白细胞介素11突变体及其在治疗肝纤维化中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体的涉及白细胞介素11突变体及其在治疗肝纤维化中的应用。

背景技术：

当前全球约25％的人患有非酒精性脂肪肝病，虽然非酒精性脂肪肝病可以好转，但治疗不及时将会导致其恶化成非酒精性肝炎^[1]。非酒精性肝炎以肝脏炎症、肝细胞死亡、肝纤维化为特点，最终导致肝硬化、肝癌的产生。其中肝星状细胞(hsc)向肌成纤维细胞转化是造成非酒精性肝炎的重要原因^[2-5]。许多因素可以激活hsc细胞，使其转化成肌成纤维细胞，其中包括促纤维化因子tgfb1、pdgf^[6,7]以及一些促炎因子ccl2、tnfa、ccl5等^[4,7,8]，但靶向这些上游分子会造成严重的副作用^[1,9]。针对非酒精性肝炎的治疗，还有一些靶向代谢的药物，但目前在改善肝纤维化方面未取得良好的效果^[1,9]。而最新的研究表明抑制il11信号通路能够降低肝细胞死亡以及肝纤维化的发生^[10]。同时il11作为tgfb1的下游，作为靶向分子副作用较小，因此il11成为治疗肝纤维化的理想靶点。

il11由多种不同的组织分泌产生，包括胸腺、中枢神经系统、皮肤和结缔组织、肺、骨等，是一种多效细胞因子，可直接作用于、巨噬细胞、淋巴细胞、上皮细胞和肝细胞等，具有促进巨核细胞和血小板生成、调控免疫、抗炎和保护粘膜上皮等功能^[11]。illl开始以前体的形式在细胞中合成，前体由199个氨基酸组成，其中前21个氨基酸是信号肽，将信号肽切除后，形成由178个氨基酸组成的成熟il11，分泌到胞外，发挥其生物学功能。通过对il11的三维结构研究，表明其是由4个α螺旋和连接α螺旋的loop环组成的四螺旋束状结构。a螺旋包括第37-56位氨基酸，b螺旋包括第92-112位氨基酸，c螺旋包括第125-147位氨基酸，d螺旋包括第173-196位氨基酸，相应的ab螺旋之间的loop环包括第57-91位氨基酸，bc螺旋之间的loop环包括第113-124位氨基酸，cd螺旋之间的loop环包括第148-172位氨基酸。il11蛋白表面形成三个受体结合位点^[12,13]，结合位点i参与其与il11rα的结合，包括abloop环的末端和d螺旋的c端氨基酸残基；结合位点ii以及结合位点iii与gp130的结合有关^[14]，其中结合位点ii包括从a螺旋到c螺旋的氨基酸残基；结合位点iii包括d螺旋的n端以及abloop环的前端。

il11信号通路的激活依赖il11与细胞表面受体的结合，il11的受体(iliir)由iliirα和gpl30两个糖蛋白链组成，il11rα具有结合配体的能力，il11先以低亲和力结合il11rα^[15,16]，形成il11-il11rα异源二聚体，该异源二聚体以高亲和力结合gp130形成异源三聚体蛋白。il11-il-llrα-gp130异源三聚体同源二聚化形成六聚体^[17,18]，进而磷酸化激活下游stat信号通路或mapk级联反应^[19,20]。最终，il11通过gp130信号传导链向胞内传递信号，使细胞获得增殖和活化的信号。然而虽然il11信号通路的机理已经有所研究，但是当前并没有令人满意的的针对il11靶点的药物出现。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的提供一种重组人白介素11(il11)突变体及其制备方法。本发明所涉及的突变体除个别氨基酸位点存在突变外，具有与成熟il11相同的氨基酸序列。所述突变体相较于野生型il11具有更强的il11rα结合能力，同时能够抑制gp130二聚化激活，进而有效阻止il11信号通路的传导。所述突变体能够抑制或减少tgfb1诱导的hsc细胞激活(即转化成肌成纤维细胞)，证明所述突变体作为野生型il11的竞争性拮抗剂，起到阻断il11信号通路的作用。构建小鼠nash疾病模型，对nash模型小鼠施用所述突变体，能够降低小鼠肝脏中羟脯氨酸含量，证明所述突变体能够减轻小鼠肝纤维化，达到治疗nash疾病的目的。

