司(amershambiosciences)目录号17-1440-03)之上。将细胞在900x重力下离心60分钟。用玻璃吸管移除血沉棕黄层，并用pbs洗涤两次。将细胞重悬于fcb培养基(上文实例1中所述的补充有10％人血浆、100单位/ml青霉素/链霉素、30ml含有scf、il3和il6的培养基以及30ml含有tpo、flt3-l和gm-csf的培养基的iscove培养基(吉必可公司))中。

引发两种fcb扩展培养。第一种培养只包含fcb培养基，而第二种培养包含补充有5μg/ml重组tat-myc和10μg/ml重组tat-bcl-2的fcb培养基。在14天的扩展期间每3天更换一次两种培养的培养基。使用针对人抗原cd45、cd34和cd38的抗体，通过facs分析评估体外扩展的人hsc的表面表型。

将在fcb培养基或补充有tat-myc和tat-bcl2的fcb培养基中扩展的胎儿脐带血细胞(fcb)注射到在即将被注射前接受了180拉德辐射的nod/scid/γc-/-小鼠(nsg)小鼠(杰克森实验室)体内。将扩展的fcb在pbs中洗涤3次，然后经由尾静脉注射200μlpbs中的经扩展fcb。

在移植后八周时，从移植nsg小鼠的胫骨和股骨收集骨髓细胞。通过在5ml无菌tac缓冲液(135mmnh4cl,17mmtris(ph7.65))中温育使红血细胞裂解，然后用d10培养基洗涤两次。通过流式细胞仪，使用针对人抗原cd45、cd34、cd38、cd3、cd19、cd11b和cd33的抗体对骨髓细胞进行分析。

从安乐死的nsg小鼠收集脾和胸腺，并通过机械解离生成单细胞悬液。用tac缓冲液(135mmnh4cl,17mmtris(ph7.65))处理细胞，以使红血细胞裂解。

我们通过将从nsg小鼠的骨髓采集的人hsc接种在methocultoptimum(干细胞技术公司(stemcelltechnologies))上对它们进行了功能测试，并检测了它们产生bfu-e、cfu-m、cfu-g和cfu-gm集落的能力。在采集骨髓之日，将300μld10中的10,000个骨髓细胞添加到4mlmethocult中。将含有骨髓细胞的4mlmethocult平分到2个30mm的盘子中，每个盘子各自包含5000个细胞。将盘子于37°、5％co2中温育14天。使用倒置显微镜，基于细胞形态对集落进行计数和识别。

结果

如图17所示，通过移植在补充有tat-myc和tat-bcl2(ptlt-hsc)的fcb培养基中扩展的hsc而得到的异种嵌合体nsg小鼠表现出骨髓植入增加。在移植后八周时，仅注射了1×10⁶个在fcb培养基中扩展的cd34+/cd38lo细胞的nsg小鼠的骨髓区室的0.03％源自移植的细胞(图17a，第一张小图)。注射了1×10⁶个在补充有tat-myc和tat-bcl2的fcb培养基中扩展的cd34+/cd38lo细胞的nsg小鼠的骨髓区室的18.2％源自移植的细胞(图17a，第二张小图)。将移植了5×10⁶个新鲜脐带血细胞的nsg小鼠用作植入的对照(图17a，第三张小图)，其显示出移植的细胞有2.7％植入。

分析来自通过移植在补充有tat-myc和tat-bcl2的fcb培养基中扩展的hsc而得到的异种嵌合体nsg小鼠的骨髓、脾和胸腺的人cd45+细胞。facs分析显示，骨髓中人cd45+群体的6.8％还呈现造血干细胞标志物cd34染色阳性(图17b，第一张小图)。对来自这些小鼠的脾和胸腺的人cd45+细胞进行b细胞标志物cd19和t细胞标志物cd3的评估。来自脾的大部分人cd45+细胞呈现b细胞标志物cd19染色阳性(图17b，第二张小图，69.2％)，这与t细胞标志物cd3(图17b，第二张小图，7.7％)形成比较。胸腺中的大部分cd45+群体呈现t细胞标志物cd3染色阳性(图17b，第三张小图，91.3％)，这与b细胞标志物cd19(图17b，第三张小图，1.2％)形成比较。

