一种释放一氧化氮水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种释放一氧化氮水凝胶及其制备方法。

背景技术：

细菌感染是开放性创伤极易面临的问题，随着抗生素的发现和应用，目前细菌感染已经能得到有效抑制。但是抗生素的长期使用可能导致部分细菌产生耐药性，大大降低感染的治疗效果。光热疗法近年来因为具有广谱抗菌效果而受到广泛关注，该疗法可在近红外(nir)光辐射下由光敏剂产生局部高温杀死细菌。目前开发的具有抗菌作用的纳米粒子(如纳米银)溶液，由于其为液态，难以长期在创面停留，作用时间短，给药频率高，高功率密度和长期暴露于近红外激光下可能损害周围健康组织。

因此，现在急需一种具有抗菌性且能长期在创面停留且对健康组织损伤小的抗菌敷料。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种释放一氧化氮水凝胶及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种释放一氧化氮水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将2-甲基咪唑和乙酸锌的混合水溶液在20～30℃下搅拌反应4～6h后固液分离收集固体沉淀物，洗涤固体沉淀物冷冻干燥得到第一纳米粒子(zif-8)；

(2)将所述第一纳米粒子和n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基-1，4苯二胺(bnn6)分散在乙醇水溶液中搅拌22～26h后得到溶液a，向溶液a加入盐酸多巴胺和氢氧化钠，20～30℃下搅拌反应4～6h后固液分离收集固体沉淀物，洗涤固体沉淀物冷冻干燥得到第二纳米粒子；

(3)将所述第二纳米粒子(bzp)、甲基丙烯酸化明胶(gelma)和氧化葡聚糖(odex)在pbs溶液中分散均匀得到混合体系b，向所述混合体系b中加入光引发剂在波长为365nm～760nm的光下引发交联得到所述释放一氧化氮水凝胶。

上述方法制备的释放一氧化氮水凝胶可以在创面原位成胶，具有抗菌效果，还能对创面起封闭、保水、隔绝外部环境的作用，释放一氧化氮水凝胶中分散有在近红外控制下释放一氧化氮的纳米粒子，光热和一氧化氮协同抗菌的方式可以避免产生耐药性，并且纳米粒子释放的一氧化氮还能够通过在皮肤重建过程中增加成肌纤维细胞和胶原蛋白的产生来促进伤口愈合。本发明方法制备的释放一氧化氮水凝胶具有良好的生物相容性，能够显著促进全层损伤伤口的愈合，促进胶原沉积和抑制细菌生长。上述方法制备的释放一氧化氮水凝胶在伤口敷料，特别是在严重创伤愈合和开放性创伤感染的创面愈合敷料中有很大的应用前景。

优选地，所述氧化葡聚糖的制备方法包括以下步骤：将高碘酸钠加入葡聚糖(dex)溶液中，于20～30℃下避光搅拌反应3～4h后收集反应液中分子量大于3500da的物质，冷冻干燥。

优选地，所述氧化葡聚糖的制备方法中，高碘酸钠和葡聚糖的用量的重量比为(0.5～2):1。

优选地，所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法包括以下步骤：将明胶(gel)和甲基丙烯酸酸酐的混合溶液在48～52℃下搅拌反应1～4h后收集反应液中分子量大于3500da的物质，冷冻干燥。

上述方法制备的释放一氧化氮水凝胶对创面起到了更好的封闭、保水、隔绝外部环境的作用

优选地，所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法中，明胶和甲基丙烯酸酸酐的用量重量比为：(0.95～2.4)：1。

优选地，所述n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基-1，4苯二胺的制备方法包括以下步骤：

在惰性气体保护下将亚硝酸钠溶液与n，n'-二仲丁基氨基对苯二胺乙醇溶液混合，得到混合溶液c，将所述混合溶液c在20～30℃下搅拌20～40分钟后，将盐酸逐滴加入到混合溶液c中，继续搅拌反应至米色沉淀不再产生后收集米色沉淀洗涤干燥。

