吸水链霉菌狭霉素亚种及其在防治植物卵菌和真菌病害、促进植物生长中的应用的制作方法

本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一种吸水链霉菌狭霉素亚种及其在防治植物卵菌和真菌病害、促进植物生长中的应用。
背景技术：
：马铃薯是隶属于茄科茄属的双子叶植物，是继水稻，小麦，玉米之后的全球第四大主粮化作物。然而，在其生长发育过程中，马铃薯遭受了30多种病虫害威胁，造成了严重的经济损失，其中最为典型的是马铃薯晚疫病、早疫病、枯萎病及其干腐病。马铃薯晚疫病是由致病疫霉(phytophthorainfestans)引起的马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的卵菌病害，是马铃薯生产上最具毁灭性的病害之一，在低温度高湿条件下，病斑迅速扩张，可在较短时间内致使田间大面积发病，造成绝产。根据联合国粮食及农业组织(fao)综合评估，马铃薯晚疫病是世界上危害最大、范围最广、防控最难的流行性植物病害，每年造成约200亿的经济损失。该种病害是马铃薯生产的主要杀手，因此被命名为马铃薯癌症。马铃薯早疫病主要是由茄链格孢(alternariasolani)引起的发生在叶片和块茎上的第二大马铃薯病害，造成叶片枯死、块茎褐变。该病害在我国河北、内蒙古、黑龙江、甘肃和山东等省份发生与危害日益上升，减产量高达30％。马铃薯枯萎病是马铃薯上的一种土传性真菌病害，分布广泛，全国各种植区普遍发生，其病原菌主要为尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)和大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)。除马铃薯枯萎病外，尖孢镰刀菌还可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。大丽轮枝菌的寄主范围也极其广泛，可危害38科660种植物，其中农作物184种，杂草153种。马铃薯干腐病是马铃薯的采后病害，病原菌侵染块茎而致整个块茎僵缩或干腐，不堪食用。该病害有9种病原菌，其中茄病镰刀菌(fusariumsolani)是优势种群且致病力强。目前，化学防治是病虫害防治的主要手段，其成本低见效快，但对环境危害大，易导致病菌产生耐药性及变异成新的生理小种，并增加农产品中农药残留量，严重破坏了土壤和农业生态环境，阻碍了“马铃薯主粮化战略”和“化肥农药减量增效战略”的实施。如何控制马铃薯病害，提高马铃薯产量和品质一直是全球面临的挑战。生物防治可以显著克服化学防治的缺点。但是，生物防治作为新兴的科学，也存在很多不足之处，例如：与化学杀菌剂比较，稳定性较低，见效慢。目前市场上生物防治药物或措施尚未广泛推广开来。因此，寻找或发现一种理想的生物防治药物或措施是十分必要的。技术实现要素：针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种吸水链霉菌狭霉素亚种及其在防治植物卵菌和真菌病害、促进植物生长中的应用。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种吸水链霉菌狭霉素亚种菌株cqusa03，保藏号为：cgmccno.18715。一种以菌株cqusa03为活性成分的生物菌剂。菌株cqusa03在防治植物卵菌和植物真菌病害中的应用。所述植物卵菌病害是指由致病疫霉引起的植物病害，植物真菌病害是指由茄链格孢或尖孢镰刀菌或大丽轮枝菌或茄病镰刀菌引起的植物病害。所述植物卵菌病害是指茄科植物晚疫病，所述植物真菌病害是指茄科植物早疫病或茄科植物枯萎病或茄科植物干腐病。菌株cqusa03在促进植物生长中的应用。在上述技术方案中，所述植物为茄科植物。一种含有菌株cqusa03的液体菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)菌种活化：将菌株cqusa03接种到燕麦固体培养基上培养活化得到活化菌株；(2)种子培养：将步骤(1)得到的活化菌株接种到isp液体培养基中培养得到种子培养基；(3)液体发酵：将步骤(2)得到的种子培养基添加到发酵培养基中进行发酵得到液体菌剂，发酵培养基培养基配方为：葡萄糖4％、黄豆饼粉1％、氨基酸粉0.2％、k2hpo40.5％、kh2po40.5％、nacl0.5％、硫酸亚铁0.15％、消泡剂0.2％，ph7.2-7.4。步骤(3)液体发酵的具体条件是：将步骤(2)得到的种子培养基按体积百分比10％添加到发酵培养基中，发酵温度28℃，罐压0.07mpa，搅拌速率100rpm，通氧量>60％，发酵时间7d。步骤(1)中的燕麦固体培养基配方为：燕麦2％，琼脂粉2％；步骤(2)中的isp液体培养基配方为：麦芽糖提取物1％，酵母提取物0.4％，d-葡萄糖0.4％，ph7.0-7.4。本发明的有益效果是：筛选到的吸水链霉菌菌株cqusa03对马铃薯晚疫病菌抑制作用极强，对马铃薯晚疫病具有良好的防治效果；对马铃薯四种病原真菌具有强烈的抑制效果；对马铃薯和番茄幼苗具有显著地促生长作用。菌株cqusa03培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，有着良好的开发应用前景；本发明提供的菌株cqusa03的液体菌剂制备方法工艺简单，发酵培养基无需贵重原料，成本低，容易推广。附图说明图1是菌株cqusa03的菌落生长情况及系统发育树分析图，其中，a为菌落生长情况，b为系统发育树分析图。图2是菌株cqusa03与马铃薯晚疫病病原菌不同生理小种的室内平板对峙培养的抑菌效果。