Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种基于crispr/cas9技术的amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用。
背景技术：
：小鼠amy1基因，位于3号染色体反链上，全长24190bp，其编码唾液腺淀粉酶。唾液淀粉酶长度为511氨基酸，主要参与代谢碳水化合物，起到将淀粉水解为麦芽糖和葡聚糖的作用。唾液淀粉酶作用于a-1，4糖苷键，可将较大分子量且不溶的淀粉分子分解为可溶性的小颗粒(包括淀粉糊精、红糊精和无色糊精)，随后在胃中被胃酸灭活。而唾液淀粉酶的底物—淀粉以及其代谢过程的产物—短链葡萄糖均可起到部分保护唾液淀粉酶免于被胃酸灭活的作用。目前关于amy1的相关研究仍非常有限，根据现有的文献报道显示，amy1主要在唾液腺中表达，在人正常肝组织和大部分的肿瘤组织中并未发现amy1基因的表达，但在某些具有神经内分泌功能的肿瘤，如某些肺腺癌组织中可检测到amy1的表达。临床上在血清样本中对于淀粉酶的检测主要检测胰腺淀粉酶或者胰腺淀粉酶和唾液淀粉酶的总量，淀粉酶水平的轻度升高常被认为与唾液腺疾病有关，而高水平的淀粉酶升高则提示胰腺炎或其他消化道疾病。另一方面，有报道显示amy基因的表达与心理、生理应激有关，而唾液淀粉酶可被用作应激的指标，并有报道认为它可作为交感神经系统活动的无创生物学标志物。因此，从以上报道可以看出，该基因的表达可能与一些消化系统疾病有关。规律成簇间隔短回文重复序列(crispr/cas9)技术是基于对细菌和古细菌中的免疫系统改造而建立，通过导向rna(sgrna)介导核酸内切酶cas9蛋白进行目标dna序列识别并造成dna双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损dna，从而对目标位点实现基因的定点敲除、敲入以及基因修正等多种修饰。由于其具有特异性高，分子构建简单，流程短的特点，近年来crispr/cas9技术获得了快速发展。使用crispr/cas9技术进行基因敲除需要两个关键因素，首先是有效的sgrna引导序列，再就是cas9蛋白的存在。与锌指核酸酶(zfn)技术和类转录样效应因子核酸酶(talen)技术相比，因其靶向编辑目标基因的特异性、高效性和设计的简便性等诸多优点得到越来越广泛的应用，在细菌、哺乳动物细胞以及斑马鱼、小鼠、大鼠等都表现出很强的基因组编辑活性。中国专利文献cn107043787a公开了一种基于crispr/cas9获得marf1定点突变小鼠模型的构建方法。中国专利文献cn104293831a公开了一种基于crispr/cas9基因敲除技术建立高血压小鼠模型的方法。中国专利文献cn105950639a公开了一种金黄色葡萄球菌crispr/cas9系统的制备方法及其在构建基因修饰小鼠模型中的应用。中国专利文献cn106172238a公开了一种利用crispr/cas9基因敲除技术建立mir-124基因敲除小鼠动物模型的方法。但是关于amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法目前还未见报道。技术实现要素：本发明旨在基于crispr/cas9技术提供一种amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用；本发明通过crispr/cas9技术通过体外转录的方式，获得cas9mrna和sgrna构建稳定敲除amy1基因小鼠模型，第一次成功构建了该动物模型，为进一步研究amy1的功能奠定了良好的基础。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：第一方面，本发明涉及一种amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：s1，确定amy1基因的特异性靶位点sgrna1和sgrna4，并与cas9核酸酶体外转录成mrna；s2，将有活性的sgrna1、sgrna4和cas9rna显微注射入小鼠受精卵中，获得amy1基因敲除小鼠；所述sgrna1如seqidno:1所示，所述sgrna4如seqidno:2所示。优选的，步骤s2包括以下步骤：s21，小鼠促排卵和体外受精，培育受精卵；s22，将有活性的sgrna1、sgrna4和cas9rna显微注射到小鼠受精卵中；s22，受精卵体外培养、植入受体及靶向基因修饰动物的培育。优选的，步骤s22包括以下步骤：s221，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为f0代小鼠；s222，提取f0代小鼠尾部dna，pcr扩增并将产物送测序；s223，将阳性f0代小鼠与野生型异性小鼠交配获得f1代杂合子小鼠；s224，将f1代杂合子小鼠杂交获得f2代纯合子小鼠，即为小鼠动物模型。优选的，所述阳性f0代小鼠amy1基因删除了3.1kb个碱基。更优选的，所述阳性f0代小鼠amy1基因删除的碱基序列如seqidno.8所示。优选的，所述pcr扩增采用amy1-seq-f+amy1-seq-r2nn引物对；引物amy1-seq-f的序列如seqidno.3所示；引物amy1-seq-r2nn的序列如seqidno.4所示。优选的，所述f2代纯合子小鼠基因组序列如seqidno.9。优选的，用amy1-seq-f+amy1-seq-r2nn和amy1-wt-f+amy1-seq-r2nn两对引物对f2代小鼠进行pcr检测，鉴定出f2代纯合子小鼠；引物amy1-seq-f的序列如seqidno.3所示；引物amy1-seq-r2nn的序列如seqidno.4所示；引物amy1-wt-f的序列如seqidno.5所示。