本发明提供一个技术方案：

一种重组人白介素11突变体，其氨基酸序列是在seqidno:1的基础上，进行如下三点突变n50r/l67k/s145a。

本发明还提供一个技术方案：

一种治疗非酒精性脂肪肝病的方法，其特征在于：使用权利要求1所述的重组人白介素11突变体。

本发明还提供一个技术方案：

本发明所述的重组人白介素11突变体在用于制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。

本发明还提供一个技术方案：

本发明所述的重组人白介素11突变体在用于制备治疗肝纤维化的药物中的应用。

本发明还提供一个技术方案：

本发明所述的重组人白介素11突变体在用于制备结合il11rα受体的制剂中的应用。

本发明还提供一个技术方案：

本发明所述的权利要求1所述的重组人白介素11突变体在用于制备抑制hsc细胞的激活的制剂中的应用。

本发明通过对il11与受体复合物3d结构分析，通过对特定位置的氨基酸进行点突变，达到改变il11与受体的亲和力，同时改变gp130的信号传导活性的目的。

本发明利用搭桥法pcr将特定位置的氨基酸进行点突变并构建到pet-21a载体上。将pet-21a-hil11突变体质粒转入bl21(de3)大肠杆菌感受态表达相应突变体蛋白。裂解大肠杆菌及包涵体，再进过盐层析和亲和层析，最终获得相应的突变体蛋白。利用elisa实验检测突变体蛋白与受体的亲和力；检测细胞上清中collagen的含量反映hsc细胞激活情况。最终筛选到50号位点的天冬酰胺突变成精氨酸，67号位点的亮氨酸突变成赖氨酸，145号位点的丝氨酸突变成丙氨酸后获得的突变体蛋白，能够以超过野生型il11蛋白40倍以上的亲和力结合il11rα受体，同时能够抑制gp130的二聚化激活。接下来研究il11突变体蛋白的拮抗功能，在存在或不存在il11突变体的情况下，向hsc细胞培养基中加入tgfb1，已知tgfb1能够刺激il11的表达，并诱导hsc细胞向肌成纤维细胞转化。结果表明与对照组相比，含有il11突变体的一组能够有效的抑制hsc细胞的激活，起到拮抗il11，抑制il11信号通路激活的作用。饲喂小鼠胆碱-蛋氨酸缺乏的高脂饮食，建立小鼠nash疾病模型，小鼠皮下注射il11突变体蛋白3周后，检测小鼠肝脏中羟脯氨酸含量，结果表明注射il11突变体的小鼠肝脏中羟脯氨酸含量明显下降，即施用il11突变体能够缓解小鼠肝纤维化。

本发明的il11突变体能以超过野生型il11蛋白40倍以上的亲和力结合il11rα受体，同时能够抑制gp130的二聚化激活，能够有效的抑制hsc细胞的激活，起到拮抗il11，抑制il11信号通路激活的作用，并且动物实验证实其能够明显的缓解小鼠肝纤维化，能用于非酒精性脂肪肝病的治疗，有着广阔的药用前景。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1是pet-21a质粒图谱。将突变后的目的片段插入pet-21载体，构建pet-21a-h11突变体质粒。

图2是il11氨基酸序列及突变位点。成熟il11蛋白氨基酸序列(seqidno:1，取自genbankprotein_id:np_000632.1)，下划线位置表示氨基酸突变位点。

图3是il11突变体诱导il11信号通路激活能力比较图。结果表明与野生型il11蛋白及单点突变的il11突变体蛋白相比，il11三点突变体诱导il11信号通路激活的能力显著降低。其中p<.0001表示组间差别显著。

图4是il11突变体抑制tgfb1诱导的hsc细胞激活图。il11突变体通过竞争性结合il11rα，抑制野生型il1与1il11rα的结合，同时阻止gp130的二聚化激活，以起到抑制tgfb1诱导的hsc细胞激活作用。其中“-”表示样品中未加入该组分，“+”表示样品中加入该组分。其中p<.0001表示组间差别显著。

图5是il11突变体对小鼠nash疾病的作用图。结果表明注射il11突变体的小鼠肝羟脯氨酸含量明显低于相同周数的对照组小鼠，即il11突变体能够缓解小鼠的肝纤维化症状。其中ns表示组间无明显差别，p<.0001表示组间差别显著。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1:白介素11突变体的构建

