一种优化脐带间充质干细胞培养液的制作方法

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种优化脐带间充质干细胞培养液。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,msc)是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，是动物有机体和各种组织器官的起源细胞。新近的研究表明，众多成体组织中(如骨髓、肌肉、胃肠道、皮肤、视网膜、外周及中枢神经系统等)均存在间充质干细胞。mscs它来源广泛、易体外分离扩增，具有向三种胚层细胞分化的多向分化潜能；具有低免疫原性、不能刺激产生同种异体免疫反应、不被细胞毒性t细胞和nk细胞杀伤，“归巢”修复作用，肿瘤趋向性以及免疫调节作用。

研究表明，脐带间充质细胞主要来源于脐带华尔通胶(wharton’sjelly)。uc-mscs的优势在于：①脐带为分娩后的废弃物，取材方便，来源广泛，易于收集、保存、冷冻、不受伦理、道德及法律方面的争论与限制；②相对纯净，与干细胞输注相关的病毒和病原微生物感染率远低于骨髓移植；③人uc-mscs含量丰富，较为原始，分化能力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以为实验和临床提供充足的细胞来源；④人uc-mscs不表达或低表达组织相容性标记，免疫原性低，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，不须经过严格配型即能使用，适宜于不同个体之间的移植；⑤uc-mscs可直接获取于新生儿脐带，进行储存库长期保存，不存在对机体产生创伤。因此uc-mscs已被当做是临床和科研工作中mscs的一个更佳来源。

然而，无论哪一种组织来源的mscs，要为组织工程、修复、肿瘤治疗载体和免疫调节提供种子细胞，都必须以高数量和高纯度的细胞为基础。

现存的问题在于，脐带间充质干细胞易于体外原代细胞的分离扩增培养，还存在脐带间充质干细胞在长期培养扩增中，细胞活性不好，细胞增殖慢，细胞传代次数少，干细胞生物学特性维持不好的问题。

技术实现要素：

本发明的提供一种优化脐带间充质干细胞培养液。

本发明的方案是：

一种优化脐带间充质干细胞培养液，包括含有核糖核苷的基础培养基α

-mem与添加物，所述基础培养基α-mem包括下列成分及其含量如下：

作为优选的技术方案，所述基础培养基α-mem包括下列成分及其含量如下：

作为优选的技术方案，所述添加物包括下列成分及其含量如下：

作为优选的技术方案，所述添加物包括下列成分及其含量如下：

本发明还提供了一种制备所述优化脐带间充质干细胞培养液的方法，取含有核糖核苷的α-mem基础培养基，然后称取100～150mg/l的丙酮酸钠、2000～3000mg/l的hepes、142～292mg/ml的谷氨酰胺、2～5ul/l2-me、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素，一起溶解于注射用水中，将ph调制为7.2～7.4，采用0.2μm平板过滤器过滤后，4℃保存，在使用前加入10～20％胎牛血清，即为完全培养液。

作为优选的技术方案，所述含有核糖核苷的α-mem基础培养基包括下列成分及其含量如下：

本发明还提供了用于脐带间充质干细胞体外扩增培养液，含有如权利要求1所述的含有核糖核苷的基础培养基α-mem与添加物。

由于采用了上述技术方案，一种优化脐带间充质干细胞培养液，取含有核糖核苷的α-mem基础培养基，然后称取100～150mg/l的丙酮酸钠、2000～3000mg/l的hepes、142～292mg/ml的谷氨酰胺、2～5ul/l2-me、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素，一起溶解于注射用水中，将ph调制为7.2～7.4，采用0.2μm平板过滤器过滤后，4℃保存，在使用前加入10～20％胎牛血清，即为完全培养液。

本发明的优点：

本发明使脐带间充质干细胞在体外连续培养中有细胞遗传学稳定性良好、纯度高、活性高、增殖速度快的特点，对脐带间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增有重要的意义。

采用本发明的培养，能够使培养的脐带间充质干细胞成本低，对细胞生物学特性影响小，细胞收获率高，细胞传代次多，生命周期长

本发明中基础培养基为α-mem为含有核糖核苷，除含有细胞生长繁殖所需的基本营养物质，还加入核苷和脱氧核苷，这是细胞合成dna、rna的必须物质，对维持细胞增殖和遗传物质的稳定具有重要的作用，可以供大多数干细胞生长。

本发明所述丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

谷氨酰胺是细胞生长的必须氨基酸，在培养过程中为细胞提供能量，参与蛋白质的合成和核酸代谢。

hepes(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，弱酸，是一种非离子缓冲液，主要作用是稳定培养基ph迅速变动，特别在细胞观察过程中，培养基脱离培养箱5％co2的环境，co2气体逸出，ph迅速升高，加入hepes后可以维持ph7.0左右，具有较好的缓冲能力。

2-me(β-巯基乙醇)是一种还原剂，可防治二硫键被氧化，从而保护蛋白不被破环，特性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用，同时避免过氧化物对培养细胞的损害；另一个重要作用是促进分裂原的反应和dna合成。

