一种分泌抗大黄鱼免疫球蛋白T单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法

本发明属于单克隆抗体制备的技术领域，具体涉及一种分泌抗大黄鱼(larimichthyscrocea)igt单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术：

大黄鱼(larimichthyscrocea)是我国特有经济鱼种，也是目前我国海水养殖鱼类产量最高的鱼种，2017年产量超过17万吨（2018中国渔业统计年鉴），被农业部列为八大最具优势的出口水产品之一。随着我国海水养殖业的快速发展，养殖规模不断扩大及养殖环境日益恶化，养殖病害防治问题日益突出，成为水产科研工作者的研究重点。从鱼类自身的免疫能力出发来研究其抵御疫病侵袭的机理，不仅有助于认识脊椎动物免疫系统的进化规律及特点，而且有助于促进鱼类疫苗的研制和发展。鱼类是最早出现免疫球蛋白的脊椎动物，虽然与哺乳动物的免疫系统相比还较原始，但是已经形成包括非特异性免疫反应、抗原特异性的细胞免疫和体液免疫等比较完善的免疫应答系统。

免疫球蛋白(immunoglobulin,ig)是鱼类特异性免疫中关键的分子。igt则是硬骨鱼类中新近发现的一类免疫球蛋白分子，具有与哺乳动物iga类似的结构和功能；igt在肠、皮肤、鳃和鼻黏液中以二聚体形式存在，并通过肠、皮肤或鳃上皮细胞表达的多聚免疫球蛋白受体转运至黏液中，其主要参与鱼类局部黏膜免疫应答（zhangya,salinasi,andsunyerjo.recentfindingsonthestructureandfunctionofteleostigt[j].fishandshellfishimmunology,2011,31:627-634.）。借助抗大黄鱼igt单克隆抗体，可进行大黄鱼igt+b淋巴细胞分选，将为大黄鱼b淋巴细胞的功能及相关免疫学机制研究奠定基础。此外，鱼类感染病原或接种疫苗后，鱼类黏液中产生针对该抗原的特异性抗体，也可以通过该单克隆抗体进行特异性抗体效价检测（zhangya,salinasi,lij,etal.igt,aprimitiveimmunoglobulinclassspecializedinmucosalimmunity[j].natureimmunology,2010,11(9):827）。因此，利用抗大黄鱼igt单克隆抗体，通过检测大黄鱼黏液中该特异性igt的效价，可进行大黄鱼疾病的诊断和疫苗使用效果的评价，对大黄鱼疾病的研究及防治具有重要理论和现实意义。然而，目前尚未见报道大黄鱼igt单克隆抗体的研制。

技术实现要素：

本发明的目的在于为了解决利用单克隆抗体研究大黄鱼免疫球蛋白结构与功能，将单克隆抗体用于大黄鱼病原微生物检测，协助鱼病诊断与防治等，提供抗大黄鱼igt单克隆抗体及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗大黄鱼免疫球蛋白t（igt）的单克隆抗体杂交瘤细胞株igt-6，所述杂交瘤细胞株igt-6已于2019年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:c2019215，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。

所述杂交瘤细胞株igt-6和抗大黄鱼igt单克隆的制备方法按以下步骤实现：

1）制备免疫原-重组大黄鱼igt蛋白；

在步骤1）中，所述制备免疫原的具体方法可为：根据大黄鱼igt的全基因序列设计一对特异性扩增igt重链胞外区的引物，采用pcr法扩增igt重链胞外区，扩增产物回收纯化后，用同源重组酶将其连接到线性化的表达载体pet32a（+）上，构建表达载体pet32a（+）-igt重链胞外区，并将其转化到感受态细胞e.colitrans5α。挑取单菌落后提取质粒，经pcr鉴定为阳性的质粒送去测序，测序为阳性的质粒，转化到大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞中，经iptg诱导后，经sds-page鉴定发现表达的重组igt蛋白大小为29kda，与预期相符，且主要以可溶性的形式存在。将低温破碎的可溶性表达菌液上清与镍介质结合后，采用不同梯度的低浓度咪唑洗涤杂蛋白，最终用高浓度咪唑洗脱获得高纯度的重组igt蛋白。

