一种基于Fe3O4@C纳米颗粒的miRNA光学传感检测方法与流程

本发明属于环境监测技术领域，涉及一种基于fe3o4@c纳米颗粒的mirna光学传感检测方法。

背景技术：

随着我国工业的不断发展，空气、水、土壤均受到了各种环境污染。很多环境污染物具有富集性的特点使其难以在环境中被降解，进入生态系统后就会存留、积累和迁移，从而造成危害，还可通过富集作用进入人体产生毒性作用。抗生素进入机体细胞后，会刺激细胞产生外生性的ros。ros会攻击dna，造成dna氧化损伤。产生肿瘤这种恶性病变，使得肿瘤疾病标志物mirna产生过量。因此，监测mirna是对环境污染造成的疾病预防和治疗的重要手段。然而，由于生物体中存在高浓度的其他干扰核酸成分，对mirna的高选择性和灵敏检测仍然是一个具有挑战性的研究领域。

常规的mirna检测方法，如pcr法和定量pcr法等，普遍存在抗干扰能力差，前期操作复杂等问题，这使得它们不适合进行实时在线连续检测。近些年来，生物传感技术因其具有传统mirna检测技术所不具备的诸多优点，例如便于携带、仪器设备简单、检测成本相对偏低，发展迅速。此外，还具有灵敏度好、线性范围宽、抗干扰能力强等优点，更重要的是它为实现自动化实时在线监测提供了可能。

近些年来，基于纳米材料构建的传感方法作为一种新型的分析方法，同时具有操作简便、灵敏度高、特异性好、响应速度快等优点，在分析领域展现出广阔的应用前景。研究者已经成功利用纳米材料构建了一系列针对mirna检测的传感平台(anal.chem.2016,88,4254-4258；anal.chem.2014,86,2124-2130)，信号响应方式包括电化学、光电、光学等。其中，光学检测方法因设备简单、易于微型化且灵敏度高，已经成为一种极具应用潜力的分析方法。目前，各类光学传感器被研究用于mirna的检测，并获得了很好的检测效果(anal.chem.2019,91,3374-3381；acsappl.mater.interfaces2014,6,1152-1157)。荧光传感方法的基本原理是利用荧光基团和淬灭剂两者之间随距离变化的荧光共振能量转移(fret)作用，进而通过荧光信号的变化来实现目标物的检测(angewandtechemie-internationaledition,2009,48(26):4785-4787)。但这些基于物理吸附原理构建的荧光传感方法存在着非特异性置换、解吸效率低等固有缺陷，在一定程度上影响了mirna的检测灵敏度。近年来，基于催化发卡自组装的dna纳米技术，因具有能实现无酶辅助条件的信号扩大能力，被广泛应用于荧光传感方法的构建中(anal.chem.2015.87(10):5430-6.)。但由于大多数的淬灭探针淬灭效率低，荧光传感器仍存在相对较高的荧光背景。所以，发展一种新的低背景、高响应的光学传感方法用于检测mirna具有重要的意义。

磁性纳米颗粒是一类主要由金属氧化物组成的具有磁性效应的纳米材料，因具有强的分离物质的能力、简单的分离流程、大的比表面积等优点，在传感领域表现出巨大的应用潜力(anal.chem.2016,88,4254-4258)。本发明为了避免物理吸附型荧光传感方法的固有缺陷，利用新兴的fe3o4@c纳米颗粒，设计了基于催化发卡自组装共价偶联磁性纳米颗粒荧光传感方法，有效地避免传统物理吸附型荧光传感方法背景信号高、解吸效率低等缺陷，强化了目标物诱导的信号响应程度，提高了目标物的检测性能，该方法操作简单，实用性强，应用前景非常广泛。因此，本发明利用催化发卡自组装共价偶联fe3o4@c纳米颗粒实现了对mirna光学传感检测，该方法制备的传感器对于mirna的检测，响应快速且具有高灵敏度和高选择性，应用前景广泛。

