本发明涉及单克隆抗体领域，特别地涉及一种抗人cd28单克隆抗体及其用途。
背景技术：
：cd28和ctla-4是为人熟知的两种重要共刺激分子。ctla-4和cd28有着约20％的同源性，结构上也较为相似，结合相同的配体b7-1/b7-2。cd28能启动初始t细胞的活化、分泌il-2促进t淋巴细胞的扩增，从而有效地强化抗原特异性应答中t细胞的功能，而ctla-4则能平衡cd28介导的信号，防止淋巴细胞过度激活。但人们发现cd28缺失的小鼠仍能产生一定的免疫应答。hutloff等发现了一种结构和功能与cd28相似的分子，其表达受到tcr信号的诱导，局限于活化后的t细胞上，故命名为诱导共刺激分子icos(inducibleco-stimulate)。该分子与cd28、ctla4具有一定的同源性，故被归cd28家族。其配体b7h，b7-h2，gl50和b7-1/b7-2也具有较高同源性，被归为b7家族。目前研究结果表明，icos是一种重要的共刺激分子，它在t细胞增殖和活化中，在th1、th2效应细胞发挥作用的过程中以及在t/b细胞协同作用、抗体产生和类型转换中，均发挥着至关重要的作用。多种疾病的动物模型研究表明，以icos途径为靶点的免疫调节对包括自身免疫性疾病和移植免疫的长期耐受的形成均有着重要的临床治疗意义。目前，未有针对icos靶点开发的药品上市，icos的有效性亟待验证，icos是肿瘤微环境中一种新的免疫检查点抑制剂，也是肿瘤免疫治疗的新靶点，临床上亟待有效的icos抗体药物。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗人cd28单克隆抗体及其用途。本发明是以如下技术方案实现的：一种抗人cd28单克隆抗体，所述抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区；所述轻链可变区包含氨基酸序列如seqidno:1所示的cdr-l1，和/或氨基酸序列如seqidno:2所示的cdr-l2，和/或氨基酸序列如seqidno:3所示的cdr-l3；所述重链可变区包含氨基酸序列如seqidno:4所示的cdr-h1，和/或氨基酸序列如seqidno:5所示的cdr-h2，和/或氨基酸序列如seqidno:6所示的cdr-h3，所述抗原结合片段为特异性结合人cd28的抗原结合片段。进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列是与seqidno.7、9、10所示任一氨基酸序列具有至少95％同一性且保留相应生物活性的变体序列或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应生物活性的变体序列。进一步地，其中所述轻链可变区的氨基酸序列是与seqidno.8、11、12所示任一氨基酸序列具有至少95％同一性且保留相应生物活性的变体序列或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应生物活性的变体序列。进一步地，其中所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno.7、9、10任一项所示和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.8、11、12任一项所示。进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno.10所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.12所示。进一步地，所述抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab)'2、单链fv(scfv)、fv片段、双功能抗体及线性抗体。进一步地，所述抗原结合片段包含选自人抗体igg1、igg2、igg3、igg4的任一fc端的氨基酸序列。进一步地，所述抗原结合片段的生产步骤包括在培养基中和合适的培养条件下培养含有编码权利要求1-7所述抗原结合片段核苷酸序列的宿主细胞。进一步地，其中所述抗体、其抗原结合片段或其变体与至少一种诊断剂和/或治疗剂偶联以形成免疫偶联物；优选地，所述诊断剂选自金属、荧光标记、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂中的一种或多种；优选地，所述治疗剂选自另一抗原结合片段、细胞毒素剂、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、免疫偶联物、寡核苷酸中的一种或多种。本发明还提供一种抗人cd28单克隆抗体的用途，包括从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的权利要求1-9所述抗体及其抗原结合片段并与药学上可接受的载体制成药物用于治疗肿瘤的用途，所述肿瘤为实体瘤；优选地，所述肿瘤为乳腺癌、结直肠癌、白血病、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌；更优选地，所述肿瘤为卵巢癌。具体实施方式定义本领域公知，抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。除非另外指明，否则术语“抗体”还包括抗体样多肽，如通过任何已知技术(如酶促切割、肽合成和重组技术)提供的嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体、产生于转基因非人类动物的人抗体、选自利用本领域技术人员可使用的富集技术产生的库的抗体以及保留与抗原结合能力的抗体片段(抗原结合片段)。这样产生的抗体可以具有任何同种型。抗体的结合特异性及亲合力均主要由cdr序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非cdr区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。“可变”是指在抗体间，可变域的某些区段的序列显著不同的事实，所述高度可变区为各3至12个氨基酸长度，其主要采取β折叠构型且由三个高度可变区连接，这些高度可变区形成环，所述环连接β折叠结构及在一些情况下形成β折叠结构的一部分。各链中的高度可变区是由fr紧挨着结合在一起，而与其他链的高度可变区有助于形成抗体的抗原结合位点(kab.，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))，恒定域不直接决定抗体对抗原的结合。