所述一对特异性扩增igt重链胞外区的引物为上游引物f:5’-aattcgagctccgtcgacacacttcatttgctccagaggta-3’，下游引物r：5’-ctcgagtgcggccgcattagataagatctttagatgcctt-3’；

所述iptg诱导可采用0.5mmol/liptg在16℃诱导表达12h；

所述不同梯度的低浓度咪唑洗涤杂蛋白为采用20mmol/l、30mmol/l、40mmol/l和50mmol/l咪唑洗涤5次，每次10ml的量孵育5min。所述高浓度咪唑洗脱可采用300mmol/l咪唑洗脱至考马斯亮蓝染色不变蓝为止。

2）制备杂交瘤细胞株igt-6；

在步骤2）中，所述制备杂交瘤细胞株igt-6的具体方法可为：将纯化的重组igt蛋白与（不）完全佐剂弗氏佐剂混匀，作为抗原免疫balb/c小鼠，以骨髓瘤细胞sp2/0与产生抗大黄鱼igt抗体的小鼠脾细胞融合，获得分泌抗大黄鱼igt抗体的杂交瘤细胞株igt-6。

3）制备一种抗大黄鱼igt的单克隆抗体。

在步骤3）中，所述制备一种抗大黄鱼igt的单克隆抗体的具体方法可为：将杂交瘤细胞株igt-6使用有限稀释法和间接elisa两种方法结合，筛选出分泌抗大黄鱼igt单克隆抗体的杂交瘤细胞株igt-6，得到单克隆抗体。

本发明所述大黄鱼igt单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株igt-6产生的、对大黄鱼igt具有特异性的抗体。该细胞分泌的免疫球蛋白能够高效特异性结合大黄鱼igt，最高效价达到1：16000。

本发明所述有限稀释法与间接elisa方法分别用于获得分泌单一抗体的杂交瘤细胞株和检测抗体效价，均为业内常用方法。

本发明的有益效果在于：本发明是将纯化的重组igt蛋白免疫动物，取其产生抗大黄鱼igt单克隆抗体的脾细胞（取自经抗原免疫的动物）与骨髓瘤细胞融合获得能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株能分泌抗大黄鱼igt的单克隆抗体。此抗体特异性高，灵敏度高，可用于大黄鱼igt的结构分析、免疫应答水平检测、病原诊断以及进一步免疫学研究等，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1:western-blot检测单克隆抗体特异性；

m:标准分子量；泳道1：重组igt蛋白；泳道2：对照蛋白trx。

图2：流式细胞仪检测单克隆抗体标记的淋巴细胞；

图a：无关同型一抗对照标记的腮淋巴细胞样品；图b：igt-6单克隆抗体标记的腮淋巴细胞样品；igt-6单克隆抗体可以特异性标记大黄鱼头腮淋巴细胞中的igt+b细胞。

图3：免疫荧光标记大黄鱼淋巴细胞。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

抗大黄鱼igt单克隆抗体的制备方法按以下步骤实现：

一、免疫原的制备

根据大黄鱼igt的全基因序列设计一对特异性扩增igt重链胞外区的引物：

上游引物f:5’-aattcgagctccgtcgacacacttcatttgctccagaggta-3’，

下游引物r：5’-ctcgagtgcggccgcattagataagatctttagatgcctt-3’；

采用pcr法扩增igt重链胞外区扩增产物回收纯化后，用同源重组酶（全式金公司，北京，cu201-02）将其连接到表达载体pet32a（+）上，构建表达载体pet32a（+）-igt胞外区，并将其转化到感受态细胞e.colitrans5α。挑取单菌落后提取质粒，经pcr鉴定为阳性的质粒送去测序，测序为阳性的质粒，转化到大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞中，经0.5mmol/liptg16℃诱导表达12h后，经sds-page鉴定发现表达的重组igt蛋白大小为29kda，与预期相符（图1），且主要以可溶性的形式存在。将冰浴上破碎的可溶性表达菌液，10000rpm离心5min取上清，与镍介质于4℃结合20min后，用20mmol/l、30mmol/l、40mmol/l和50mmol/l咪唑洗涤5次，每次10ml的量孵育5min，洗涤杂蛋白，最终用300mmol/l咪唑洗脱脱至考马斯亮蓝染色不变蓝为止，收集高纯度的重组igt蛋白保存于-80℃冰箱。