上述方法制备的释放一氧化氮水凝胶具有更好的缓慢释放一氧化氮的性能，抗菌效果更持久。

优选地，所述n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基-1，4苯二胺的制备方法中，亚硝酸钠与n，n'-二仲丁基氨基对苯二胺的用量摩尔比为：10000:(5～8)。

优选地，所述步骤(3)中，第二纳米粒子、甲基丙烯酸化明胶和氧化葡聚糖的重量比为：(0.2～2)：50：(5～50)。

优选地，所述步骤(1)中，2-甲基咪唑和乙酸锌的重量比为(4～40)：1。

优选地，所述步骤(2)中，所述第一纳米粒子、n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基-1，4苯二胺和多巴盐酸盐的重量比为：(1～2)：1：(0.25～1)。

优选地，所述步骤(2)中，乙醇水溶液的体积分数为30％～40％，氢氧化钠的用量为：氢氧化钠和第一纳米粒子的重量百分比为2.5％～10％；

所述步骤(3)中，光的波长为420nm，光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，光引发剂的用量为：光引发剂与甲基丙烯酸化明胶的重量比为(0.5～1.5)：50。

优选地，所述步骤(1)中，2-甲基咪唑和乙酸锌的重量比为17.74：1，，固液分离收集固体沉淀物的方法为以高于8000rpm的转速离心；

所述步骤(2)中，所述第一纳米粒子、n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基-1，4苯二胺和多巴盐酸盐的重量比为：2：1：0.6，固液分离收集固体沉淀物的方法为以高于8000rpm的转速离心；

所述步骤(3)中，第二纳米粒子、甲基丙烯酸化明胶和氧化葡聚糖的重量比为：1：50：(12.5～50)。

上述方法制备的释放一氧化氮水凝胶能够更好的促进全层损伤伤口的愈合，促进胶原沉积和抑制细菌生长。

本发明还提一种上述任一所述方法制备得到的释放一氧化氮水凝胶。

上述释放一氧化氮水凝胶具有可注射性，可直接应用于创伤表面，原位成胶，能够精准覆盖所有创伤区域，粘附于创伤表面的释放一氧化氮水凝胶不会因患者的机械运动脱落或破裂，并且会在一定的时间内自行降解，能够显著降低传统敷料(如纱布、创可贴)应用的不适感；上述释放一氧化氮水凝胶利用zif-8和bnn6的静电吸附作用，将一氧化氮释放前体bnn6负载到zif-8表面，然后利用多巴胺的自聚合作用，形成表面具有涂层的第二纳米粒子，可以在近红外的激发作用下可控释放一氧化氮，上述释放一氧化氮水凝胶将水不溶性的bnn6直接均匀分散在水凝胶中，提高在水凝胶中的含量，第二纳米粒子表面修饰了具有光热效应的聚多巴胺(pda)涂层，制备得到的第二纳米粒子可对近红外光响应，并触发一氧化氮的释放，不需要外加其他能对近红外响应的材料，而且包封在水凝胶中的纳米粒子可以实现原位长时间停留，可明显减少给药次数和纳米粒子可能存在的体内循环毒性问题。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种释放一氧化氮水凝胶及其制备方法，本发明方法制备的释放一氧化氮水凝胶可以在创面原位成胶，具有抗菌效果，还能对创面起封闭、保水、隔绝外部环境的作用，释放一氧化氮水凝胶中分散有在近红外控制下释放一氧化氮的纳米粒子，光热和一氧化氮协同抗菌的方式可以避免产生耐药性，并且纳米粒子释放的一氧化氮还能够通过在皮肤重建过程中增加成肌纤维细胞和胶原蛋白的产生来促进伤口愈合。本发明方法制备的释放一氧化氮水凝胶具有良好的生物相容性，能够显著促进全层损伤伤口的愈合，促进胶原沉积和抑制细菌生长。本发明方法制备的释放一氧化氮水凝胶在伤口敷料，特别是在严重创伤愈合和开放性创伤感染的创面愈合敷料中有很大的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例的制备方法中明胶和甲基丙烯酸明胶的红外光谱图。