选用pet-21a作为il-11及其突变体的构建载体。根据il-11的cdna序列，利用以下引物进行pcr扩增：fp:5’-cgcggatccgactacaaagacgatgacgacaagcctgggccaccacctggc-3’,上游引物插入bamhi酶切位点；rp:5’-ccggaattctcacagccgagtcttcagcagcagcagtcc-3’,下游引物插入ecori酶切位点。引物设计时在n端引入flag标签，以便后续蛋白纯化及检测。将扩增出的il-11基因片段与pet-21a质粒载体共同酶切，酶切产物中加入t4dna连接酶及其buffer，室温静置10min。连接产物加入大肠杆菌dh5α感受态中，进行热激转化。放入恒温摇床中活化扩增，随后取活化过的大肠杆菌培养液进行涂板，将其均匀涂布在含有氨苄抗性的lb固体培养板上，37℃过夜培养。挑取培养板上的菌落，将其接种到含有氨苄抗性的lb培养基中进行扩增。将pcr结果为阳性的菌落培养基送测序。选取测序结果完全正确的菌落进行后续培养，扩增提取质粒。所得到的质粒为pet-21a-hil11。利用以下引物：引物1上游5’-ggggaccacagactggat-3’，引物1下游5’-atccagtctgtggtcccc-3’；引物2上游5’-ggagctaagcagctccca-3’,引物2下游5’-gagctgcttagctcc-3’；引物3上游5’-ccctccgcagcctgg-3’,引物3下游5’-ccaggctgcggaggg-3’，通过搭桥pcr法进行特定位点的点突变，得到突变质粒pet-21a-hil11-n50r，pet-21a-hil11-l67k，pet-21a-hil11-s145a，pet-21a-hil11-n50r/l67k/s145a。

实施例2：白介素11及其突变体的表达及纯化

将实施例1中的白介素11质粒pet-21a-hil11及其突变体质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态，放入恒温摇床中活化后，接种到含有氨苄抗性的lb培养基中，37℃培养3小时后，使其od值处于0.4-0.6，随后加入1mmiptg诱导4小时。收集菌体，用细菌裂解液裂解菌体(50mmhepes缓冲液中含有0.1％tritonx-100和150ug/ml溶菌酶，ph＝7.4)30min，将细菌裂解液用超声破碎至无粘稠状态，随后4℃，13000rpm离心20min，弃沉淀，重复两次。为了浓缩粗蛋白，向上清中加入饱和度为60％(nh4)2so4，得到浓缩粗蛋白。用ph＝7.4的50mmhepes缓冲液透析去除盐，再通过flag-ig琼脂糖珠纯化，最终得到大量高纯度的白介素11及其突变体蛋白。

实施例3：白介素11突变体亲和力检测

通过elisa实验评估实施例2中获得的il11及其突变体在50％有效浓度(ec50)时的结合亲和力。0.8μg/ml的重组人il11rα包被elisa板，4℃过夜，未结合il11rα的位点用2％bsa封闭。il11及其突变体用含有1％bsa的pbs稀释成1000ng/ml，250ng/ml，62.5ng/ml，15.63ng/ml，3.91ng/ml，0.98ng/ml的浓度梯度。将il11及其突变体样品按浓度梯度依次加入elisa板中，封板膜封闭，室温孵育2h。洗板后加入检测抗体flag-hrp，封板膜封闭，室温孵育2h。加入washingbuffer，停留1min后，弃去液体，扣干，重复3次以洗去未结合检测抗体。加入tmb显色液，封板膜封闭，室温孵育20-30min。加入终止液，终止显色反应。用酶标仪检测样品在450nm波长处的吸光度值，并用570nm波长处的吸光度值校正。处理数据，最终确定各样品ec50值，结果见下表。

表1il11突变体与il11rα亲和力比较

实施例4：白介素11突变体介导的信号转导能力

研究表明il11信号通路在组织纤维化过程中起到重要作用。为了研究实施例2中重组人il11及其突变体介导il11信号通路激活的能力差异，设计如下实验：培养hsc细胞，向培养基中分别加入相同浓度的重组人白介素11或重组人白介素11突变体蛋白，每组8个样品。培养24h后，收取细胞培养基，因培养基中collagen含量较低，加入浓缩溶液进行浓缩。取样品1ml加入250ul浓缩试剂。涡旋后4℃孵育16h。10000rpm离心3min，弃去上清，留下的即为样品中的collagen。加入100ul0.05m乙酸溶解collagen，得到的即为样品。用天狼星红collagen检测试剂盒(9062；chondrex,redmond,wa)检测样品中的collagen含量，方法如下：取100ul样品加入500ul天狼星红溶液，涡旋后室温孵育20min，10000rpm离心3min，弃去上清后加入洗涤试剂，震荡重悬，10000rpm离心3min，弃去上清。加入250ul提取试剂，涡旋至collagen完全溶解。取200ul加入96孔板中，检测530nm处的od值。标准品按同样的方法处理后，最终经过转换得到样品的collagen含量。通过collagen含量反映静止的hsc细胞向α平滑肌肌球蛋白阳性的肌成纤维细胞转化情况。collagen含量高，证明il11信号通路激活水平更高，进而导致hsc细胞向α平滑肌肌球蛋白阳性的肌成纤维细胞转化的量更高，因而释放collagen量更高。结果如图3所示，加入野生型il11蛋白的实验组中collagen含量明显高于加入il11突变体的实验组，且加入il11n50r/l67k/s145a突变体的实验组collagen含量最低，说明三点突变的il11突变体介导的信号转导能力明显低于单点突变的il11突变体。