第二方面，本发明涉及一种基于crispr/cas9基因敲除技术构建sqstm1基因敲除小鼠模型的sgrna，包括sgrna1和sgrna4，所述sgrna1如seqidno:1所示，所述sgrna4如seqidno:2所示。第三方面，本发明涉及一种amy1基因打靶载体，所述载体是基于crispr/cas9系统的sgrna表达载体，sgrna的作用位点的序列如seqidno:1和seqidno:2所示。第四方面，本发明涉及一种前述的sgrna在构建糖尿病或代谢综合征相关的基因敲除小鼠动物模型中的用途。上述的amy1基因敲除小鼠动物模型可用于糖尿病或其他代谢综合征相关的研究中。本发明具有如下有益效果：本发明首次构建成功amy1基因敲除小鼠，可为糖尿病或其他代谢综合征的相关研究提供新的研究方向。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1：amy1基因敲除小鼠构建方案示意图；图2：amy1基因敲除区域；图3：鉴定引物设计原理；图4：f0代小鼠pcr检测结果；图5：f0代小鼠基因部分测序结果；图6：f0代小鼠基因部分测序对比截图；图7：f1代小鼠pcr检测结果；图8：f1代小鼠基因部分测序对比截图；图9：f2代小鼠pcr检测结果。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。一、amy1基因敲除小鼠的构建方案，示意图如图1所示；(1)构建针对amy1基因的特异性靶点sgrna1和sgrna4。线性化及纯化dna并在体外转录为mrna。所述amy1的sgrna1序列如seqidno.1所示；所述amy1的sgrna4序列如seqidno.2所示；grna序列信息及转录产物浓度表如表1：表1grna名称grna序列(5'to3')grna浓度amy1-grna1ggtcgggaaggctccaatttagg(seqidno.1)5350ng/μlamy1-grna4gttacagtctactaaagtcaagg(seqidno.2)5450ng/μl(2)将步骤(1)所述的纯化sgrna1和sgrna4与cas9核酸酶mrna体外转录，显微注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到代孕母鼠子宫，孕育出生的小鼠即为f0代小鼠。(3)待f0代小鼠出生10天后剪尾提取dna进行pcr鉴定，并测序。得到的f0阳性小鼠amy1基因删除了3.1kb个碱基(excon4-excon6)如图2所示，删除序列如seqidno.8；其中，seqidno.8：caatttaggtaatctccgtcttagtggcatcaaggtcaaagtctggatcagcctgcttcaaggctgagggaggctacaattatatacatggtagtttggggaaagcatttgacatgtggttttattttccttagttaacatagtataggaggtagaaactaagattaatattcataaacctgtccacagtcatttgatggctcagggaaggtgttaaaatataatgtatatatatttatatatacataatatataatttatatataatatgtcaatatatatgtttcattagtgtgctgcatagtttaaccagcttaattttaggactctaagctgcattcaagtacacattcttctcttcaggtccgtatttatgtggatgctgtcattaaccacatgtgtggagtgggggctcaagctggacaaagcagtacatgtggaagttatttcaacccaaataacagggactttcctggagttccctattctggttttgactttaatgatggaaaatgtagaactgcaagtggaggtatcgagaactaccaagatgctgctcaggtgaggaaaacgatcagaattaaaaatgaaatcagggacttcttatgcacatggaccttttggaataccatttgacatgtggtttagactccttatattactaggagttagaaatgcaaatcaatcttcatcaaccttctcctagtttcttgatggttcaagaaaggtgctaaatactaaaagatttatgttttaatcatgcagtacataagagaagaaaaaaaaaagggaaaaaaaggacacaaaagggtttcctcaattaattaataatattatcgattttatttatgcctcatccatacatgatagtggaaaatattcgaagggcgtatccacagtaggatgtggatgttcccagttttccatgaaaagactttatgaagattttttattggttattatatctatttacatttcaaatatcattctccttcctggtttcccctttgcaaacctcctatcccatccccctccccactgcttttatgagggaactcccccacccatccacccactccagcctcactgcccaagcattcccctaccctggggcatcaagcctccactggatcaagggcctcccttcctactgatgccagaaaaggcagtcctctgtgacatgtgcagctggagccatgggtctctccaggtgtattctttggttggtggtttagtccctgggaactctggaggggcttgttggttgatattgttgttcttcctatggggttgcaaatcccttcagctcctcagtccttcttctaagtgctccattggggtccctgtgctcagttccatggtgggctgcgagcatccacacctgtatttgtcaggttctggcagagccatatcaggctccagtcaggaagtgcttcttggcaataatatctgggtttggtgtcagcagatgggatggatcactaggtggggcagtatctggatcgcctttcctttactccctgctatactctttgtccctgaatttcttttagacagaaacaattctggattaatatttttgagatgtgtgggtggccccatacctcaattgggtctgtacctaacctatggatataatctttacaggttctctagaccaatcagtgaatacttgtttagttgaaggagatctctggtaacggatgatatttatatattaaacacagttttgtttagtgtgtgtttcttaacaggtcagagattgtcgtctgtctggccttctggatcttgcacttgagaaagattatgttcgaaccaaggtggctgactatatgaaccatctcattgacattggcgtagcagggttcagacttgatgcttctaagcacatgtggcctggagacataaaggcaattttggacaaactgcataatctcaatacaaaatggttctcccaaggaagcagacctttcattttccaagaggtaatataatacatatatgtatgtataaaattacattgttttgttaaacagaagatagatggaagattgtattaaacacaatttaataagttaatgtctgagtgctttataaatgtgcaatttctttaactcccatttatttagatatagacttaattgtttaccagagtaaaggtataagggaatgtagagaatgtatttatcctgtgacattattgtactacttagtgtatactcagggaccattatgcaatatcttagctgctgacacaagtcagtttttctaggcttaattcttgtcttaaatattgttaaatgaataaatttttgattaatatttctgtgggcattttttcatgtgaagaacattaataatgtttgtatttgtcttctttggagaatctaatgaatttgtaagtgctgaaattgtttatctgacagtaattactttattagtataaatatctgaattttcaattatatgttaagtgaaatatgtcagctatttttactggacaaaaatgatattgtcattacatttctttcggtaccaatgttaataaaggaattaagaaaaccacattgaacatgaacagtataagaaatttataggatattatttttatattaaatattttaatatcattttgttcaatgacagtttccccctatttctctactaggtgattgatctgggtggtgaggcagtgtcaagtaatgagtattttggaaatggccgtgtgacagaattcaaatatggagcaaaattgggcaaagttatgcgcaagtgggatggagaaaagatgtcctacttaaagtaaatacatcccactttgtcatttttttctgtcatagatctgttcccatattatcccattacatattcatcttatacaattctaatttattgaatatttatcaaaacattagctattaagcaggctgattgccctctaaacaattaaaatcatctggaattaataaatttcattttaaatatcagtaacaaggaggttttctagtaacacaaaacatcacctacagatttttttttctgtctttgatatgaatttactagattttagtagttacagtctactaaagtc(4)把上述步骤(3)得到的f0代阳性小鼠与野生型小鼠交配获得f1代杂合子小鼠。(5)将f1代杂合子小鼠杂交获得f2代纯合子小鼠，即为amy1基因敲除小鼠动物模型。二、阳性f0代小鼠pcr鉴定方法及结果：(1)鉴定引物设计原理：如图3。(2)引物信息如表2：表2(3)反应体系如下表3：表3注：taqpcrmastermix(sangonbiotech，cat.no.：b639295)(4)反应条件如下表4：表4(5)基因型判断标准如下表5：表5注：两对引物需要分别进行pcr。(6)f0代小鼠鉴定报告：对f0代小鼠用引物amy1-seq-f+amy1-seq-r2nn进行pcr检测，结果参见电泳图：图4，由图4可知，杂合子小鼠会在400bp的位置出现条带，而野生型小鼠则不会产生条带，因此，f0代小鼠中杂合子有5只，编号别为777，779，781，783，786；编号778，780，782，784，785小鼠为野生型；选择鉴定出的阳性founder小鼠779#进行基因测序，结果如图5和图6，图5为779#小鼠部分基因测序结果，基因序列如seqidno.6；图6为779#小鼠基因测序结果与野生型小鼠基因测序结果对比截图，证明f0代杂合子小鼠amy1基因敲除。