一种具有光老化改善作用的胶原蛋白肽及其制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有光老化改善作用的鱼皮胶原蛋白肽及其制备方法。

背景技术：

光老化是由于紫外线反复照射所引起的一系列功能退化性变化。光老化对皮肤的影响主要表现在皮肤松弛、暗黄、皱纹、色素沉着等，严重者甚至可导致皮肤的恶性肿瘤。自然界存在许多可以抵御紫外线伤害的生物活性物质，如维生素及其衍生物、抗氧化酶、植物提取物如芦荟、燕麦和葡萄籽萃取物等，其主要通过清除或减少自由基及其中间产物，阻断或减缓组织损伤。因此，摄入生物活性物质能够从生理上阻止皮肤老化，且不会对机体造成损伤。

胶原蛋白作为一种生物活性物质，因其低抗原性、高生物相容性以及高营养价值等特性，受到了生物医学方面的广泛关注。但胶原蛋白作为一种大分子蛋白质，不易被人体直接吸收，因此需要将其水解为更小的多肽和氨基酸。水解后的胶原蛋白能够被机体很好的吸收利用，吸收率可达100%，并可促进食物中其他蛋白质的吸收。有研究证明，ⅰ型胶原蛋白水解产物经口服吸收后，可以特异性地富集于皮肤并被利用，食用胶原蛋白能够抑制紫外线辐射造成的皮肤水分含量降低、表皮细胞增生、胶原蛋白含量下降等有害变化。近年来，海洋水产来源的胶原蛋白由于其具有低抗原性、低过敏性等优良特性，且不受禽流感等畜禽疾病和宗教的影响，逐渐取代传统猪牛羊作为提取胶原蛋白的良好原料。

鳗鱼广泛分布于我国沿海区域，具有较高的食用和药用价值。虽然我国的鳗鱼养殖业十分繁茂，但鳗鱼加工技术却很薄弱，加工率低，产品单一，实际生产加工过程中产生的鱼骨、鱼皮、鱼头、内脏等废弃物造成了大量的资源浪费。其中，鳗鱼皮可作为提取胶原蛋白的良好来源，同时可提升鳗鱼的附加价值。

目前胶原蛋白的提取方法主要有酸法、酶法、碱法、热水法和盐法，各有其优缺点。单一的胶原蛋白提取方法无法满足生产需要，且得到的胶原蛋白肽的安全性及生物活性有待考证。因此，本发明提供了一种酸+酶法共同萃取的鳗鱼皮胶原蛋白的提取方法，所得胶原蛋白产物纯度高，胶原蛋白结构保持完整，利用体外消化模型水解得到的胶原蛋白肽不仅安全性高，而且对于皮肤光老化损伤具有良好的修复和改善作用，同时为鳗鱼皮的开发利用提供了新的思路。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供了一种酸法+酶法复合提取胶原蛋白的方法，并通过体外消化模型对鳗鱼皮胶原蛋白进行消化，得到对光老化具有皮肤改善作用的胶原蛋白肽。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有光老化改善作用的胶原蛋白肽，其制备方法包括以下步骤：

（1）原料处理：将鳗鱼皮切割成大小约1cm²的碎片，加入冰水中，用磁力搅拌器清洗至溶液澄清；

（2）去除非胶原蛋白：按料液比1:10g/ml将切碎后的鳗鱼皮用0.1mol/l的naoh溶液浸泡48h，浸泡过程中每4~12h更换一次naoh溶液；再用蒸馏水清洗鳗鱼皮至清洗液呈中性；

（3）脱脂：按料液比1:10g/ml用体积浓度为10%的丁醇溶液再次浸泡鳗鱼皮48h，浸泡过程中每4~12h更换一次丁醇溶液；浸泡完成后，再次用蒸馏水清洗鳗鱼皮，直至清洗液无醇味且静置后无分层；

