本发明属于微生物领域，具体涉及一种利用腌渍盐水和曲璜盐水生产果胶酶的方法。
背景技术：
果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称，半乳糖醛酸是其作用的最终产物。在自然界中，有三种主要类别的果胶降解酶：果胶酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶。在自然界中，有三种主要类别的果胶降解酶：果胶酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶。果胶酶已广泛用于各种生物过程，如食品，饲料，果胶废水处理，造纸和纺织等工业。在工业中，酸性果胶酶主要是来自真菌的聚半乳糖醛酸酶，用于饮料工业果汁和葡萄酒的提取和澄清。而嗜碱性果胶酶用于以生物技术为基础的工业，如纤维脱胶、造纸工业、油的提取和水果加工装置排出的废水处理中得到了极大的利用。鉴于果胶酶应用范围较广，优化果胶酶生产则是降低成本和提高生产效率的基础。中国专利cn107904195a利用海洋细菌(maribactersp.)t28生产果胶酶，发酵液的果胶酶的酶活力可以达到120～160u/ml，但是培养基的配方中原材料多为工业制剂，生产成本较高。故而，亟需探究能够高产果胶酶且造价较低的方法。
腐乳又称豆腐乳，是中国流传数已久的民间美食，因其口感好、营养高，深受中国老百姓及东南亚地区人民的喜爱，是一道经久不衰的美味佳肴。食品工业中，腐乳的制备过程包括：先将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的温度控制在15~18℃，并保持在一定的湿度，培养3-5天使菌丝旺盛生长，直至豆腐长出毛霉；再将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放，同时逐层加盐，腌制8天左右，最后再加卤保存。在腐乳制作过程中，会产生大量腌渍盐水，这些腌渍盐水通常会被直接弃置。但是腌渍盐水中不仅富含足量的氯化钠，还含有不少营养物质，直接弃去会造成浪费，故而为腐乳腌渍盐水寻找可用之处具有环保意义。同理，在制备黄豆酱等酱类食品的过程中，也存在直接弃去曲璜盐水的现象。因此，亟需探索一种能够充分利用腌渍盐水和曲璜盐水的方法，使之能物尽其用。
技术实现要素：
针对现有技术中腌渍盐水和曲璜盐水废水无处可用的问题，本发明提供了一种利用腌渍盐水和曲璜盐水生产果胶酶的方法。
本发明提供的利用腌渍盐水和曲璜盐水生产果胶酶的方法，包括以下步骤：
步骤1：将枯草芽孢杆菌接种到固体活化培养基中，于37℃下活化培养48小时，得到活化后的枯草芽孢杆菌；
其中，所述的步骤1中的固体活化培养基包括：牛肉膏2-5g/l，蛋白胨5-10g/l，氯化钠2-10g/l，琼脂15g/l，ph7.0，其余为蒸馏水。
步骤2：将步骤1中得到的活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体活化培养基中，于35℃摇床培养12小时，得到种子液；
其中，所述的步骤2中的液体活化培养基包括：牛肉膏2-5g/l，蛋白胨5-10g/l，氯化钠2-10g/l，ph7.0，其余为蒸馏水。
步骤3：将步骤2中得到的种子液接种到腌渍盐水和曲璜盐水发酵培养基中进行发酵培养，得到果胶酶粗液；
其中，所述的步骤3中的腌渍盐水和曲璜盐水发酵培养基包括：葡萄糖，果胶，蛋白胨，尿素，腌渍盐水，曲璜盐水，磷酸二氢钾，硫酸铁，霉菌素和蒸馏水；
优选地，所述的发酵培养基包括：葡萄糖10-16g/l，果胶5-10g/l，蛋白胨10-20g/l，尿素10-20g/l，腌渍腐乳盐水0.5-1.5%（v/v），曲璜盐水12.5-37.5%（v/v），磷酸二氢钾2-8g/l，硫酸铁2-8g/l，霉菌素0.5-2g/l，其余为蒸馏水；
进一步优选地，所述的发酵培养基中腌渍腐乳盐水和曲璜盐水的体积比为1:25；
最优选地，所述的发酵培养基包括：葡萄糖12g/l，果胶6g/l，蛋白胨15g/l，尿素15g/l，腌渍腐乳盐水1%（v/v），曲璜盐水25%（v/v），磷酸二氢钾5g/l，硫酸铁5g/l，霉菌素1.0g/l，其余为蒸馏水。
其中，所述的步骤3中的发酵培养的温度为40℃，通气量为8.0l/min。