“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构域，因此术语“抗原结合”与“表位结合”以及“抗体的抗原结合片段”与“抗体的表位结合片段”是相同的。抗原结合片段可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个cdr域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。优选地，抗原结合片段含有所述抗体的所有6个cdr域。抗体的抗原结合片段可以是单条多肽链(例如，scfv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端，例如，双抗体、fab片段、fab2片段等)的一部分或包含两条或更多条多肽链。igg是免疫球蛋白g(immunoglobuling，igg)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据igg分子中的r链抗原性差异，人igg有四个亚型：igg1、igg2、igg3、igg4。“单克隆抗体”是指获得自大体上均质的抗体的群体的抗体，即组成该群体的抗体除了个别抗体可少量存在的可能天然生成的突变外均相同。单克隆抗体是高度特异性的，是指针对单一抗原位点。此外，相对于包括针对不同决定子(抗原决定基)的不同抗体的多克隆抗体制剂，各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。除单克隆抗体的特异性外，单克隆抗体的有利的处在于其可经合成而不被其他抗体污染。术语“嵌合抗体”，是指其中部分重链和/或轻链与来自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列是相同或同源的，而链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段的相应序列是相同的或同源的抗体，它们展现出期望的生物学活性。术语“多克隆抗体”是指包括抗不同决定簇(“表位”)的不同抗体的制备物。常规的单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。本发明的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、噬菌体展示系统、酵母、植物细胞、动物细胞。术语“特异性地结合”是指，抗体或其抗原结合片段“特异性地结合”另一分子的区域，具体地，是指相对于另外的表位与该表位更加频繁地、更加快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力或亲合力反应或结合。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段以至少10-7m的亲和力结合抗原，例如10-8m、10-9m、10-10m、10-11m或更高。优选地，抗体或其抗原结合片段在生理条件下(例如，在体内)结合。因此，特异性地结合到抗原是指该抗体或其抗原结合片段以上述特异性和/或在这样的条件下结合到抗原上的能力，适合于确定所述结合的方法是本领域已知的。术语“结合”通常是指以对应于约10-6m或更小的kd的亲和力结合，该kd比该抗体对与除指定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原结合的亲和力低至少10倍，如低至少100倍、至少1,000倍。如本文所用，术语“kd”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数，所述值又称为koff值。如本文所用，术语“ka”(m-1xsec-1或1/msec)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数，所述值又称为kon值。。如本文所用，术语“kd”(m)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数并且通过kd除以ka获得。如本文所用，术语“ka”(m-1或1/m)是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数并且通过ka除以kd获得。术语“人源化”是指通常使用重组技术制备的具有衍生自来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构的分子。抗原结合位点可以包含融合至人恒定区的完全非人抗体可变区，或仅包含连接到人可变区的适当人框架区的此类可变区的互补决定区(cdr)。人源化减小或消除该分子的恒定区充当人体中的免疫原的可能性(lobuglio,a.f.等人，(1989)，mouse/humanchimericmonoclonalantibodyinman:kineticsandimmuneresponse，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)，86:4220-4224)。另一种方法不仅关注于提供衍生于人的恒定域，还关注于修饰可变区以便将它们改造地尽可能接近于人源化形式，例如使用回复突变方法。已知重链和轻链的可变区都含有三个互补决定区(cdr)，它们特异于相应抗原且改变并决定结合能力，其侧翼为四个框架区(fr)，这些框架区在给定物种中是相对保守的并且为cdr提供支架，一般来说，人源化抗体保留所有cdr序列，但可以修饰fr区。当针对特定抗原制备非人抗体时，可以通过在待修饰的人抗体中存在的fr上连接源自非人抗体的cdr来“改造”或“人源化”可变区，参见例如sato,k.等人，(1993),cancerres,53:851-856；riechmann,l.等人,(1988),reshapinghumanantibodiesfortherapy,nature,332:323-327；verhoeyen,m.等人,(1988),constructionofreshapedhumanantibodieswithhiv-neutralizingactivity,humanantibodieshybridoma,2:124-134；gorman,s.d.等人,(1991),reshapingatherapeuticcd4antibody),proc.natl.acad.sci.(u.s.a.),88:4181-4185；tempest,p.r.等人,(1991),humanizedantibodiesforantiviraltherapy,pnas,88:2869-2873；carter,p.