（4）萃取：按料液比1:10-30g/ml将步骤（3）处理完的鳗鱼皮于0.5mol/l的醋酸溶液中浸泡18-30h期间用磁力搅拌器持续搅拌，浸泡完成后，离心取上清液保存于4℃冰箱，所得沉淀再按料液比1:10-30g/ml用0.5mol/l的醋酸溶液浸泡18-30h，浸泡完成后，离心取上清液，合并两次所得上清液并调ph至中性；再将剩余沉淀物按料液比1:10-30g/ml浸入0.5mol/l的醋酸溶液中并按20u/g的量加入胃蛋白酶，持续搅拌浸泡18-30h后，离心取上清液，调ph至中性；

（5）盐析：将萃取得到的上清液合并，缓慢加入nacl并不断搅拌，至nacl终浓度达到2.6mol/l后离心，取沉淀物；

（6）透析：离心所得沉淀物复溶于0.5mol/l的醋酸溶液中，先于0.1mol/l的醋酸溶液中透析24~48h，再用蒸馏水透析24~48h；透析时，每4~12h更换一次透析液；

（7）冻干：透析完成后，将透析袋内溶液冷冻干燥，得到鳗鱼皮胶原蛋白；

（8）消化：模拟人体胃肠道消化环境建立体外消化模型消化鳗鱼皮胶原蛋白，然后将混合液于90℃下加热10min终止消化，再于4℃、12000g条件下离心20min，得到胶原蛋白肽混合液，用截留分子量为3000da的超滤膜进行超滤后，将其冷冻干燥，得到小分子量的胶原蛋白肽。

步骤（4）所述离心是以15000g处理15min。

步骤（5）所述离心是以15000g处理15~30min。

步骤（1）~（6）均在4℃下完成。

步骤（8）所述消化具体是按照食物在人体口腔、胃、小肠的消化过程，在37±2℃下，分别以人工唾液、人工胃液及人工肠液为消化液对鳗鱼皮胶原蛋白进行处理；其中，每3g鳗鱼皮胶原蛋白使用50ml人工唾液、100ml人工胃液及150ml人工肠液。

本发明的优点和积极效果在于：

1.本发明将酸法与酶法结合进行胶原蛋白的提取，可极大限度地将胶原蛋白从鳗鱼皮中提取出来，其提取率达到80%以上，纯度达到85%以上；

2.本发明通过模拟人体完整消化过程，消化胶原蛋白得到胶原蛋白肽，所得产物更加安全

3.根据本发明方法生产的胶原蛋白肽，抗氧化效果显著，对于由光老化造成的皮肤胶原蛋白及水分流失等损伤具有优良的改善作用，有利于延缓衰老，有极大的商业生产价值。

附图说明

图1为实施例1所得胶原蛋白的sds-page凝胶电泳图；

图2为实施例1所得胶原蛋白的紫外吸收光谱图；

图3为实施例1所得胶原蛋白的傅立叶变换红外吸收光谱图；

图4为不同处理对小鼠脏器指数的影响；

图5为不同处理对光老化小鼠皮肤含水量的影响；

图6为不同处理对光老化小鼠皮肤中羟脯氨酸含量的影响；

图7为不同处理对小鼠皮肤中抗氧化酶活力的影响；

图8为不同处理对小鼠皮肤中mda含量的影响；

图9为不同处理后小鼠背部皮肤组织的形态学变化。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

一种具有光老化改善作用的胶原蛋白肽，其制备方法包括以下步骤：

（1）原料处理：将鳗鱼皮上残余的鱼肉刮去，切割成大小约1cm²的碎片，加入冰水中，用磁力搅拌器反复搅拌清洗，并更换冰水，至溶液变澄清；

（2）去除非胶原蛋白：按料液比1:10g/ml将切碎后的鳗鱼皮用0.1mol/l的naoh溶液浸泡48h，浸泡过程中每12h更换一次naoh溶液（在第一次浸泡鳗鱼皮溶胀后，将鳗鱼皮再次切碎，以提高浸泡效果）；再用蒸馏水清洗鳗鱼皮至清洗液呈中性；

（3）脱脂：按料液比1:10g/ml用体积浓度为10%的丁醇溶液再次浸泡鳗鱼皮48h，浸泡过程中每12h更换一次丁醇溶液；浸泡完成后，再次用蒸馏水清洗鳗鱼皮，直至清洗液无醇味且静置后无分层；