将来自移植了ptlt-hsc的异种嵌合体nsg小鼠的脾的人cd45+和cd19+细胞用cfse标记，随后用针对人cd40和igm的单克隆抗体活化。在72小时时，通过流式细胞仪分析细胞的cfse稀释。图17c示出在异种嵌合体nsg小鼠体内培育的人b细胞的增殖分布。这些结果证明源自接受了用tat-myc和tat-bcl2预处理的移植hsc的b细胞可以凭借它们的b细胞受体而被活化。

使用来自移植了ptlt-hsc的异种嵌合体nsg小鼠的骨髓的人cd45+、cd34+和cd38lohsc在methocultoptimum中接种，以评估是否存在髓红样干细胞。来自移植了ptlt-hsc的nsg小鼠的这些细胞在methocult平板中产生更多的集落(图17d，fcbtmtb)，这与来自只移植了在培养基中扩展的细胞的对照nsg小鼠的细胞(图17d，fcb)形成比较。尽管在对红细胞谱系(bfu-e)、骨髓谱系(cfu-m)、粒细胞谱系(cfu-g)和粒细胞巨噬细胞谱系(cfu-gm)具有选择性的条件下观察到了集落形成，但观察到更多的骨髓和粒细胞生长。此外，在连续重新接种之后仍可以观察到所述集落中的一些(图17e)。对于用tat-myc和tat-bcl-2培养了14天的人脐带血细胞重建过的nsg小鼠而言，两种情况下的集落数量较之得自用新鲜的未处理过的人脐带血细胞重建过的nsg小鼠的细胞显著更高。

这些结果显示，来自移植过的小鼠的骨髓的cd45+、cd34+和cd38lohsc为能够在methocult培养基中产生全部4种集落类型的造血干细胞。另外，在用来自植入了具有tat-myc和tat-bcl2的fcb培养物的nsg小鼠的骨髓接种的平板上观察到集落数量增加反映了驻留在骨髓小生境中的造血干细胞的数量更多。

此外，对植入了10⁶个事先在补充有tat-myc和tat-bcl-2的细胞因子混合物中进行了体外扩展的脐带血细胞的同龄组异种嵌合体小鼠(黑色方块)的骨髓细胞和淋巴样细胞的分化情况进行了评估。分析cd45阳性群体的骨髓细胞(图17f)和脾细胞(图17g)的cd11b、cd33、cd3和cd19表达。在这些异种嵌合体小鼠的骨髓和脾中观察到了骨髓细胞和淋巴样细胞分化。

实例7：在移植了新分离的人全脐带血并注射了tat-myc的小鼠体内的加速造血重建

以下实例描述在移植了新鲜的人脐带血细胞之后用tat-myc融合蛋白处理小鼠的结果。

材料和方法

人脐带血细胞如实例6中所述获得和准备。简而言之，使用聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)和离心法分离脐带血，获得血沉棕黄层级分。移除血沉棕黄层细胞，洗涤两次，然后重悬于pbs中，并保持冷却直到于当天晚些时候将其移植到小鼠体内时。

在对nod/scid/γc^-/-(nog)小鼠注射fcb细胞之前，用180拉德辐照小鼠(全身照射)。然后经由尾静脉注射给予每只受体小鼠由5×10⁵个、1×10⁶个或5×10⁶个人fcb细胞组成的移植物。在骨髓细胞移植后24小时时，小鼠接受在300μl玉米油中乳化的10μgtat-myc或10μgtat-cre的肌内注射。

在移植后八周时，用流式细胞术监测植入情况，以评估异种嵌合体小鼠的外周血、骨髓和脾中是否存在人cd45阳性细胞。

结果

如图18、图19和图20所示，在异种移植新鲜的人胎儿脐带血细胞之后用tat-myc处理过的异种嵌合体nod/scid/γc^-/-小鼠的外周血(图18)、骨髓(图19)和脾(图20)中看到了人细胞的加速发育。对nod/scid/γc^-/-小鼠的同龄组给予亚致死剂量的辐照，然后注射5×10⁵个脐带血细胞(图18a和图18d；图19a和图19d；图20a和图20d)、1×10⁶个脐带血细胞(图18b和图18e；图19b和图19e；图20b和图20e)或5×10⁶个脐带血细胞(图18c和图18f；图19c和图19e；图20c和图20e)。在移植后24小时时，向每个同龄组中的半数小鼠注射tat-myc(图18d、图18e和图18f；图19d、图19e和图19f；图20d、图20e和图20f)，并向另一半小鼠注射对照蛋白tat-cre(图18a、图18b和图18c；图19a、图19b和图19c；图20a、图20b和图20c)。