其中，seqidno.6：agcactgttccaacttagcctgtatcctaccgaacctccagcaacacttttaaaaaatgaagtttaaagccagtgctagcataaatacctgttgctcaccgtgcccaataggatcctctgattctttccttcccttggagctccatacaagacagtgactccctcagtgtttcctcaccgttcccaatgtccctggtttgaacgtcaatctgtcatatgccgccgggcccgcggcctacaagaaccagatatacctgggaggcaggctgaggctgaaaaagacttagacggcgagagagattaatggagaccaagacatgattctgttcaaggcccccgattttactcagaaactgtgcttataaagggggaagccccccaccccacgcccaccccccaccagtccattcttggtgtctggagccagcctgcaggcgtcgtgcaggataggatgttcctccagaatatctcagggacctctcagcaggtagcagtgtcttggaggagtgcagtggcaggtgacagaacaatagagctatctaggtcgggaaggctcaaggtattacttgaacaattctactactcacaaataaaactgcaacgtggtcctactattgcacttctatatacactgtaaaaaattaacttgaaatatttgctcatcacacagagt三、f1代小鼠获得及基因型鉴定(1)选取阳性的f0代阳性小鼠与野生型c57bl/6j小鼠交配，获得的f1代杂合子小鼠，敲除类型为：删除3.1kb个碱基序列；鉴定方法同f0代小鼠鉴定。(2)f1代小鼠鉴定报告：对所得的f1代小鼠用引物amy1-seq-f+amy1-seq-r2nn进行pcr检测，结果参见电泳图：图7，由图7可知，编号5016，5018，5019，5020的f1代小鼠为杂合子，而编号5014，5015，5017，5021小鼠为野生型，其中p代表阳性对照，n为阴性对照，b为空白对照。将鉴定出的f1代杂合子小鼠进行基因测序，结果比对截图：图8，杂合子小鼠测序结果完全相同，且与779#小鼠一致。杂合子小鼠部分基因组序列如seqidno.7。其中，seqidno.7：agcactgttccaacttagcctgtatcctaccgaacctccagcaacacttttaaaaaatgaagtttaaagccagtgctagcataaatacctgttgctcaccgtgcccaataggatcctctgattctttccttcccttggagctccatacaagacagtgactccctcagtgtttcctcaccgttcccaatgtccctggtttgaacgtcaatctgtcatatgccgccgggcccgcggcctacaagaaccagatatacctgggaggcaggctgaggctgaaaaagacttagacggcgagagagattaatggagaccaagacatgattctgttcaaggcccccgattttactcagaaactgtgcttataaagggggaagccccccaccccacgcccaccccccaccagtccattcttggtgtctggagccagcctgcaggcgtcgtgcaggataggatgttcctccagaatatctcagggacctctcagcaggtagcagtgtcttggaggagtgcagtggcaggtgacagaacaatagagctatctaggtcgggaaggctcaaggtattacttgaacaattctactactcacaaataaaactgcaacgtggtcctactattgcacttctatatacactgtaaaaaattaacttgaaatatttgctcatcacacagagt四、将f1代杂合子小鼠杂交获得f2代纯合子小鼠，即为amy1基因敲除小鼠动物模型，f2代纯合子小鼠基因组全长序列如seqidno.9。五、f2代纯合子小鼠的鉴定：(1)鉴定方法同f0代小鼠鉴定；(2)f2代小鼠鉴定报告：用引物amy1-seq-f+amy1-seq-r2nn和amy1-wt-f+amy1-seq-r2nn进行pcr检测，结果参见电泳图：图9；由图9可知，野生型小鼠只会在300bp位置产生条带，纯合子小鼠只出现400bp大小的条带，杂合子两种条带都能产生，因此，f2代中野生型小鼠编号为6573和6577；杂合子小鼠编号为6571，6575，6576，6578；纯合子为6572和6574。六、结果分析野生型：amy1-seq-f+amy1-seq-r2nn不能获得条带；amy1-wt-f+amy1-seq-r2nn可以获得300bp片段杂合子：amy1-seq-f+amy1-seq-r2nn获得400bp片段；amy1-wt-f+amy1-seq-r2nn获得300bp的片段。纯合子：amy1-seq-f+amy1-seq-r2nn获得400bp片段；amy1-wt-f+amy1-seq-r2nn不能获得条带。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。