（4）萃取：按料液比1:10g/ml将步骤（3）处理完的鳗鱼皮于0.5mol/l的醋酸溶液中浸泡24h，期间用磁力搅拌器持续搅拌，浸泡完成后，在15000g条件下离心15min，取上清液于4℃保存，所得沉淀再按料液比1:10g/ml用0.5mol/l的醋酸溶液浸泡24h，期间用磁力搅拌器持续搅拌，浸泡完成后，在15000g条件下离心15min取上清液，合并两次所得上清液，调ph至中性；再将离心所剩余的沉淀物按料液比1:10g/ml浸入0.5mol/l的醋酸溶液中并按20u/g的量加入胃蛋白酶，持续搅拌24h后，于15000g条件下离心15min，取上清液调ph至中性；

（5）盐析：将萃取得到的上清液合并，缓慢加入nacl并不断搅拌，至nacl终浓度达到2.6mol/l后，15000g离心15~30min，取沉淀物；

（6）透析：离心所得沉淀物复溶于0.5mol/l的醋酸溶液中，先于0.1mol/l的醋酸溶液中透析24~48h，再用蒸馏水透析24~48h；透析时，每6h更换一次透析液；

（7）冻干：透析完成后，将透析袋内溶液冷冻干燥，得到鳗鱼皮胶原蛋白；

（8）消化：按照食物在人体口腔、胃、小肠的消化过程建立体外消化模型，其具体是先取3g胶原蛋白置于锥形瓶中，加入50ml人工唾液充分混合；随后将100ml人工胃液分两次加入上述混合液中，保持混合液的ph处于2-3之间，再将混合液置于恒温振荡器中不停震荡（55rpm，37℃），反应2h；最后向混合液中加入150ml人工肠液，同时加入碳酸氢钠调节消化体系的ph至6-7，震荡2-4h（55rpm，37℃），之后将混合液于90℃下加热10min终止消化，再于4℃、12000g条件下离心20min，得到胶原蛋白肽混合液，用截留分子量为3000da的超滤膜超滤后，得到分子量为3000da的胶原蛋白肽，再进行冷冻干燥，得到小分子量的胶原蛋白肽粉末，将其命名为escp-ⅰ。

步骤（1）~（6）均在4℃下完成。

实施例2

将步骤（4）中采用醋酸浸泡时间修改为18h，其余操作同实施例1。

实施例3

将步骤（4）中采用醋酸浸泡时间修改为30h，其余操作同实施例1。

实施例4

将步骤（4）中所用料液比修改为1:20，其余操作同实施例1。

实施例5

步骤（4）中所用料液比修改为1:30，其余操作同实施例1。

对比例1

步骤（4）中仅对预处理的鳗鱼皮进行两次酸处理，而不加入胃蛋白酶进行进一步处理，其余操作同实施例1。

对比例2

将步骤（4）修改为仅经胃蛋白酶处理，即按料液比1:45g/ml将步骤（3）处理完的鳗鱼皮于37℃含2.5%胃蛋白酶的乙酸溶液中浸泡28h，之后于15000g条件下离心15min，取上清液调ph至中性，其余操作同实施例1。

对比例3

将步骤（4）修改为使用热水法提取胶原蛋白，即鳗鱼皮与水的料液比为1:17g/ml，温度为80℃、反应时间为9h，其余操作同实施例1。

对比例4

步骤（8）消化后得到的胶原蛋白肽混合液先后采用截留分子量为5000da和3000da的超滤膜超滤后，得到分子量为3000da-5000da的胶原蛋白肽，再进行冷冻干燥，得到中分子量的胶原蛋白肽粉末，将其命名为escp-ⅱ，其余操作同实施例1。

对比例5

步骤（8）消化后得到的胶原蛋白肽混合液采用截留分子量为5000da的超滤膜超滤后，得到分子量大于5000da的胶原蛋白肽，再进行冷冻干燥，得到高分子量的胶原蛋白肽粉末，将其命名为escp-ⅲ。