igt重链胞外区碱基序列如下：

acttcatttgctccagaggtatctttgctatcagggccaagaggagacactcagacactggtgtgtacaattgagaattttttgccaaaagagttctcagtcaaatggaaaaagaatggaaatgatgtaactggctcctttgattctgatcccaaaaccaatggagagacatattcagctctcagtaccctgaacatcaagaacacagactgggacagtaaagctgtttacacgtgtgaggtgacacacagacaaaaaacatatacgaggaaggcatctaaagatcttatc。

二、动物免疫

取体重为10~12g的12周龄的spf雌性balb/c小鼠5只进行免疫；首次免疫用重组igt蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合，混匀振荡器乳化完全后，以100µg/只的剂量进行背部皮下多点注射，每间隔2周换用重组igt蛋白与等体积弗氏不完全佐剂进行加强免疫，每次剂量为100µg/只；第四次免疫后，采集血清测定血清效价，加强免疫直至血清效价达到1:100000为止；在融合前三天以100µg的重组igt蛋白进行强化免疫。

三、杂交瘤细胞株的建立

1、骨髓瘤细胞悬液的制备

融合前48h，将10⁵个sp2/0骨髓瘤细胞扩大培养于直径为9cm的细胞培养皿中，每块加10ml含10%血清dmem培养液，置于37℃、5％co2培养箱中培养；融合当天，选择形态良好、呈对数生长的sp2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于50ml离心管内，1000r/min离心5min，弃上清；用不完全dmem培养液混匀细胞后计数，取所需细胞数，用不完全dmem培养液洗2次，以10ml不完全dmem培养液重新悬浮备用。

2、饲养细胞的制备

在融合前2d，取1只健康未免疫6周龄的雌性balb/c小鼠，拉颈脱臼处死，将小鼠尸体于75%v/v酒精中浸泡消毒5min，随即移入无菌操作台内，腹部朝上固定在解剖板上；在小鼠左侧腹壁剪一小口，撕开皮肤，用灭菌镊子提起腹膜，用注射器注射5ml不完全dmem培养基于腹腔内抽取巨噬细胞后，将巨噬细胞溶液转至50ml离心管中，加不完全dmem培养液至20ml，混匀；1000r/min离心5min，弃上清；沉淀细胞再用不完全dmem培养液同法离心洗涤一次；先用5mlhat培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，作细胞计数，然后根据细胞计数结果，补加hat培养液至30ml，使细胞浓度为2×10⁵个/ml；将细胞悬液滴于10块96孔细胞培养板中，每孔50μl，然后将培养板置37℃、含5%co2培养箱内培养24h后观察细胞生长状态，细胞呈多形性，贴壁，折光性好时即可使用。

3、免疫淋巴细胞与sp2/0骨髓瘤细胞的融合

取加强免疫3d后的babl/c小鼠，摘除眼球采血；按照上述的操作方法制备脾细胞悬液；将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的比例混合在一起，转入50ml离心管内，1000r/min离心10min，弃上清，用滴管吸净残留液体；用滴管轻轻搅动沉淀，使其松散均匀成糊状；在37℃水浴中融合：一手均匀地转动离心管，另一手用吸管吸取peg4000溶液1ml，并沿转动的管壁（尽量接近细胞处）加入，从加入到加完的时间控制在1min左右，边加边搅动，用吸管在1min内加入1ml预热至37℃不完全dmem培养液，重复3次，往后每分钟加入3ml，直至加满到25ml为止（注意此时操作应轻柔，边转动边加，尽量不搅散细胞）；37℃培养箱静置10min，800r/min离心10min，弃上清；加入10mlhat培养液，轻轻吹吸混匀；根据所用96孔培养板的数量，按一块96孔培养板用液15ml计算补加hat培养液至所需的量；将融合好的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，每孔150µl（相当于3滴），37℃、5%co2培养箱内培养。