图2为本发明实施例的制备方法中葡聚糖和氧化葡聚糖的红外光谱图。

图3为本发明实施例的制备方法中甲基丙烯酸明胶的核磁氢谱图。

图4为本发明实施例的制备方法中纳米粒子的xrd图。

图5为本发明实施例的制备方法中tem和dls图，其中，(a)第一纳米粒子zif-8，(b)第三纳米粒子zp，(c)第二纳米粒子bzp。

图6为本发明实施例的制备方法中水凝胶的近红外照射升温曲线图。

图7为本发明实施例的制备方法中水凝胶的流变性能结果图。其中，(a)表示对照品混合体系b的时间扫描曲线，(b)水凝胶的时间扫描曲线，(c)表示对照品混合体系b的频率扫描曲线，(d)水凝胶的频率扫描曲线。

图8为为本发明实施例的制备方法中水凝胶的体内创面应用修复结果，(a)为苏木精-伊红染色，(b)为马森三色染色法。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

作为本发明实施例的一种释放一氧化氮水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将35.48g的2-甲基咪唑和2g的乙酸锌溶解在200ml去离子水中得到2-甲基咪唑和乙酸锌的混合水溶液，将2-甲基咪唑和乙酸锌的混合水溶液在20～30℃下下以700rpm搅拌反应5h后收集反应液以8000rpm的转速离心20min后收集沉淀物，用去离子水洗涤沉淀物冷冻干燥得到第一纳米粒子(zif-8)；

(2)将200mg第一纳米粒子和100mg的n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基-1，4苯二胺(bnn6)溶解在30ml的体积分数为40％的乙醇水溶液中以700rpm/min搅拌24h后得到溶液a，向溶液a加入60mg盐酸多巴胺和0.26ml的1m氢氧化钠溶液，在20～30℃下下以700rpm/min搅拌反应5h后收集反应液以8000rpm的转速离心20min后收集沉淀物，用去离子水洗涤沉淀物冷冻干燥得到第二纳米粒子；

(3)将1.0mg的第二纳米粒子(bzp)、50mg甲基丙烯酸化明胶(gelma)和50mg氧化葡聚糖(odex)在1ml的pbs溶液中分散均匀得到混合体系b，向所述混合体系b中加入0.05ml2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)作为光引发剂在波长为420nm的光下引发交联得到所述释放一氧化氮水凝胶；

所述氧化葡聚糖的制备方法包括以下步骤：将5g高碘酸钠加入250ml的葡聚糖(dex)溶液中，于20～30℃下避光搅拌反应3.5h后加入3ml乙二醇溶液搅拌终止反应，通过纤维素透析袋透析收集反应液中分子量大于3500da的物质，在-80℃冷冻干燥得到氧化葡聚糖，高碘酸钠和葡聚糖的用量的重量比为1:1；

所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法包括以下步骤：将1g明胶(gel)和0.6ml甲基丙烯酸酸酐溶解在10ml去离子水中，得到明胶和甲基丙烯酸酸酐的混合溶液，将明胶和甲基丙烯酸酸酐的混合溶液在水浴50℃下以600rpm/min搅拌反应1h后通过透析袋透析收集反应液中分子量大于3500da的物质，-80℃冷冻干燥得到甲基丙烯酸化明胶；

所述n，n'-二仲丁基-n，n'-二亚硝基-1，4苯二胺的制备方法包括以下步骤：将20ml摩尔浓度为6.0m的亚硝酸钠溶液和18ml摩尔浓度为4.27×10^-3m的n，n'-二仲丁基氨基对苯二胺乙醇溶液混合得到混合溶液c，向混合溶液c中通入氮气保护，将所述混合溶液c在20～30℃下搅拌30分钟后，将20ml摩尔浓度为6m的盐酸逐滴加入到混合溶液c中，继续搅拌反应至米色沉淀不再产生后收集米色沉淀，用去离子水和乙醇溶液交替洗涤米色沉淀干燥。