1.胶原蛋白的鉴定

对实施例1得到的鳗鱼皮胶原蛋白样品进行sds-page凝胶电泳测定，结果如图1所示，样品具备ⅰ型胶原蛋白的典型特征，即具有2条α链和一条β链。

对实施例1得到的样品进行紫外光谱分析，结果如图2所示，所得鳗鱼皮胶原蛋白在227nm处有明显的吸收峰，与ⅰ型胶原蛋白在226nm波长处有特征吸收峰相似，进一步确定了鳗鱼皮胶原蛋白与ⅰ型胶原蛋白的相似度。且样品在280nm处几乎无吸收峰，说明样品中芳香族氨基酸含量较低，证实所制得胶原蛋白具有较高的纯度。

对样品进行傅里叶红外光谱分析，结果如图3所示，样品与ⅰ型胶原蛋白表现出相似的低级结构和高级结构。

综上，所得样品均符合ⅰ型胶原蛋白的典型特征，证明提取所得样品确为胶原蛋白。

2.胶原蛋白含量的测定

羟脯氨酸为胶原蛋白的特征性氨基酸，因此，可通过鉴定实施例1-5及对比例1-3所得鳗鱼皮胶原蛋白样品中的羟脯氨酸来确定胶原蛋白的含量，进而计算出胶原蛋白的提取率及纯度，其测定结果见表1（羟脯氨酸含量测定方法参考《gbt9695.23-2008肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》）。

表1实施例1-5与对比例1-3胶原蛋白得率的对比

3.胶原蛋白肽的鉴定及感官评定

对实施例1消化后制备得到的混合胶原蛋白肽进行sds-page凝胶电泳分析、傅里叶红外光谱以及氨基酸组成分析分析。电泳结果表明胶原蛋白被完全酶解成小于10kda的多肽，具有被人体吸收的潜质；傅里叶红外光谱结果证实所得到的胶原蛋白肽具有胶原蛋白的特有吸收峰，确实为胶原蛋白产品；胶原蛋白肽中主要含甘氨酸，同样符合胶原蛋白的典型特征。

通过随机邀请12位志愿者对实施例及对比例所得小分子量的胶原蛋白肽的色泽、气味以及形态进行感官评定，各评价指标的评分由低至高分别为1-5分，各评价指标取平均分进行统计，（结果保留二位有效数字），其中整体评分大于12为良好，大于13则为极佳。结果如表2。由表2结果证明，所得胶原蛋白肽有良好的感官品质，易被消费者接受；

表2胶原蛋白肽感官评定结果

综上，经本方法制备得到的胶原蛋白肽具有良好的品质，适合工业生产。

4.不同分子量区间的胶原蛋白肽的体外抗氧化活性

通过dpph•清除实验、•oh清除实验、o2^•-清除实验测定实施例1与对比例4、5所得不同分子量区间的胶原蛋白肽的抗氧化活性。

1）dpph•清除能力

表3鳗鱼皮胶原蛋白肽dpph清除力ic50

由表3可见，escp-ⅰ清除dpph的ic50最低，说明小分子量的胶原蛋白肽具有很强的dpph清除能力，能够有效的中断自由基连锁反应。

2)•oh清除能力

表4鳗鱼皮胶原蛋白肽•oh清除力ic50

由表4可见，在不同分子量的鳗鱼皮胶原蛋白肽中，escp-ⅰ的•oh清除能力最大，说明胶原蛋白肽的•oh清除能力与分子量有关，分子量越小清除能力越大。

3）o2^•-清除能力

表5鳗鱼皮胶原蛋白肽o2^-•清除力ic50

由表5可见，escp-ⅰ表现出较其他两种分子量的胶原蛋白肽更好的o2^-•清除效果。

综上，分子量为3000da以下的小分子量胶原蛋白肽具有最好的抗氧化活性。

5.不同胶原蛋白肽对小鼠皮肤光老化的改善作用

采用紫外诱导光老化小鼠实验，即对实验小鼠进行背部脱毛并利用1根40w的uva（峰值340nm）与1根40w的uvb(峰值308nm)组成的紫外照射光源进行紫外光照射处理；实验小鼠分组设置如下：