这些添加物的加入对细胞增殖有利，从而达成了脐带间充质干细胞分离、扩增培养。

附图说明

图1为脐带间充质干细胞体外原代分离培养第10～14天培养图；

图2为实施例4中实施例3、公司1、公司2的不同培养液细胞增殖对比图；

图3为实施例4中实施例3自配营养液的表面标记物流式分析图；

图4为实施例4中公司1的表面标记物流式分析图；

图5为实施例4中公司2的表面标记物流式分析图。

具体实施方式

为了弥补以上不足，本发明提供了一种优化脐带间充质干细胞培养液以解决上述背景技术中的问题。

一种优化脐带间充质干细胞培养液，包括含有核糖核苷的基础培养基α-mem与添加物，所述基础培养基α-mem包括下列成分及其含量如下：

所述基础培养基α-mem包括下列成分及其含量如下：

所述添加物包括下列成分及其含量如下：

所述添加物包括下列成分及其含量如下：

本发明还提供了一种制备所述优化脐带间充质干细胞培养液的方法，取含有核糖核苷的α-mem基础培养基，然后称取100～150mg/l的丙酮酸钠、2000～3000mg/l的hepes、142～292mg/ml的谷氨酰胺、2～5ul/l2-me、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素，一起溶解于注射用水中，将ph调制为7.2～7.4，采用0.2μm平板过滤器过滤后，4℃保存，在使用前加入10～20％胎牛血清，即为完全培养液。

所述含有核糖核苷的α-mem基础培养基包括下列成分及其含量如下：

本发明还提供了用于脐带间充质干细胞体外扩增培养液，含有如权利要求1所述的含有核糖核苷的基础培养基α-mem与添加物。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：

取含有核糖核苷的α-mem基础培养基，然后称取100mg/l的丙酮酸钠、2000mg/l的hepes、142mg/ml的谷氨酰胺、2ul/l2-me、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素，一起溶解于注射用水中，将ph调制为7.2，采用0.2μm平板过滤器过滤后，4℃保存，在使用前加入10％胎牛血清，即为完全培养液。

所述含有核糖核苷的α-mem基础培养基包括下列成分及其含量如下：

实施例2：

取含有核糖核苷的α-mem基础培养基，然后称取150mg/l的丙酮酸钠、3000mg/l的hepes、292mg/ml的谷氨酰胺、5ul/l2-me、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素，一起溶解于注射用水中，将ph调制为7.4，采用0.2μm平板过滤器过滤后，4℃保存，在使用前加入15％胎牛血清，即为完全培养液。

所述含有核糖核苷的α-mem基础培养基包括下列成分及其含量如下：

实施例3：

取含有核糖核苷的α-mem基础培养基，然后称取120mg/l的丙酮酸钠、2500mg/l的hepes、232mg/ml的谷氨酰胺、4ul/l2-me、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素，一起溶解于注射用水中，将ph调制为7.3，采用0.2μm平板过滤器过滤后，4℃保存，在使用前加入20％胎牛血清，即为完全培养液。

所述含有核糖核苷的α-mem基础培养基包括下列成分及其含量如下：

实施例4：

将实施例3组成的优化自配的完全α-mem培养液和目前市场销售的两家公司的主流干细胞培养液用于脐带间充质干细胞的培养，两家公司分别为公司1、公司2，具体如下：

经过传染病等筛查，签署知情同意书和捐赠协议后的产妇，分娩后无菌收集脐带，去除脐动脉和脐静脉，将脐带组织剪碎成约1mm³的小块，然后接种于含20％的胎牛血清优化自配的实施例3培养液、公司1、公司2培养液的175cm²培养瓶中，置37℃、5％co2的饱和湿度培养箱中培养。3天后全量换液，弃去非贴壁细胞，每隔3～4天半量换液，观察细胞至80-90％融合时，用0.25％胰酶消化传代。采用组织块贴壁法分离原代培养的uc-mscs，组织块贴壁72-96h后细胞开始生长，形成散在的纺锤状细胞。第7-9天细胞数量陡增，细胞呈长梭形。第10～14天，细胞呈片状融合达到80％～90％，呈现规则平行排列生长，细胞的两极有规律地排列成束状，有的呈漩涡状见图(1)

脐带血间充质干细胞在不同的培养液中扩增倍数有显著区别。原代分离培养后，连续传代3次以后观察三种干细胞液不同细胞增殖，可以看出优化的实施例3培养液细胞比公司1、公司2的成品培养液增殖明显。见图(2)，实例中公司1的优于公司2，实施例3自配培养液优于公司1和公司2；公司1，公司2的培养液可以连续传代10次以上，而实施例3自配的培养液可使脐带间充质干细胞连续传代20次以上。

实施例3、公司1、公司2脐带间充质干细胞干性维持，表面标记物流式分析三种培养液培养后的干细胞表面抗原，结果显示，获得的mscs均质性好。均表达cd73、cd105、cd90；不表达cd45,cd34,cd11b,cd19andhla-dr，见图3。

本发明的优化自配的脐带间充质干细胞液其不含任何外源的细胞因子、生长因子等，成本低，对细胞生物学特性影响小(因为加入不同的成分后都会影响细胞的生物学功能如分化功能，免疫调控功能等)，细胞收获率高，细胞传代次多，生命周期长。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。