实施例2

作为本发明实施例的一种释放一氧化氮水凝胶的制备方法，本实施例与实施例1的唯一区别为：步骤(3)中，将1.0mg的第二纳米粒子(bzp)、50mg甲基丙烯酸化明胶(gelma)和12.5mg氧化葡聚糖(odex)在1ml的pbs溶液中分散均匀得到混合体系b。

实施例3

作为本发明实施例的一种释放一氧化氮水凝胶的制备方法，本实施例与实施例1的唯一区别为：步骤(3)中，将1.0mg的第二纳米粒子(bzp)、50mg甲基丙烯酸化明胶(gelma)和25mg氧化葡聚糖(odex)在1ml的pbs溶液中分散均匀得到混合体系b。

对比例1

作为本发明对比例的一种水凝胶的制备方法，本对比例与实施例1的唯一区别为：步骤(3)中，将1.0mg的第二纳米粒子(bzp)和50mg甲基丙烯酸化明胶(gelma)在1ml的pbs溶液中分散均匀得到混合体系b。

对比例2

作为本发明对比例的一种水凝胶的制备方法，本对比例与实施例1的唯一区别为：将50mg甲基丙烯酸化明胶(gelma)和50mg氧化葡聚糖(odex)在1ml的pbs溶液中分散均匀得到混合体系b。

对比例3

作为本发明对比例的一种水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将35.48g的2-甲基咪唑和2g的乙酸锌溶解在200ml去离子水中得到2-甲基咪唑和乙酸锌的混合水溶液，将2-甲基咪唑和乙酸锌的混合水溶液在20～30℃下下以700rpm搅拌反应5h后收集反应液以8000rpm的转速离心20min后收集沉淀物，用去离子水洗涤沉淀物冷冻干燥得到第一纳米粒子(zif-8)；

(2)将200mg第一纳米粒子溶解在30ml的体积分数为40％的乙醇水溶液中以700rpm/min搅拌24h后得到溶液a，向溶液a加入60mg盐酸多巴胺和0.26ml的1m氢氧化钠溶液，在20～30℃下下以700rpm/min搅拌反应5h后收集反应液以8000rpm的转速离心20min后收集沉淀物，用去离子水洗涤沉淀物冷冻干燥得到第三纳米粒子(zp)；

(3)将1.0mg的第三纳米粒子(zp)、50mg甲基丙烯酸化明胶(gelma)和50mg氧化葡聚糖(odex)在1ml的pbs溶液中分散均匀得到混合体系b，向所述混合体系b中加入0.05ml2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)作为光引发剂在波长为420nm的光下引发交联得到所述水凝胶；

所述氧化葡聚糖的制备方法包括以下步骤：将5g高碘酸钠加入250ml的葡聚糖(dex)溶液中，于20～30℃下避光搅拌反应3.5h后加入3ml乙二醇溶液搅拌终止反应，通过纤维素透析袋透析收集反应液中分子量大于3500da的物质，在-80℃冷冻干燥得到氧化葡聚糖，高碘酸钠和葡聚糖的用量的重量比为1:1；

所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法包括以下步骤：将1g明胶(gel)和0.6ml甲基丙烯酸酸酐溶解在10ml去离子水中，得到明胶和甲基丙烯酸酸酐的混合溶液，将明胶和甲基丙烯酸酸酐的混合溶液在水浴50℃下以600rpm/min搅拌反应1h后通过透析袋透析收集反应液中分子量大于3500da的物质，-80℃冷冻干燥得到甲基丙烯酸化明胶。

效果例1

1、甲基丙烯酸化明胶(gelma)的傅里叶变换红外光谱(ftir)表征

用溴化钾压片法检测待测样品(gel、gelma、dex、odex)，使用傅里叶红外光谱仪测定红外光谱。图1和图2中给出了gel、gelma、dex、odex的ftir光谱。其中，在3276cm^-1处的吸收峰为-nh2的伸缩振动，1668cm^-1处的峰为酰胺ⅰ谱带c＝o伸缩振动。这表明甲基丙烯酸化明胶(gelma)中甲基丙烯酸酐已经成功接枝到明胶分子主链上。