4、杂交瘤细胞的选择性培养及观察

将融合后的细胞悬浮于hat培养液中，置于37℃、5%co2的培养箱内培养。根据情况，每5d半换液1次，第11d改换同量的ht培养液，维持2周。仔细观察融合细胞的生长情况，凡有污染的孔立即滴加1%的naoh，以免污染扩散，如果细胞生长太慢可补加1次饲养细胞。细胞融合后的3d内不提倡在co2培养箱外长时间的观察，因为培养箱外温度和co2浓度的不适会影响融合细胞的生长。

5、阳性杂交瘤细胞的筛选

待融合后的细胞克隆生长到覆盖细胞孔底部l/10时，用间接elisa方法对所有克隆生长的培养上清进行检测，检测为阳性的细胞进行克隆并扩大培养，选出阳性和特异性最强的孔进行克隆，并注意随时冻存保种。用间接elisa方法和系列稀释法进行筛选，经过4次亚克隆，直至所有克隆化细胞检测阳性率为100%，获得1株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

6、阳性杂交瘤细胞的克隆

对筛选所获得的阳性杂交瘤细胞孔以有限稀释法进行克隆，以获取能稳定分泌抗体的单克隆孔。具体步骤如下：

克隆前2d，按上述方法制备小鼠饲养细胞；将96孔细胞培养板中抗体分泌阳性的杂交瘤细胞集落（强阳性孔）吹起，混匀，取适量细胞悬液至一无菌ep管中，做适当稀释，将上述ep管中细胞计数，计算细胞密度；按照有限稀释方法对杂交瘤细胞株进行亚克隆至96孔板内静置培养，且适时观察细胞的生长状况，待细胞集落生长到孔底1/10面积时半换液，并用所换出的培养液上清进行抗体检测；选择od值高、细胞活力好、只有一个细胞集落的孔再次克隆和亚克隆，同时每次将克隆剩余细胞转入24孔细胞培养板培养（并在原孔中补加另一批培养基，以防二者同时污染或细胞死亡），继而转入6孔板和普通细胞培养皿中进行扩大培养，并及时冻存；经过多次克隆操作，直至所有克隆的细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，及时进行扩大培养并冻存。

四、腹水的制备及纯化

选取12周龄spf雌性balb/c小鼠腹腔注射0.4ml/只的液体石蜡；1周后每只小鼠注射5×10⁵个杂交瘤细胞；至10~12d，观察小鼠腹部明显隆起时，抽取腹水，离心后吸取上清液，小管分装保存于-80℃。

腹水的纯化：取上述制备的腹水3ml，加入0.06mol/l，ph4.8的醋酸缓冲液6ml，混匀后在室温下边搅拌边加入99μl辛酸，持续搅拌30min，然后置于4℃静止2h以上。将溶液4℃，1000rpm离心30min，取上清，用2mol/l的naoh调节ph值至7.4，往上清溶液中边搅拌边加入等体积的饱和硫酸按溶液，30min后，4℃静止2h以上。10000rpm离心30min，取沉淀溶于5ml0.01m，ph7.4的pbs中，混匀后置入0.01m的pbs中透析，4℃透析2d，每8h换一次液，2d后取出透析袋中的溶液，收集后经紫外分光光度计测定其蛋白含量后，按5mg/ml分装冻存于-80℃。

五、单克隆抗体的生物学特性的鉴定：

1、单抗效价的测定

采用间接elisa方法测定。用纯化的重组igt蛋白包被酶标板，将腹水从1:100倍开始做倍比稀释，同时以阴性腹水做同等稀释度作为对照，以平行稀释的单抗od450nm/对照od450nm比值大于2的最高稀释倍数为单抗的效价。经测定其效价为1：16000。