图3是菌株cqusa03与马铃薯四种病原真菌的室内平板对峙培养的抑菌效果。图4是cqusa03液体菌剂对马铃薯晚疫病病原菌侵染马铃薯叶片及薯块的抑制作用观察图。图5是cqusa03液体菌剂对马铃薯和番茄植株生长过程促进作用效果图。具体实施方式实施例1、菌株的分离和鉴定一、菌株cqusa03的分离筛选在重庆市巫溪县马铃薯种植区，根据晚疫病发生情况，选择适当地点采集5-20mm处的根际土壤，标记好采样时间、地点、植被以及病害发生情况。采用土壤稀释法在高氏一号培养基上进行分离，于28℃恒温培养48h后挑取单菌落并保存，作为待测菌株。对所选取的待测菌株采用平板对峙方法，在黑麦培养基中心接种致病疫霉(病原菌于20℃下培养10d，菌饼直径0.6cm)，周围对称接种待测菌，每个菌株重复3次，观察有无抑菌带出现。将筛选出的拮抗作用最好的菌株命名为cqusa03。二、菌株cqusa03的鉴定首先对菌株cqusa03进行16srdna序列分析，将该菌株的16srdna序列在线提交到genebank中进行blast比对，发现其与吸水链霉菌(streptomycesangustmyceticus)处于同一个进化分支，同源性达99％以上(系统发育树如图1b所示)。该菌株的16srdna核苷酸序列如seqidno:1所示。随后对cqusa03菌株进行形态学(菌落形态如图1a所示)及生理生化分析。综合测序结果与生理生化分析，本实验保存的从土壤中分离获得的细菌样本cqusa03为吸水链霉菌狭霉素亚种(streptomycesangustmyceticus)。将菌株cqusa03保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏登记号为cgmccno.18715，保藏日期是2019年10月21日，分类命名为streptomycesangustmyceticus，cqusa03在cgmcc办理保藏时检测结果为存活。实施例2、cqusa03与马铃薯晚疫病病原菌及其它病原真菌对峙实验黑麦培养基配制：称取60g黑麦粉，加入500ml无菌水浸泡36小时。过滤，得滤液1，保存备用；滤渣55℃水浴3小时过滤，得滤液2；将滤液1和滤液2混匀，121℃灭菌10分钟过滤，得滤液3；将20g蔗糖、12g琼脂加入滤液3溶解混匀，以无菌水定容至1l，121℃灭菌20分钟。pda培养基配制：在200g新鲜马铃薯煮熟的滤液加入20g葡萄糖、15g琼脂粉后定容至1l，121℃灭菌15分钟。疫霉病原菌生理小种主要有3种类型：a1、a2和自育型。本专利用到的国际标准菌株t30-4属于a1型，源自美国晚疫病；88069和3928a是自育型，pg002是a2型，这3株菌从田间分离获得。将不同马铃薯晚疫病病原菌的生理小种接种至黑麦培养基平板的中央，并在其四周对称地接种吸水链霉菌cqusa03的圆形琼脂块，未接种吸水链霉菌的平板为空白对照组。20℃黑暗培养10d后，测定菌落直径及抑菌率，抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.6)。用于接种的病原菌菌块直径为0.6cm。cqusa03对马铃薯晚疫病病原菌不同生理小种的抑菌效果如图2所示。抑菌率结果如表1所示：与对照组相比，马铃薯晚疫病病原菌t30-4、88069、3928a和pg002受到cqusa03菌株的极显著抑制(p<0.001***)，抑制率最高达100％。表1.cqusa03对马铃薯晚疫病病原菌不同生理小种的抑菌率p<0.001***。将吸水链霉菌cqusa03与马铃薯早疫病病原菌茄链格孢(alternariasolani)、马铃薯枯萎病病原菌尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)和大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)、马铃薯干腐病茄病镰刀菌(fusariumsolani)在马铃薯葡萄糖培养基(pda培养基)上28℃对峙培养5d后，观察对照组和处理组中病原真菌的生长情况，并测定菌落直径及抑菌率，抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.6)。用于接种的病原菌菌块直径为0.6cm。结果如图3所示，马铃薯早疫病病原菌茄链格孢、马铃薯枯萎病病原菌尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌、马铃薯干腐病茄病镰刀菌的菌落生长受到cqusa03菌株的显著抑制。统计抑菌率结果如表2所示。表2.cqusa03对马铃薯不同病原真菌的抑菌率马铃薯病原真菌对照组菌落直径(cm)处理组菌落直径(cm)抑菌率(％)尖孢镰刀菌5.57±0.123.53±0.04**40.93大丽轮枝菌3.33±0.071.37±0.03**50.02茄链格孢5.57±0.133.13±0.17***48.98茄病镰刀菌4.27±0.232.13±0.07***58.31p<0.01**，p<0.001***。实施例3、含有菌株cqusa03的液体菌剂及其制备方法本实施例提供的含有上述菌株cqusa03的液体菌剂是通过如下方法制备获得：(1)菌种活化：将菌株cqusa03接种到燕麦固体培养基上，28℃培养7d。燕麦固体培养基配方为：燕麦2％，琼脂粉2％。(2)种子培养：将活化菌株接种到isp液体培养基中，28℃，200rpm，培养5d，得到种子培养基。isp液体培养基配方为：麦芽糖提取物1％，酵母提取物0.4％，d-葡萄糖0.4％，ph7.0-7.4。(3)液体发酵：将步骤(2)得到的种子培养基按10％(体积百分比)添加到发酵培养基中，发酵温度28℃，罐压0.07mpa，搅拌速率100rpm，通氧量>60％，发酵时间7d。发酵培养基配方为：葡萄糖4％、黄豆饼粉1％、氨基酸粉0.2％、k2hpo40.5％、kh2po40.5％、nacl0.5％、硫酸亚铁0.15％、消泡剂0.2％，ph7.2-7.4。实施例4、液体菌剂对马铃薯晚疫病的室内防治效果及对植物生长的促进效果实验用菌剂：实施例3中制备的含有吸水链霉菌cqusa03的液体菌剂，清水对照。将马铃薯叶片及块茎在含有cqusa03的液体菌剂中浸泡半小时后，擦干液体菌剂，在薯块和叶片上接种晚疫病强致病力病原菌t30-4。所接种叶片及薯块在20℃，75％相对湿度条件下培养5d，清水处理的叶片及薯块为空白对照，以此来判定液体菌剂对马铃薯晚疫病的室内防治效果。培养5d后，结果如图4所示，发现cqusa03液体菌剂侵泡过的薯块和叶片并没有感病，表明吸水链霉菌cqusa03能有效抑制马铃薯晚疫病菌对马铃薯薯块和叶片的侵染。此外，将含有cqusa03的液体菌剂与营养土按1:3的比例混匀种植马铃薯块茎及番茄种子(处理组)，空白对照组(ck)则用清水拌土。每个处理10株植株，重复3次。将处理好的植株放置光照温室中，25℃培养4周后调查植株生长情况(如图5所示)，测定马铃薯和番茄幼苗的平均株高、平均叶长和平均叶宽，统计结果如表3所示，结果表明含有cqusa03的液体菌剂对马铃薯和番茄生长具有显著促进作用。表3.cqusa03液体菌剂对马铃薯和番茄植株生长的促进作用p<0.01**，p<0.05*。序列表<110>重庆大学；中国农业科学院都市农业研究所<120>吸水链霉菌狭霉素亚种及其在防治植物卵菌和真菌病害、促进植物生长中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1427<212>dna<213>人工序列()<400>1tgacgtgaccttcgacgattccctcccacaaggggttgggccaccggcttcgggtgttac60cgactttcgtgacgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcaa120tgctgatctgcgattactagcaactccgacttcatggggtcgagttgcagaccccaatcc180gaactgagaccggctttttgagattcgctccacctcgcggtatcgcagctcattgtaccg240gccattgtagcacgtgtgcagcccaagacataaggggcatgatgacttgacgtcgtcccc300accttcctccgagttgaccccggcagtctcctgtgagtccccatcaccccgaagggcatg360ctggcaacacagaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacac420gagctgacgacagccatgcaccacctgtacaccgaccacaagggggaccctgtctccagg480gttttccggtgtatgtcaagccttggtaaggttcttcgcgttgcgtcgaattaagccaca540tgctccgctgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttagccttgcggccgtac600tccccaggcggggaacttaatgcgttagctgcggcacggacgacgtggaatgtcgcccac660acctagttcccaacgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctcccca720cgctttcgctcctcagcgtcagtatcggcccagagatccgccttcgccaccggtgttcct780cctgatatctgcgcatttcaccgctacaccaggaattccgatctcccctaccgaactcta840gcctgcccgtatcgaatgcagacccggggttaagccccgggctttcacatccgacgtgac900aagccgcctacgagctctttacgcccmataattccggacaacgcttgcgccctacgtatt960accgcggctgctggcacgtagttagccggcgcttcttctgcaggtaccgtcactctcgct1020tcttccctgctgaaagaggtttacaacccgaaggccgtcatccctcacgcggcgtcgctg1080catcaggctttcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggc1140cgtgtctcagtcccagtgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcgtcgccttg1200gtaggccatcaccccaccaacaagctgataggccgcgggctcatccttcaccgccggagc1260tttccaccaccagaccatgcggtcggaggtcgtatccggtattagaccccgtttccaggg1320cttgtcccagagtgaagggcagattgcccacgtgttactcacccgttcgccactaatccc1380ctcccgaaggaggttcatcgttcgactgcatggtaagcactcgtact1427当前第1页1 2 3