等人,(1992),humanizationofananti-p185her2antibodyforhumancancertherapy),pnas,89:4285-4289。“治疗”包括但不限于以下中的一项或更多项试验表征：减轻疾病引起的一或更多种症状；减弱疾病的程度；预防或延迟疾病的恶化；预防或延迟疾病的扩散；预防或延迟疾病的复发；延迟或减缓疾病的进展；改善疾病情况；提供疾病的缓解；减少治疗疾病所需的一或更多种其他药物的剂量；延迟疾病的进展；增加或改善生活质量；增加体重增长及/或延长存活。在本发明中，“治疗”可以解释为癌症的病理结果(例如肿瘤体积的减小)。药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，包括但不限于稀释剂、赋形剂和水等；包括但不限于粘合剂如明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；包括但不限于促吸收剂如季铵化合物；包括但不限于表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠等。为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。实施例1：用6-8周龄雌性balb/c小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)作为实验动物进行小鼠免疫试验。初次免疫使用50μg人icos蛋白(购自北京义翘神州)与完全弗氏佐剂混合形成乳剂，按1ml/只注射量注射小鼠腹腔，每隔2周用25μg人icos蛋白与不完全福氏佐剂充分混合形成乳液进行加强免疫，加强免疫三次，末次免疫1周后，收集小鼠静脉血并分离血清，通过elisa方法测量抗体效价并选择具有高效价的小鼠细胞制备杂交瘤制备单脾细胞悬液。收集对数生长的骨髓瘤细胞(sp2/0)制备免疫脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例混合在一起，用不完全培养液洗涤后离心8分钟弃上清，将细胞沉淀置于40℃水浴中预热，向细胞沉淀中加入预热至40℃的peg-4000溶液1ml，出现颗粒后1min内向反应液中加入25ml预热至40℃的不完全培养基以终止反应。静置后加入2mlhat培养基，轻吹沉淀细胞使其悬浮混匀，之后补充hat培养基至离心管内的脾细胞浓度达到1.5×107/ml，将上述细胞悬浮液分装至96孔板培养并观察，待细胞表面积达到孔板面积1/2以上时，吸出上清液样品供抗体检测。实施例2：筛选杂交瘤培养上清液的抗人icos抗体。具体地，用缓冲液在96孔高吸附酶标板上包被人icos(购自北京义翘神州)，包被量100μl每孔，之后用缓冲液洗涤3次后；用含1％bsa的缓冲液阻断并于25℃孵育1h，阻断量280μl/孔，孵育完成后缓冲液洗涤3次，分别向1-90号孔中加入75μl上清液样品(s1-s85)以及阳性血清(对照，ck1-5)，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μl以比例1/10000稀释于含1％bsa缓冲液里的抗小鼠igg抗体，所述抗小鼠igg抗体被辣根过氧化物酶标记，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μl比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，30℃显色10min后终止显色反应，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，根据od450nm的强弱选取能够分泌人icos结合抗体的阳性克隆。实施例3：将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行抗体dna序列的测定。首先按照说明书使用rnapreppure试剂盒(tiangen)提取细胞mrna。之后使用quantscriptrt试剂盒(tiangen)合成cdna第一链。将逆转录产生的cdna第一链用于后续pcr反应，将pcr扩增得到的目的条带克隆到pgem-t载体中，挑取单克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。经过pcr扩增得到抗体轻链可变区和抗体重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区cdr-l1氨基酸序列如seqidno:1；cdr-l2氨基酸序列如seqidno:2、cdr-l3的氨基酸序列如seqidno:3所示；重链的三个互补决定区cdr-h1氨基酸序列如seqidno:4、cdr-h2氨基酸序列如seqidno:5、cdr-h3氨基酸序列如seqidno:6所示。抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源igvh4-21*07、抗体重链恒定区序列鼠源igvh2-09*01，轻链全长序列为将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接即得；重链全长序列为将抗体重链可变区和重链恒定区连接即得，将上述可变区序列及恒定区序列分别克隆到真核细胞表达载体tl10-11中(载体骨架pegfp-n1，购自上海吉满生物)。将抗体轻链及抗体重链表达载体转染293f细胞系(购自上海纪宁生物科技)。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的表达培养基中，细胞密度为1.8×108细胞/ml。按照转染体积加入质粒，终浓度为39.3μg/ml，加入线性聚乙烯亚胺至终浓度为30μg/ml。将上述混合物放入细胞培养箱37℃培养1小时，之后向培养液中加入新鲜培养基至终体积为20倍转染体积，继续培养5～6天后收集上清。实施例4：检测实施例1获得的抗人icos鼠源单抗(以下简称om-anti-icos)与其抗原结合的动力学常数。利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离，简要地，将om-anti-icos溶于的醋酸钠缓冲溶液(ph5.0)中并偶联到cm芯片上，用1m乙醇胺封闭，结合阶段将不同浓度的om-anti-icos以22μl/min的速度注入3.0min，在解离阶段用pbs缓冲溶液以24μl/min的速度注入4.0min，结合动力学常数和解离动力学常数通过biacore3000软件进行分析计算。om-anti-icos的结合动力学常数为3.51e+06(1/ms)、解离动力学常数为4.68e-03(1/s)、解离平衡常数为1.33e-09(m)。