图18示出作为对照的在异种移植人全脐带血细胞之后用tat-cre处理过的经亚致死量辐照的nod/scid/γc^-/-小鼠在八周时，其外周血中具有的cd45⁺细胞水平为：在移植5×10⁵个细胞后，具有0％的cd45⁺细胞(图18a)；在移植1×10⁶个细胞后，具有0.2％的cd45⁺细胞(图18b)；并且在移植5×10⁶个细胞后，具有0.7％的cd45⁺细胞(图18c)。在异种移植人全脐带血细胞之后用tat-myc处理过的经亚致死量辐照的nod/scid/γc^-/-小鼠在八周时，其外周血中具有的cd45⁺细胞水平为：在移植5×10⁵个细胞后，具有0.09％的cd45⁺细胞(图18d)；在移植1×10⁶个细胞后，具有0.1％的cd45⁺细胞(图18e)；并且在移植5×10⁶个细胞后，具有9.3％的cd45⁺细胞(图18f)。因此，图18f示出移植后8周时嵌合体小鼠的外周血中人t细胞(hcd45阳性细胞)的检测结果。由于t细胞恢复的平均时间为12至20周，所以这表示加速约33-60％。

图19示出作为对照的在异种移植人全脐带血细胞之后用tat-cre处理过的经亚致死量辐照的nod/scid/γc^-/-小鼠在八周时，其骨髓中具有的cd45⁺细胞水平为：在移植5×10⁵个细胞后，具有0.02％的cd45⁺细胞(图19a)；在移植1×10⁶个细胞后，具有7.7％的cd45⁺细胞(图19b)；并且在移植5×10⁶个细胞后，具有11.3％的cd45⁺细胞(图19c)。在异种移植人全脐带血细胞之后用tat-myc处理过的经亚致死量辐照的nod/scid/γc^-/-小鼠在八周时，其骨髓中具有的cd45⁺细胞水平为：在移植5×10⁵个细胞后，具有0.04％的cd45⁺细胞(图9d)；在移植1×10⁶个细胞后，具有8.6％的cd45⁺细胞(图19e)；并且在移植5×10⁶个细胞后，具有20.7％的cd45⁺细胞(图19f)。

图20示出作为对照的在异种移植人全脐带血细胞之后用tat-cre处理过的经亚致死量辐照的nod/scid/γc^-/-小鼠在八周时，其脾中具有的cd45⁺细胞水平为：在移植5×10⁵个细胞后，具有0.9％的cd45⁺细胞(图20a)；在移植1×10⁶个细胞后，具有13.9％的cd45⁺细胞(图20b)；并且在移植5×10⁶个细胞后，具有27.6％的cd45⁺细胞(图20c)。在异种移植人全脐带血细胞之后用tat-myc处理过的经亚致死量辐照的nod/scid/γc^-/-小鼠在八周时，其脾中具有的cd45⁺细胞水平为：在移植5×10⁵个细胞后，具有1.2％的cd45⁺细胞(图20d)；在移植1×10⁶个细胞后，具有4.9％的cd45⁺细胞(图20e)；并且在移植5×10⁶个细胞后，具有258％的cd45⁺细胞(图20f)。

实例8：在移植了用tat-myc和tat-bcl-2预处理过的新分离的人脐带血细胞的小鼠体内的加速造血重建

以下实例描述在将新鲜的人脐带血细胞移植到小鼠体内之前用tat-myc和tat-bcl-2预处理新鲜的人脐带血细胞的结果。

材料和方法

人脐带血细胞如实例6中所述获得和准备。简而言之，使用聚蔗糖-泛影葡胺和离心法分离脐带血，以获得血沉棕黄层级分。移除血沉棕黄层细胞，洗涤两次，然后重悬于pbs中。

在将分离的脐带血细胞注射到小鼠体内之前，使其暴露于5μg/mltat-myc和5μg/mltat-bcl-2，持续1小时。在细胞暴露于融合蛋白之后，用pbs将细胞洗涤两次，然后使细胞以5×10⁶个细胞/200μl的密度重悬于pbs中，并在注射到小鼠体内之前保持冷却。

在对nod/scid/γc^-/-(nog)小鼠注射fcb细胞之前，用180拉德辐照小鼠(全身照射)。然后经由尾静脉注射给予每只受体小鼠由在200μlpbs中的5×10⁶个人fcb细胞组成的移植物。

用流式细胞术监测植入情况，以评估异种嵌合体小鼠的外周血中是否存在cd45阳性细胞。在fcb移植后8周时进行第一次放血。

在八个月之后，对小鼠实施安乐死，并从异种嵌合体nsg小鼠的胫骨和股骨收集骨髓细胞。还摘取脾和胸腺，并通过使细胞在压力作用下穿过无菌丝网筛而将脾和胸腺制成单细胞悬液。使来自骨髓、脾和胸腺的红血细胞在5ml无菌tac缓冲液(135mmnh4cl,17mmtris(ph7.65))中裂解，然后在d10培养基中洗涤两次。使骨髓、脾细胞和胸腺细胞准备好进行fac分析，以评估是否存在人cd45阳性细胞。

结果

图21和图22示出在将新鲜的人全脐带血细胞移植到nod/scid/γc^-/-(nog)小鼠体内之前用tat-myc对新鲜的人全脐带血细胞进行预处理一小时，导致了人cd45细胞在小鼠的外周血中加速发育，以及人cd45细胞在小鼠的骨髓、脾和胸腺中的长期持久性提高。向nod/scid/γc^-/-小鼠的同龄组给予亚致死剂量的辐照，然后给予5×10⁶个脐带血细胞。对每个同龄组中的半数小鼠，用fcb培养基中的5μg/mltat-myc和5μg/mltat-bcl-2对细胞进行预处理(图21b；图22b、图22d和图22f)；对同龄组中的另一半小鼠，在单独的fcb培养基中对细胞进行预处理(图21a；图22a、图22c和图22e)。

图21示出作为对照的异种移植了用单独的fcb培养基预处理过的人全脐带血细胞的经亚致死量辐照的nod/scid/γc^-/-小鼠在八周时，其外周血中具有0.89％的cd45⁺细胞(图21a)。相比之下，异种移植了用fcb培养基中的5μg/mltat-myc和5μg/mltat-bcl-2预处理过的人全脐带血细胞的经亚致死量辐照的nod/scid/γc^-/-小鼠在八周时，其外周血中具有15.7％的cd45⁺细胞(图21b)。

图22示出作为对照的异种移植了用单独的fcb培养基预处理过的人全脐带血细胞的经亚致死量辐照的nod/scid/γc^-/-小鼠在八个月时，其骨髓中具有0.04％的cd45⁺细胞(图22a)，其脾中具有0.03％的cd45⁺细胞(图22c)，并且其胸腺中具有0.5％的cd45⁺细胞(图22e)。相比之下，异种移植了用fcb培养基中的5μg/mltat-myc和5μg/mltat-bcl-2预处理过的人全脐带血细胞的经亚致死量辐照的nod/scid/γc^-/-小鼠在八个月时，其骨髓中具有0.37％的cd45⁺细胞(图22b)，其脾中具有25.2％的cd45⁺细胞(图22d)，并且其胸腺中具有5.4％的cd45⁺细胞(图22f)。

在其他实验中，在将单独的人脐带血细胞群体移植到不同的nog小鼠同龄组中之前，使用5μg/mltat-myc和5μg/mltat-bcl-2对单独的人脐带血细胞群体进行预处理。本发明人预期，用tat-myc和tat-bcl-2单独温育细胞与移植未预处理的同样的细胞的情形相比仍将提供更佳的植入和重建结果。