i：空白组：不进行任何处理；

ii：模型组：脱毛处理，紫外线照射，生理盐水灌胃；

iii：阳性对照组：脱毛处理，紫外线照射，1000mg/kg.dvc灌胃；

iv：鳗鱼皮胶原蛋白组：脱毛处理，紫外线照射，1000mg/kg.d胶原蛋白灌胃；

v：鳗鱼皮胶原蛋白肽低剂量组：脱毛处理，紫外线照射，200mg/kg.d样品灌胃；

vi：鳗鱼皮胶原蛋白肽中剂量组：脱毛处理，紫外线照射，500mg/kg.d样品灌胃；

vii：鳗鱼皮胶原蛋白肽高剂量组：脱毛处理，紫外线照射，1000mg/kg.d样品灌胃；

viii：商业胶原蛋白肽组：脱毛处理，紫外线照射，1000mg/kg.d商业胶原蛋白肽灌胃。

（所用胶原蛋白肽为分子量为3000da以下的小分子量胶原蛋白肽）。

试验结果：

1）鳗鱼皮胶原蛋白肽对小鼠生长和体重的影响

实验期间小鼠体重的变化如表6所示。整个实验过程中，各组小鼠的体重并无显著差异，均缓慢增长，说明实验选用的紫外剂量并未超标，鳗鱼皮胶原蛋白肽对小鼠也无任何毒害作用，安全性高。

表6小鼠实验期间体重的变化

2）鳗鱼皮胶原蛋白肽对小鼠脏器指数的影响

如图4所示，长期的紫外线对小鼠肝脏的影响最为明显，同空白组相比，模型组的肝脏指数有了显著的降低，而各剂量组均对小鼠的肝脏有一定修复作用，其中高剂量组对小鼠的肝脏修复作用最为明显，同模型组相比有了显著性的增强，且效果优于商业对照组，这说明鳗鱼皮胶原蛋白肽对小鼠的免疫能力提高有明显改善作用，可保护机体不受紫外线照射的影响。

3）鳗鱼皮胶原蛋白肽对小鼠皮肤含水量的影响

如图5所示，模型组小鼠与空白组相比，其皮肤的含水量显著降低。处理组中，与模型组相比，中、高剂量组及商业对照组小鼠皮肤含水量显著升高，说明鳗鱼皮胶原蛋白肽能够抑制水分的流失，甚至能够增加皮肤含水量，且高剂量的鳗鱼皮胶原蛋白肽的效果略优于商业胶原蛋白肽。

4）鳗鱼皮胶原蛋白肽对小鼠皮肤羟脯氨酸含量的影响

如图6所示，同模型组小鼠相比，空白组小鼠皮肤中的羟脯氨酸含量显著降低，其他各组中胶原蛋白的含量都有一定的提高，其中高剂量组的胶原蛋白含量提高了26.6%，有显著的提高，说明胶原蛋白与胶原蛋白肽可补充因紫外照射引起的皮肤胶原蛋白流失，且鳗鱼皮胶原蛋白肽的效果优于胶原蛋白及商业胶原蛋白肽。

5）胶原蛋白肽对小鼠皮肤中抗氧化酶活力及丙二醛（mda）含量的影响

如图7所示，与空白组相比，模型组抗氧化酶的活性有了显著性的降低。胶原蛋白组对抗氧化酶的影响不大，而胶原蛋白肽能够有效抑制抗氧化酶的活性降低。

如图8所示，模型组mda含量远远高于其他组，而实验组与空白组并无显著性区别，这表明胶原蛋白肽能够有效保持机体抗氧化平衡，且高剂量组的胶原蛋白肽较其他实验组具有更明显的效果。

6）鳗鱼皮胶原蛋白肽对小鼠皮肤组织形态的影响

皮肤组织的形态学观察如图9。结果表明，胶原蛋白和胶原蛋白肽对小鼠皮肤胶原纤维有显著的保护作用，均能有效地改善小鼠皮肤因紫外照射造成的胶原纤维受损，使弹性纤维排列与分布趋于正常小鼠，促使皮肤富有弹性。同时，鳗鱼皮胶原蛋白肽对小鼠皮肤在紫外线照射下的损伤修复作用远强于商业胶原蛋白肽。

综上，本发明鳗鱼皮胶原蛋白肽对小鼠的光老化有一定的保护作用，能够有效的缓解小鼠因紫外线照射引起的各种生理功能障碍，且其功能作用明显高于胶原蛋白和商业胶原蛋白肽。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。