2、单抗亚型的鉴定

按sigma公司的mousemabisotypingtestkit(10assaykit)的说明书进行结果确定单克隆抗体的亚型为igm。

3、单抗特异性鉴定

（1）western-blotting鉴定单抗

将从含重组igt蛋白的凝胶转移至pvdf膜，然后进行以下操作：

封闭：电转完毕后，将pvdf膜作好标记，放入大小适当的玻璃平皿中，用5%脱脂奶粉-tbst25℃封闭30min；以tbst洗涤3次，每次10min；加一抗：将1:2000的单抗腹水加入1%脱脂奶粉-tbst中，加入量以完全覆盖膜为准并尽量排出气泡，37℃摇床孵育1h；同上洗涤；加二抗：将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ig抗体（1：3000稀释）加入1%脱脂奶粉-tbst中，37℃摇床孵育1h；同上洗涤；显色：把pvdf膜用去离子水水稍加漂洗，在暗室里将ecl试剂盒中的a液和b液等体积充分混匀。将ecl混合液体覆盖到pvdf膜上吸附了蛋白的一面，室温下(25℃)反应1min，弃去反映液，滤纸贴角吸干。暗室中将pvdf膜膜置于压片盒中的两层保鲜膜中间，其中吸附有蛋白质的一面朝上，平整地放置在压片盒中，并在其上放置同等大小的底片，压片1min（根据实际效果调整时长）。将曝光的胶片放在显影液中显影3min，经过清水冲洗除去显影液后将胶片浸没在定影液中1min。

结果显示：重组蛋白的跑道出现一条特异性条带表明单抗与29kda的重组igt蛋白发生特异性反应，而对照蛋白trx跑道未见明显的条带，说明单抗不与对照蛋白trx发生反应（图1）。

（2）流式细胞仪检测荧光：

取健康大黄鱼的8片腮，用10ml0.3mg/ml胶原酶于4℃消化2h，置于70μm网筛过滤后离心取细胞沉淀，用含0.3mg/ml肝素钠的pbs重悬后，铺于含51%/34%percoll的离心管内，400g，4℃离心30min，收集相应细胞层即为腮白细胞。

1）2%bsa4℃封闭30min；

2）取粗提的白细胞1×10⁶个，用100μl含1:200apc-igt单克隆抗体重悬，4℃孵育0.5h；

3）2%bsa重悬450g，4℃离心洗涤3次，每次5min；

4）2%bsa重悬，细胞悬液经70μm网筛过滤后，上流式细胞仪检测。

结果显示，与阴性对照相比，单克隆抗体标记了14%左右的细胞具有荧光，本发明制备的单克隆抗体可以特异性识别大黄鱼腮白细胞中的b淋巴细胞（图2）。

（3）直接免疫荧光实验：

取健康大黄鱼的腮，用10ml0.3mg/ml胶原酶于4℃消化2h，置于70μm网筛过滤后离心取细胞沉淀，用含0.3mg/ml肝素钠的pbs重悬后，铺于含51%/34%percoll的离心管上层，400g，4℃离心30min，收集相应细胞层即为腮白细胞。

1）粗提的白细胞约2×10⁵铺在35mm玻底培养皿上，爬片3h；

2）弃培养基，pbs洗一次；

3）以4%多聚甲醛固定10min，pbs洗一遍；

4）2%bsa封闭30min；

5）以100μl含1:200apc-igt单克隆抗体于4℃孵育0.5h；

6）pbs洗3次，每次5min；

7）以2μg/mldapi染色2min；

8）pbs洗3次，每次5min，进行激光共聚焦拍照

结果显示，阳性细胞为直径3μm左右的圆形细胞，细胞核较大，细胞周围一圈有红色荧光。阴性细胞为不带红色荧光的细胞，包括与阳性细胞形态接近的t淋巴细胞、igm+b淋巴细胞等（图3）。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>一种分泌抗大黄鱼免疫球蛋白t单克隆抗体的杂交瘤细胞株

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<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工序列

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gtgtgtacaattgagaattttttgccaaaagagttctcagtcaaatggaaaaagaatgga120

aatgatgtaactggctcctttgattctgatcccaaaaccaatggagagacatattcagct180

ctcagtaccctgaacatcaagaacacagactgggacagtaaagctgtttacacgtgtgag240

gtgacacacagacaaaaaacatatacgaggaaggcatctaaagatcttatc291