实施例5：il11突变体抑制tgfb1诱导的hsc向肌成纤维细胞转化

tgfb1(canonicalprofibroticfactorstransforminggrowthfactor-b1)是促使hsc活化，转化成肌成纤维细胞的重要因子。研究表明tgfb1能够上调hsc细胞中il11的表达和分泌。通过阻断il11信号通路，可以抑制tgfbi诱导的hsc细胞活化，即向肌成纤维细胞转化。为了研究il11突变体对il11信号通路的阻断作用，设计如下实验：用免疫荧光专用培养皿培养hsc细胞，在存在和不存在il11突变体的蛋白的情况下，向hsc细胞培养基中加入相同浓度的tgfb1蛋白诱导hsc细胞活化。培养24h后，弃去培养基并用pbs洗涤。加入4％多聚甲醛固定细胞1h，加入0.3％tritonx-100破膜20min。随后用pbs洗涤3次，每次3min。加入含有0.5％bsa和0.1％tween-20的pbs作为封闭液，封闭1h，加入actc2一抗，4℃孵育过夜。pbst洗去多余一抗后加入荧光二抗室温避光孵育1h。pbst洗去未结合的二抗。加入dapi避光孵育5min，对样品进行染核，用pbst洗去多余dapi。吸干培养皿中多余的液体后，加入甘油封片，盖上盖玻片后将培养皿置于荧光显微镜下观察荧光，统计acta2(即α平滑肌肌球蛋白)阳性细胞率。acta2阳性代表细胞由静止的hsc细胞向α平滑肌肌球蛋白阳性的肌成纤维细胞转化情况。acta2阳性率高，证明il11信号通路激活水平更高，进而导致hsc细胞向α平滑肌肌球蛋白阳性的肌成纤维细胞转化的量更多。结果如图4所示，在存在il11突变体的情况下，加入tgfb1的hsc细胞中，acta2阳性率明显低于对照组，证明il11突变体蛋白的存在能够抑制tgfb1诱导的hsc细胞向肌成纤维细胞转化。

实施例6：il11突变体对nash疾病的作用

取5周大小的c57bl/6n小鼠，随机分成4组，每组6只。实验组通过饲喂胆碱-蛋氨酸缺乏的高脂饲料(hfmcd)诱导nash疾病，对照组饲喂正常饲料。建模6周时，取对照组和一组nash模型小鼠，解剖后取小鼠肝脏组织，检测羟脯氨酸含量，确定建模是否成功。剩余两组nash模型小鼠，建模六周后分别皮下注射il11突变体蛋白(100μg/kg)和盐溶液saline，连续注射3周。建模9周时，解剖后取小鼠肝脏组织，检测羟脯氨酸含量。检测羟脯氨酸含量方法：每只小鼠各取肝脏组织0.2g，剪碎后放入试管中加入6mhcl进行水解，将水解后的样品冷却至室温，12000rpm离心10min，取200ul上清加入100ulddh2o，将样品稀释至4mhcl。样品制备完成后，利用羟脯氨酸检测试剂盒(quickzymebiosciences,leiden,thenetherlands)检测样品中羟脯氨酸含量，实验步骤按照试剂盒说明书进行。结果如图5显示，hfmcd喂食9周的nash模型小鼠中注射il11突变体的小鼠肝脏中羟脯氨酸含量明显低于注射盐溶液的小鼠肝脏中羟脯氨酸含量，且与喂食6周的nash模型小鼠肝脏中羟脯氨酸含量无明显差别。表明il11突变体能够缓解nash疾病中的肝纤维化症状。

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序列表

<110>北京岳昊科技发展有限公司

<120>白细胞介素11突变体及其在治疗肝纤维化中的应用

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