技术实现要素：

本发明解决了传统方法特异性差、耗时、抗干扰性差、背景信号高及响应信号弱等不足，提供了一种简单、快速、高选择性的准确检测mirna的方法。

本发明中，催化发卡自组装偶联磁性纳米颗粒的设计中，设计了三条核酸序列，其中信号分子可以通过杂交氨基修饰的核酸分子共价偶联至fe3o4@c纳米颗粒上，可以有效地避免传感检测过程中的非特异性置换等问题，并且利用fe3o4@c纳米颗粒强淬灭能力，降低物理吸附型荧光传感方法的背景信号。且在mirna存在的条件下，利用催化发卡自组装的循环扩增，提高了mirna诱导的信号响应效率。反应体系的荧光强度在一定范围内与mirna的浓度正相关，从而为mirna的定量分析提供依据。而设计的信号分子具有特异性识别能力，可以保证应用于mirna检测的特异性。

本发明的技术方案：

1.一种基于fe3o4@c纳米颗粒的mirna光学传感检测方法，其特征在于，催化发卡自组装及偶联磁性纳米颗粒的设计，步骤如下：

(1)设计一段含有mirna部分互补的核酸序列h1作为主体；设计核酸序列h3并共价偶联至磁性纳米颗粒，形成淬灭探针；设计带有荧光修饰的核酸序列h2作为信号分子，其部分序列与核酸序列h1部分序列互补，其部分序列与h3互补，且互补后荧光可被淬灭探针淬灭；

(2)将核酸序列h1与不同浓度的mirna混合在5℃-60℃条件下孵化至完成杂交反应；

(3)将信号分子h2与淬灭探针混合至完成杂交反应；

(4)将步骤(2)和步骤(3)混合，完成竞争杂交反应；

(5)将磁铁类物质粘贴在装有步骤(4)反应后溶液的器皿外壁，实现固液分离，并获取上清溶液；测量上清溶液的荧光强度，完成细胞外检测。

2.一种基于fe3o4@c纳米颗粒的mirna光学传感检测方法，其特征在于，催化发卡自组装及偶联磁性纳米颗粒的设计，步骤如下：

(1)设计一段含有mirna部分互补的核酸序列h1作为主体；设计核酸序列h3并共价偶联至磁性纳米颗粒，形成淬灭探针；设计带有荧光修饰的核酸序列h2作为信号分子，其部分序列与核酸序列h1部分序列互补，其部分序列与h3互补，且互补后荧光可被淬灭探针淬灭

(2)将信号分子h2与淬灭探针在5℃-60℃条件下混合至完成杂交反应；

(3)将步骤(2)中的杂交反应后的溶液与核酸序列h1混合，并一起转染至细胞中，洗去未转染溶液，继续孵化细胞；

(4)观察步骤(3)中细胞的荧光强度随时间的变化，完成细胞内检测。

本发明的有益效果：

(1)利用碳材料的强淬灭能力，通过共价偶联核酸的方式,降低了荧光背景值。

(2)利用磁性纳米颗粒与信号分子分离，促进信号分子的解吸,提高了荧光恢复效率。

(3)利用催化发卡自组装的循环扩增，增强荧光恢复效率，提高对mirna的检测性能。

(4)该荧光传感器在体外实现了对mirna的高灵敏度、高选择性检测，并成功实现了人体细胞内的实际检测应用。

附图说明

图1是本发明所述的基于fe3o4@c纳米颗粒的mirna光学传感检测方法设计过程与检测机理示意图。

图例：

图2是本发明的方法获得的纳米光学传感器应用于mirna的标准工作曲线。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案具体说明本发明的具体实施方式。