实例9：用tat-myc和tat-bcl-2培养的由人g-csf动员的外周血hsc的加速植入

将由g-csf动员的细胞接收在来自经受了g-csf动员以便进行自体hsc移植的5名患者的1ml体积的经淘洗血液中。全部g-csf样品均被消除识别信息，并且没有另外的识别信息与用于这些研究的细胞相关。将细胞逐滴加入10mlfcb培养基中。在fcb培养基中将细胞洗涤两次，然后用10ml体积中的5μg/ml重组tat-myc和5μg/ml重组tat-bcl-2进行处理。将细胞培养12天。

使细胞在补充有细胞因子加上tat-myc和tat-bcl2的培养基中扩展12天。在第12天，半数细胞接受用5μg/mltat-myc和5μg/mltat-bcl2进行的额外处理。另一半细胞留在单独的fcb培养基中。将细胞置于37°培养箱中温育60分钟。在pbs中将细胞洗涤三次，随后使细胞以5×10⁶个细胞/200μl的密度重悬。用流式细胞术监测植入情况，以评估异种嵌合体小鼠的外周血中是否存在cd45阳性细胞。在hsc移植后8周时进行第一次放血。

图23a示出来自对照nsg小鼠(图23a)、在8周前移植了1×10⁶个扩展的由g-csf动员的hsc的nsg小鼠(图23b)、或在8周前移植了用tat-myc/tat-bcl-2处理过的1×10⁶个扩展的由g-csf动员的hsc的nsg小鼠(图23c)的外周血的cd45+染色的facs分析结果。本发明人预期，如针对外周血所示出的那样，来自植入了用tat-myc和tat-bcl-2预处理过的由g-csf动员的细胞的小鼠的骨髓、脾和胸腺与移植未预处理的同样的细胞的情形相比将提供更佳的植入和重建结果。

实例10：在移植了用tat-myc和tat-bcl-2预处理过的由人g-csf动员的细胞之后在用tat-myc处理的小鼠体内的加速造血重建

以下实例描述在将由人g-csf动员的细胞移植到小鼠体内之前用tat-myc和tat-bcl-2预处理由人g-csf动员的细胞，接着在24小时以后用tat-myc处理小鼠的结果。

材料和方法

将由g-csf动员的细胞接收在来自经受了g-csf动员以便进行自体hsc移植的5名患者的1ml体积的经淘洗血液中。全部g-csf样品均被消除识别信息，并且没有另外的识别信息与用于这些研究的细胞相关。将细胞逐滴加入10mlfcb培养基中。在fcb培养基中将细胞洗涤两次，然后用10ml体积中的5μg/ml重组tat-myc和5μg/ml重组tat-bcl-2进行处理。将细胞培养12天。

在第12天，在将扩展的由g-csf动员的细胞注射到nsg小鼠体内之前，使扩展的由g-csf动员的细胞接受5μg/mltat-myc和5μg/mltat-bcl2的第二次处理一小时。用pbs将细胞洗涤3次，然后经由尾静脉以在200μlpbs中5×10⁶个细胞/只小鼠的量进行注射。在对nod/scid/γc^-/-(nog)小鼠注射hsc细胞之前，用180拉德辐照小鼠(全身照射)。在注射扩展的hsc后24小时时，小鼠接受玉米油中的10μgtat-myc或10μgtat-cre的肌内注射，或不接受注射。八周后将小鼠放血。

用流式细胞术监测植入情况，以评估异种嵌合体小鼠的外周血中是否存在cd45阳性细胞。在hsc移植后8周时进行第一次放血。

在八周后，对小鼠实施安乐死，并从异种嵌合体nsg小鼠的胫骨和股骨收集骨髓细胞。还摘取脾和胸腺，并通过使细胞在压力作用下穿过无菌丝网筛而将脾和胸腺制成单细胞悬液。使来自骨髓、脾和胸腺的红血细胞在5ml无菌tac缓冲液(135mmnh4cl,17mmtris(ph7.65))中裂解，然后在d10培养基中洗涤两次。使骨髓、脾细胞和胸腺细胞准备好进行fac分析，以评估是否存在人cd45阳性细胞。