2、甲基丙烯酸化明胶(gelma)的核磁表征

精确称取甲基丙烯酸化明胶样品20mg，溶于氘代重水，600m核磁共振仪检测1hnmr。结果如图3所示，与明胶分子相比，在5.34ppm和5.58ppm出现两个新的特征峰，表明甲基丙烯酸基团成功接枝到明胶分子的主链上。

3、纳米粒子的xrd表征

干燥后的第一纳米粒子(zif-8)、第二纳米粒子(bzp)和第三纳米粒子(zp)，用x射线多晶衍射仪(xrd)分析其晶体结构。

结果如图4所示，zif-8的特征峰出峰位置与文献值一致，用第二纳米粒子(bzp)和第三纳米粒子(zp)的出峰位置与zif-8相比没有改变，说明经过改性后的粒子并没有改变其原有的结构。

4、纳米粒子的透射电镜(tem)和激光纳米粒度仪(dls)分析

透射电镜拍摄第一纳米粒子(zif-8)、第二纳米粒子(bzp)和第三纳米粒子(zp)，用激光纳米粒度仪测定第一纳米粒子(zif-8)、第二纳米粒子(bzp)和第三纳米粒子(zp)的水化直径及其分布。

结果如图5所示，zif-8呈典型的正六边形结构，粒径在248.5±2.458左右；经过改性的粒子表面被多巴胺包裹，形貌改变，由于制备时溶剂为乙醇，在反应过程中可能对zif-8的结构产生破坏，因此得到的纳米粒子粒径减小。

5、水凝胶的升温曲线

将实施例1的释放一氧化氮水凝胶、对比例2的水凝胶和对比例3的水凝胶用波长为808nm的激光器对凝胶照射10min，激光器的功率为2w/cm²，记录水凝胶每分钟的温度变化，结果如图6所示，相比于对比例2的水凝胶，实施例的释放一氧化氮水凝胶温度可上升25℃，实施例1的释放一氧化氮水凝胶可以利用高温和一氧化氮的活性氧作用可以实现广谱杀菌，不会产生抗生素过度使用导致的耐药性问题。

6、水凝胶的流变测试

利用旋转流变仪对实施例2、实施例3、对比例1的水凝胶的流变学性能进行测试。其中，时间扫描的温度为25℃，频率为1hz，扫描时间为600s。频率扫描的频率变化范围为0.1hz～100hz。分别以实施例2、实施例3、对比例1得到的混合体系b作为对照品。

结果如图7所示，时间扫描显示实施例2、实施例3、对比例1的水凝胶的储能模量g’均高于损耗模量g”，说明已经是凝胶状态。频率扫描在0.1hz～10hz之间时，储能模量和损耗模量的变化不明显，基本呈现一条直线，说明水凝胶的结构稳定。当频率逐渐上升至100hz时，实施例2、实施例3、对比例1的水凝胶的储能模量和损耗模量有明显的上升，表明该水凝胶能抵抗一定的形变，相比而言，实施例2、实施例3的水凝胶的抵抗形变的性能优于对比例1，实施例3的水凝胶的抵抗形变的性能优于实施例2。

7、水凝胶体内创面修复结果

分别应用实施例1、对比例2、对比例3的水凝胶在近红外光和没有近红外光的情况下对体内创面进行修复，并且设置空白对照(control)，利用苏木精-伊红(h&estain)染色和马森三色染色法(masson‘strichromestain)对修复第3、7和14天的皮肤组织进行组织学染色分析，结果如图8所示。相比于未经任何处理的control组，其余各组表皮层在第14天生长完整，且与真皮层紧密贴合。实施例1的水凝胶在近红外光(nir)下修复，使得具有明显的乳头层结构，有皮脂腺长出，说明修复效果最好。图8(a)显示的为h&e染色的结果，可以明显看出实施例1的水凝胶在近红外光(nir)下具有最好的修复效果，表皮层的再生速度最快，并且在14天时出现新生的皮脂腺。图8(b)显示的为马森染色的结果，着色越深说明胶原沉积越多，实施例1的水凝胶在近红外光(nir)下显示出最多的胶原沉积。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。