序列表<110>上海交通大学<120>amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用<130>kag41479<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggtcgggaaggctccaatttagg23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gttacagtctactaaagtcaagg23<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aaaagacttagacggcgagagagat25<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ttggatattgcactctgtgtgatga25<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aagcaggctgattgccctctaaaca25<210>6<211>673<212>dna<213>小鼠(musmusculus)<400>6agcactgttccaacttagcctgtatcctaccgaacctccagcaacacttttaaaaaatga60agtttaaagccagtgctagcataaatacctgttgctcaccgtgcccaataggatcctctg120attctttccttcccttggagctccatacaagacagtgactccctcagtgtttcctcaccg180ttcccaatgtccctggtttgaacgtcaatctgtcatatgccgccgggcccgcggcctaca240agaaccagatatacctgggaggcaggctgaggctgaaaaagacttagacggcgagagaga300ttaatggagaccaagacatgattctgttcaaggcccccgattttactcagaaactgtgct360tataaagggggaagccccccaccccacgcccaccccccaccagtccattcttggtgtctg420gagccagcctgcaggcgtcgtgcaggataggatgttcctccagaatatctcagggacctc480tcagcaggtagcagtgtcttggaggagtgcagtggcaggtgacagaacaatagagctatc540taggtcgggaaggctcaaggtattacttgaacaattctactactcacaaataaaactgca600acgtggtcctactattgcacttctatatacactgtaaaaaattaacttgaaatatttgct660catcacacagagt673<210>7<211>673<212>dna<213>小鼠(musmusculus)<400>7agcactgttccaacttagcctgtatcctaccgaacctccagcaacacttttaaaaaatga60agtttaaagccagtgctagcataaatacctgttgctcaccgtgcccaataggatcctctg120attctttccttcccttggagctccatacaagacagtgactccctcagtgtttcctcaccg180ttcccaatgtccctggtttgaacgtcaatctgtcatatgccgccgggcccgcggcctaca240agaaccagatatacctgggaggcaggctgaggctgaaaaagacttagacggcgagagaga300ttaatggagaccaagacatgattctgttcaaggcccccgattttactcagaaactgtgct360tataaagggggaagccccccaccccacgcccaccccccaccagtccattcttggtgtctg420gagccagcctgcaggcgtcgtgcaggataggatgttcctccagaatatctcagggacctc480tcagcaggtagcagtgtcttggaggagtgcagtggcaggtgacagaacaatagagctatc540taggtcgggaaggctcaaggtattacttgaacaattctactactcacaaataaaactgca600acgtggtcctactattgcacttctatatacactgtaaaaaattaacttgaaatatttgct660catcacacagagt673<210>8<211>3091<212>dna<213>小鼠(musmusculus)<400>8caatttaggtaatctccgtcttagtggcatcaaggtcaaagtctggatcagcctgcttca60aggctgagggaggctacaattatatacatggtagtttggggaaagcatttgacatgtggt120tttattttccttagttaacatagtataggaggtagaaactaagattaatattcataaacc180tgtccacagtcatttgatggctcagggaaggtgttaaaatataatgtatatatatttata240tatacataatatataatttatatataatatgtcaatatatatgtttcattagtgtgctgc300atagtttaaccagcttaattttaggactctaagctgcattcaagtacacattcttctctt360caggtccgtatttatgtggatgctgtcattaaccacatgtgtggagtgggggctcaagct420ggacaaagcagtacatgtggaagttatttcaacccaaataacagggactttcctggagtt480ccctattctggttttgactttaatgatggaaaatgtagaactgcaagtggaggtatcgag540aactaccaagatgctgctcaggtgaggaaaacgatcagaattaaaaatgaaatcagggac600ttcttatgcacatggaccttttggaataccatttgacatgtggtttagactccttatatt660actaggagttagaaatgcaaatcaatcttcatcaaccttctcctagtttcttgatggttc720aagaaaggtgctaaatactaaaagatttatgttttaatcatgcagtacataagagaagaa780aaaaaaaagggaaaaaaaggacacaaaagggtttcctcaattaattaataatattatcga840ttttatttatgcctcatccatacatgatagtggaaaatattcgaagggcgtatccacagt900aggatgtggatgttcccagttttccatgaaaagactttatgaagattttttattggttat960tatatctatttacatttcaaatatcattctccttcctggtttcccctttgcaaacctcct1020atcccatccccctccccactgcttttatgagggaactcccccacccatccacccactcca1080gcctcactgcccaagcattcccctaccctggggcatcaagcctccactggatcaagggcc1140tcccttcctactgatgccagaaaaggcagtcctctgtgacatgtgcagctggagccatgg1200gtctctccaggtgtattctttggttggtggtttagtccctgggaactctggaggggcttg1260ttggttgatattgttgttcttcctatggggttgcaaatcccttcagctcctcagtccttc1320ttctaagtgctccattggggtccctgtgctcagttccatggtgggctgcgagcatccaca1380cctgtatttgtcaggttctggcagagccatatcaggctccagtcaggaagtgcttcttgg1440caataatatctgggtttggtgtcagcagatgggatggatcactaggtggggcagtatctg1500gatcgcctttcctttactccctgctatactctttgtccctgaatttcttttagacagaaa1560caattctggattaatatttttgagatgtgtgggtggccccatacctcaattgggtctgta1620cctaacctatggatataatctttacaggttctctagaccaatcagtgaatacttgtttag1680ttgaaggagatctctggtaacggatgatatttatatattaaacacagttttgtttagtgt1740gtgtttcttaacaggtcagagattgtcgtctgtctggccttctggatcttgcacttgaga1800aagattatgttcgaaccaaggtggctgactatatgaaccatctcattgacattggcgtag1860cagggttcagacttgatgcttctaagcacatgtggcctggagacataaaggcaattttgg1920acaaactgcataatctcaatacaaaatggttctcccaaggaagcagacctttcattttcc1980aagaggtaatataatacatatatgtatgtataaaattacattgttttgttaaacagaaga2040tagatggaagattgtattaaacacaatttaataagttaatgtctgagtgctttataaatg2100tgcaatttctttaactcccatttatttagatatagacttaattgtttaccagagtaaagg2160tataagggaatgtagagaatgtatttatcctgtgacattattgtactacttagtgtatac2220tcagggaccattatgcaatatcttagctgctgacacaagtcagtttttctaggcttaatt2280cttgtcttaaatattgttaaatgaataaatttttgattaatatttctgtgggcatttttt2340catgtgaagaacattaataatgtttgtatttgtcttctttggagaatctaatgaatttgt2400aagtgctgaaattgtttatctgacagtaattactttattagtataaatatctgaattttc2460aattatatgttaagtgaaatatgtcagctatttttactggacaaaaatgatattgtcatt2520acatttctttcggtaccaatgttaataaaggaattaagaaaaccacattgaacatgaaca2580gtataagaaatttataggatattatttttatattaaatattttaatatcattttgttcaa2640tgacagtttccccctatttctctactaggtgattgatctgggtggtgaggcagtgtcaag2700taatgagtattttggaaatggcc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