结果

数据表明，与注射了tat-cre或未注射tat融合蛋白、但也移植了用tat-myc和tat-bcl-2预处理过的hsc的对照小鼠相比，在将在被移植于nod/scid/γc^-/-(nog)小鼠体内之前用tat-myc和tat-bcl-2预处理一小时的hsc进行移植之后24小时时注射tat-myc未出现人cd45细胞在小鼠的外周血中加速发育。

在八周时，数据显示，用tat-myc和tat-cre处理过的小鼠的外周血中的cd45+细胞水平之间不存在差异。需要进一步的研究来确定在较早或较晚的时间点，或在骨髓、脾和胸腺中是否存在效果。在这一点上，数据表明，用tat-myc预处理细胞与在移植后向小鼠注射tat-myc的效果可能一样好。迄今为止，我们尚未观察到用tat-myc预处理细胞且在移植所述处理过的细胞之后还向小鼠注射tat-myc具有增强的效果。

实例11：生物活性tat-myc和tat-bcl-2融合蛋白的生成

生成了具有hiv-1tat蛋白转导结构域(ptd)以及针对人myc的orf或截短形式的人bcl-2(其已被删除了非结构化的环结构域(anderson,m.,etal.(1999).protexpr.purif.15,162-70(anderson,m.等人，1999年，《蛋白质表达与纯化》，第15卷，第162-170页)))的融合蛋白。重组蛋白还编码v5肽标签和6-his标签，以利于检测和纯化(图24和图25)。

ptat-myc-v5-6xhis(amp^r)和ptat-bcl2δ-v5-6xhis(amp^r)：质粒通过使用编码hiv的符合读框的tat蛋白转导结构域(rkkrrqrrr)(seqidno:5)的正向引物对编码人cmyc或人bcl2的cdna进行pcr扩增来生成。将pcr产物克隆到pet101/d-topo(英杰公司(invitrogen))载体中。使用quickchange定点诱变试剂盒(stratagene#200521-5)将非结构化的环(a.a.#27-80)从编码bcl-2的序列移除。

在大肠杆菌(e.coli)中合成蛋白，并将其纯化为均质。sds-page电泳和考马斯染色揭示我们的研究所用的最终产物的纯度水平(图1b)。将ptat-myc-v5-6xhis转化进bl21-star(de3)细胞(英杰公司)中，随后用0.5mmiptg在37℃下对蛋白质进行诱导3小时。使细胞在裂解缓冲液(8m尿素、100mmnah2po4、10mmtris(ph7.0)、10mm咪唑(ph7.2))中裂解。将裂解物稀释到6m尿素中，随后引入450mmnacl、50mmnah2po4、5mmtris(ph7.0)中。在室温下用benzonase核酸酶(500单位)处理裂解物1小时，接着以12,000rpm离心60分钟并用0.22μμ过滤器过滤使裂解物澄清。使用geakta纯化系统10fplc，将myc-v5-6xhis在镍亲和柱(ge)上进行纯化。通过将myc-v5-6xhis透析到透析缓冲液(450mmnacl、50mmnah2po4、5mmtris(ph7.0)、5％甘油、1mmdtt)中，使myc-v5-6xhis再折叠。通过使经纯化的蛋白穿过acticleanetox柱(sterogen)而使内毒素减少。

如上所述对bcl2δ-v5-6xhis蛋白进行诱导。使细胞在补充有500单位benzonase核酸酶、1mmpmsf、2μg/ml亮抑蛋白酶肽、015单位/ml抑蛋白酶肽、5μm鸡卵溶菌酶(hel)/1l诱导蛋白的50ml裂解缓冲液(200mmnacl、200mmkcl、50mmnah2po4、5mmtris(ph7.0)、5％甘油、immdtt)中裂解，随后立即将其置于冰上保持1小时。在冰上对细胞进行两组超声处理(占空比＝50％，输出＝5)，每组2分钟。通过以12,000rpm离心60分钟随后用0.22μm过滤器过滤而使裂解物变得澄清。将bcl2δ-v5-6xhis在镍亲和柱(ge)进行纯化，内毒素如上所述进行移除。

序列表

<110>泰加生物技术有限公司

<120>造血区室的增强的重建和自动重建

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