其中，所述的步骤3中的发酵培养的时间为20-30小时；优选地，所述的发酵培养的时间为24小时。
本发明的有益效果：
（1）本发明创造性地使用腌渍盐水和曲璜盐水，循环利用原本的食品工业废水，使之成为生产果胶酶的原材料。
（2）本发明在传统的发酵培养基的基础上，合理配比腌渍盐水和曲璜盐水，充分利用碳源、氮源、无机离子和营养物质，使其促进枯草芽孢杆菌发酵，生产高活力的果胶酶，最终获得的果胶酶最高活力可达138u/ml。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
本说明书中所述实施例1-4及对比例1-5采用的实验材料、试剂和方法如下：
1.实验材料和试剂
材料：枯草芽孢杆菌。
试剂：
（1）1mg/ml的果胶底物缓冲液：取0.1g果胶粉末加入100ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，置于磁力搅拌器上搅拌至全部溶解即得到1mg/ml的底物缓冲液。
（2）3,5-二硝基水杨酸（dns）试剂:用电子天平称6.3g的dns，加500ml蒸馏水搅拌溶解，放在45℃水浴锅中，再依次加入naoh21.0g、酒石酸钾钠182.0g、苯酚5.0g、无水na2so35.0g，搅拌至完全溶解，定容至1000ml。dns试剂需要用棕色瓶保存，放7天后能用。
实验方法
2.1利用腌渍盐水和曲璜盐水生产果胶酶的方法，包括以下步骤：
步骤1：将枯草芽孢杆菌接种到固体活化培养基中，于37℃下活化培养48小时，得到活化后的枯草芽孢杆菌；其中，固体活化培养基包括：牛肉膏3.5g/l，蛋白胨7.5g/l，氯化钠6g/l，琼脂15g/l，ph7.0，其余为蒸馏水。
步骤2：将步骤1中得到的活化后的枯草芽孢杆菌接种到液体活化培养基中，于35℃摇床培养12小时，得到种子液；其中，液体活化培养基包括：牛肉膏3.5g/l，蛋白胨7.5g/l，氯化钠6g/l，ph7.0，其余为蒸馏水。
步骤3：将步骤2中得到的种子液接种到腌渍盐水和曲璜盐水发酵培养基中进行发酵培养，得到果胶酶粗液；其中，腌渍盐水和曲璜盐水发酵培养基包括：葡萄糖，果胶，蛋白胨，尿素，腌渍盐水，曲璜盐水，磷酸二氢钾，硫酸铁，霉菌素和蒸馏水；
其中，发酵培养的温度为40℃，通气量为8.0l/min；发酵培养的时间为20-30小时。
本说明书中的实施例均按照上述方法制备果胶酶粗液，腌渍盐水和曲璜盐水发酵培养基各组分浓度（或体积占比）及发酵时间如表1所示。
2.2果胶酶酶活力的检测
2.2.1绘制标准曲线
取乳糖醛酸标准液，以200μl为梯度于ep管中，然后均补足至2ml，混匀后。取500μl加入800μldns试剂，煮沸显色。稀释后各取0.5ml，测定540nm吸光值绘制标曲线。
2.2.1果胶酶酶活力的测定
将发酵液离心其上清液即为粗酶液，用粗酶液测定菌株的产酶活力。吸取1.5ml浓度为1mg/ml的果胶底物缓冲液于2ml的ep管中，加入0.5ml粗酶液，混匀15℃水浴反应30min后取出500μl反应液加800μldns终止反应，并置于沸水中煮沸5min，然后以流动水迅速冷却。以灭活的粗酶液作对照。果胶酶活力的定义：在反应条件15℃、ph5.0时，1ml酶液每分钟水解果胶底物生成1μmol半乳糖醛酸的能力定义为1个酶活力单位（u）。
实施例及对比例
对比例1
与实施例1相比，发酵培养基中仅缺少腌渍腐乳盐水和曲璜盐水。
对比例2
与实施例1相比，发酵培养基中仅缺少腌渍腐乳盐水。
对比例3
与实施例1相比，发酵培养基中仅缺少曲璜盐水。
对比例4
使用文献《枯草芽孢杆菌固体发酵产碱性果胶酶条件研究》（食品工业，2014年第35卷第12期）提供的方法生产果胶酶。
对比例5
使用《枯草芽孢杆菌fm208849产果胶酶发酵条件的优化》（大连工业大学学报，2010年第29卷第2期）提供的方法生产果胶酶。
实验结果
综上所述，本专利提供的方法生产得到的果胶酶粗液的酶活力最高达到138u/ml，说明本发明提供的含有腌渍盐水和曲璜盐水的发酵培养基能够实现生产高活力果胶酶的技术效果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化也应视为本发明的保护范围。