实施例1

配置水样中mirna的测定：

(1)催化发卡自组装核酸的设计：h1设计为主体，h2作为信号分子，h3修饰氨基共价偶联到fe3o4@c纳米颗粒表面，形成淬灭探针。将序列不同的底物链h1、h2和h3分别稀释至43μm，150nm及100nm，分别放入水浴锅中，加热至95℃，保持5-10min后自然冷却至室温；

(2)淬灭探针的制备：fe3o4@c纳米颗粒和edc在4-50℃条件下混合20min；再加入nhs，其中fe3o4@c纳米颗粒质量、edc的摩尔和nhs的摩尔三者比例为0.02g:0.0004mol:0.0001mol；混合后，在4-50℃条件下，fe3o4@c纳米颗粒表面基团活化1h；活化后的fe3o4@c纳米颗粒与h3混合，在4-50℃条件下，孵化24h形成共价偶联形成淬灭探针(h3-fe3o4@c)；其中活化后的fe3o4@c纳米颗粒质量与h3的摩尔比为0.02g:0.000000043mol；

(3)信号分子与淬灭探针的结合：在20-37℃温度条件下，荧光修饰的h2继续与h3-fe3o4@c一起孵化24h，形成h2/h3-fe3o4@c，其中h3-fe3o4@c的质量与h2的摩尔比为0.001g:0.0000000001875mol，水洗三次，留底物h2/h3-fe3o4@c加bis-trisbuffer并置于-4--20℃的条件下冷冻保存；

(4)mirna体外检测：将h2/h3-fe3o4@c、h1与待测mirna缓冲液混合，其中，h3-fe3o4@c的质量和h1的摩尔比为0.000037g:0.000000000005mol，混合物在25-37℃下反应2-4h后，转移到石英比色皿中，加入水，记录体系荧光强度随发射波长的变化曲线；

核酸设计如下：

(5)标准工作曲线的绘制：

步骤(4)中随着样品中mirna浓度的增加，反应体系在荧光基团吸收峰处的荧光强度不断增加，在225fm到225pm范围内，反应体系的荧光强度与mirna浓度有良好的线性关系，线性相关系数r²＝0.99(图2)。

实施例2

细胞内mirna的测定：

(1)催化发卡自组装核酸的设计：h1设计为主体，h2作为信号分子，h3修饰氨基共价偶联到fe3o4@c纳米颗粒表面，形成淬灭探针。将序列不同的底物链h1、h2和h3分别稀释至43μm，150nm及100nm，分别放入水浴锅中，加热至95℃，保持5-10min后自然冷却至室温。

(2)淬灭探针的制备：fe3o4@c纳米颗粒和edc在4-50℃条件下混合20min；再加入nhs，其中fe3o4@c纳米颗粒质量、edc的摩尔和nhs的摩尔三者比例为0.02g:0.0004mol:0.0001mol；混合后，在4-50℃条件下，fe3o4@c纳米颗粒表面基团活化1h；活化后的fe3o4@c纳米颗粒与h3混合，在4-50℃条件下，孵化24h形成共价偶联形成淬灭探针(h3-fe3o4@c)；其中活化后的fe3o4@c纳米颗粒质量与h3的摩尔比为0.02g:0.000000043mol；

(3)信号分子与淬灭探针的结合：在20-37℃条件下，荧光修饰的h2继续与h3-fe3o4@c一起孵化24h，形成h2/h3-fe3o4@c，其中h3-fe3o4@c的质量与h2的摩尔比为0.001g:0.0000000001875mol，水洗三次，留底物h2/h3-fe3o4@c加bis-trisbuffer并置于-4--20℃的条件下冷冻保存；

(4)mirna细胞内检测：将h2/h3-fe3o4@c、h1与细胞混合孵化4h，用pbs缓冲液洗涤三次，继续培养细胞，观察细胞的荧光强度随时间的变化；

核酸设计如下：

(5)观察细胞荧光强度的变化；

步骤(4)中样品在0-24h内随着时间的增加，反应体系的荧光强度不断增加。