实施例5：测定om-anti-icos的在大鼠体内的药代动力。简要地，选用6-8周龄雌性sd大鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)。取大鼠5只，分别给予25nmol/kgom-anti-icos。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45分钟至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。elisa测定血清中om-anti-icos含量，测试结果表明，单次静脉注射的剂量为25nmol/kg的om-anti-icos的药代参数如下：半衰期为268小时；药时曲线下面积为39987nm.hr；估算零浓度为241nm；表观分布容积为77ml/kg；清除率为0.127ml/hr/kg；平均驻留时间为89小时。实施例6：人源化形式的抗人icos抗体参考moleculeimmunol的制备方法制备，在germline数据库中选取与om-anti-icos非cdr区匹配最好的人源化模板，其中重链可变区的模板为人源igvh4-28*03，轻链可变区的模板为人源igkv1-16*02，将鼠源抗体cdr区移植到选择的人源化模板上，替换得到人源化抗体重链可变区，氨基酸序列如seqidno:7所示，替换得到人源化抗体轻链可变区，氨基酸序列如seqidno:8所示。通过序列比对选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(vh)及轻链可变区氨基酸序列(vl)如表1所示。表1.回复突变获得的氨基酸序列vhseqidnooriseqidno:7icos1-hseqidno:9icos2-hseqidno:10vlseqidnooriseqidno:8icos1-lseqidno:11icos2-lseqidno:12将人源化的抗人icos单抗的重链可变区(seqidno：7-10)分别与人抗体igg1重链恒定区(seqidno:13)连接，分别得到对应的重链全长序列。将人源化的抗人icos单抗的轻链可变区(seqidno：8-12)分别与人抗体kappa轻链的恒定区(seqidno:14)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入tl10-11(载体骨架pegfp-n1)载体中。实施例7：测定三种人源化icos单抗(ori：seqidno:7和seqidno:8，icos1：seqidno:9和seqidno:11，icos2：seqidno:10和seqidno:12)与抗原icos蛋白的结合动力学常数，方法同实施例4，人源化icos单抗的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表2所示。表2.人源化icos单抗与其抗原结合的动力学常数由结果可见，人源化icos单抗与其抗原结合能力强。实施例8：检测综合表现较强的抗人icos人源化单抗(icos2)对接种于小鼠肿瘤移植物的生长抑制作用，实验材料选用人8周龄雌性小鼠(balb/c-nu背景，上海加科生物科技有限公司)。取25只小鼠，每只植入小鼠卵巢癌细胞细胞株id8(购自上海慧颖生物科技有限公司)，待小鼠明显荷瘤切片验证，模型荷瘤小鼠模型构建，观察肿瘤生长并记录肿瘤体积，每周给药2次(腹腔注射)，连续给药4周，自给药之日起每周测量1次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(axb2)/2。按体积分组每组4只小鼠：s1,s2,s3,s4(体积最大，约等于100mm3)；s5,s6,s7,s8(体积中等，约等于80mm3)；s9,s10,s11,s12(体积小，约等于50mm3)；s1,s5,s9设置为溶媒组(注射等体积生理盐水)，s2,s6,s10给药剂量为20nmol/kg，s3,s7,s11给药剂量为50nmol/kg，s4,s8,s12给药剂量为100nmol/kg，试验结果如表3所示。表3.试验小鼠肿瘤消融比由表3可见，抗人icos人源化单抗(icos2)具有非常强的抗卵巢肿瘤的活性，显著抑制了接种卵巢癌肿瘤细胞的小鼠移植瘤的生长，其中，icos2针对小体积肿瘤，即卵巢癌初期的抑制效果更为显著，肿瘤消融比例最高约达27.13％。以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。序列表<110>钟小泉<120>一种抗人cd28单克隆抗体及其用途<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>cdr1-l<400>1alatyrleuasnalaglnlysproasp15<210>2<211>8<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>cdr2-l<400>2glyalatyrasnglytrpprocys15<210>3<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>cdr3-l<400>3asptyrglyileproglymetthrargmetleu1510<210>4<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>cdr1-h<400>4gluhistrplysasptyrcysgluasngln1510<210>5<211>8<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>cdr2-h<400>5serargglythrphegluasptrp15<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>cdr3-h<400>6argalaprotrptyrcyslysaspala15<210>7<211>110<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>orivh<400>7aspvalglnlysasnleutyrvalthrhisprogluilevalpheleu151015sergluhistrplysasptyrcysgluasnglnleuhisthrtyrgly202530aspglymettyrglyglngluglyalame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