新型破囊壶菌属菌株及使用其生产多不饱和脂肪酸的方法与流程

本公开涉及包含高含量的多不饱和脂肪酸的破囊壶菌属(thraustochytriumgenus)的菌株、由该菌株生产的生物质、包括该菌株的脂质、以及生产多不饱和脂肪酸的方法。
背景技术：
：多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸(dha)是大脑、眼组织和神经系统必需的脂肪酸，且已知对婴儿视敏度和运动神经元能力的发育发挥重要作用。据报道，在痴呆患者的大脑中dha的量显著减少，且新发现dha具有多种抗衰老功能(如老花眼老视中黄斑变性的抑制)。进一步，据报道，dha也可用作鱼的饲料添加剂(韩国专利申请公开号10-2007-0040751)。由于大多数高等动物(包括人类)不能顺利合成正常生物功能所需的多不饱和脂肪酸，它们必须将多不饱和脂肪酸作为必需营养素摄入，且世界卫生组织(worldhealthorganization)建议以至少1g/天稳定消费含dha的多不饱和脂肪酸。传统上，dha多不饱和脂肪酸的供应来源是占据海洋生态系统顶层的深海鱼类(如金枪鱼和三文鱼)。然而，随着海洋环境污染的加剧，由于污染物(诸如包括汞的重金属、环境激素和放射性物质)在深海鱼类体内的积累，深海鱼类的摄入风险正在增加。因此，作为安全且可靠供应dha多不饱和脂肪酸油的新手段，破囊壶菌属的微藻具有非常重要的工业价值。已提出了在破囊壶菌属的微藻中用于基因过表达的多种方法。自martec公司首次引入使用乙酰乳酸合成酶作为选择标记的破囊壶菌属微藻的遗传转化方法以来，报道了使用多种抗生素抗性基因作为选择标记的破囊壶菌属微藻的转化技术。具体地，韩国专利申请公开号2015-0084148公开了“用于增加微藻生物质和脂质生产率的重组载体及其用途”。然而，到目前为止，由破囊壶菌属微藻开发的遗传转化技术是将共同导入的基因插入到染色体dna中的染色体整合方法，虽然具有插入的基因被稳定维持的优点，但与使用具有自我复制能力的着丝粒质粒或游离体质粒的基因表达方法相比，在基因拷贝数和表达控制方面受到限制。技术实现要素：技术问题因此，本发明人通过突变破囊壶菌属的kc01微藻，已经开发了二十二碳六烯酸的含量和生产率提高的微藻，并已经建立了包括含有二十二碳六烯酸的脂质的生物质以及通过培养这些微藻生产生物油的方法。基于这些开发和建立，已经完成了本公开。技术方案本公开的一个目的是提供与野生微藻相比二十二碳六烯酸(dha)的生产量增加而氨基酸的生产量减少的破囊壶菌属的cjm01微藻(保藏号：kctc13538bp)。本公开的另一个目的是提供生产生物质的方法，包括以下步骤：培养破囊壶菌属的cjm01微藻；以及从微藻、其培养产物、其干燥产物、或其粉碎产物中回收含有二十二碳六烯酸(dha)的生物质。本公开的又一个目的是提供生产生物油的方法，包括以下步骤：培养破囊壶菌属的cjm01微藻；以及从微藻、其培养产物、其干燥产物、或其粉碎产物中回收含有二十二碳六烯酸(dha)的脂质。有益效果根据本公开的破囊壶菌属的新型cjm01微藻，氨基酸的生产量显著减少，并且生物质中脂肪的含量和不饱和脂肪酸(如二十二碳六烯酸)的含量高，使得微藻本身、通过培养和发酵微藻生产的生物质、生物质的浓缩物、以及生物质的干燥产物作为饲料组合物非常有用。附图说明图1是显示通过光学显微镜观察到的破囊壶菌属的kc01菌株的照片。图2显示破囊壶菌属的kc01菌株、破囊壶菌属的菌株、橙黄壶菌属(aurantiochytriumgenus)的菌株、和裂殖壶菌属(schizochytriumgenus)的菌株之间的系统树。具体实施方式以下，将详细描述本公开。同时，本文公开的实施方式的具体结构和功能描述仅用于其它实施方式的说明性目的。在不脱离本公开的精神和显著特征的情况下，本公开可以以许多不同的形式体现。因此，本公开的实施方式仅出于说明性目的被公开，而不应被解释为限制本公开。为了实现上述目的，本公开的一个方面提供了破囊壶菌属的cjm01微藻，通过破囊壶菌属的cjm01微藻，与野生微藻相比，二十二碳六烯酸(dha)的生产量增加且氨基酸的生产量减少。如本文所用，术语“破囊壶菌属的菌株”是指有机异养微藻，其作为含有高浓度各种多不饱和脂肪酸(包括二十二碳六烯酸(dha))的三酰甘油的供应源发挥重要作用。进一步，“微藻”是指因为它无法被肉眼看到，只能通过显微镜才能看到且在水中自由漂浮的活的生物体，并且也被称为浮游植物。如本文所用，例如，用γ射线照射破囊壶菌属的野生kc01菌株以产生突变菌株，从突变菌株中选择含有多不饱和酸的油的生产能力提高的菌株，并且这些菌株被命名为破囊壶菌属的cjm01菌株，于2018年5月30日保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国典型培养物保藏中心(kctc)，并授予保藏号kctc13538bp。进一步，本公开的破囊壶菌属的cjm01微藻可以具有seqidno.1的18srrna，但本公开不限于此。如本文所用，术语“二十二碳六烯酸(dha)”是式c22h32o2代表的多不饱和脂肪酸中的一种，并且是从蓝色鱼(如金枪鱼或沙丁鱼)中大量提取的物质。进一步，二十二碳六烯酸(dha)与二十碳五烯酸(epa)和α-亚麻酸(ala)同属于ω3。与作为亲本菌株的破囊壶菌属的kc01菌株相比，本公开的破囊壶菌属的cjm01微藻可包含大量的二十二碳六烯酸(dha)。具体地，基于微藻中包含的脂肪酸的总重量，cjm01微藻可包含二十二碳六烯酸(dha)的量为30wt％至65wt％、30wt％至60wt％、40wt％至65wt％、或40wt％至60wt％，但本公开不限于此。此外，与作为亲本菌株的破囊壶菌属的kc01菌株相比，本公开的破囊壶菌属的cjm01微藻可具有提高的二十二碳六烯酸(dha)生产率。二十二碳六烯酸(dha)生产率可通过1小时生产的二十二碳六烯酸(dha)的浓度(g/l)来测量。本公开的微藻可以具有0.4至0.8(g/l/h)、0.4至0.7(g/l/h)、0.5至0.8(g/l/h)、或0.5至0.7(g/l/h)的二十二碳六烯酸(dha)生产率，但本公开不限于此。同时，与作为亲本菌株的破囊壶菌属的kc01菌株相比，在本公开的破囊壶菌属的cjm01微藻中，氨基酸的生产量可以减少。具体地，本公开的破囊壶菌属的cjm01微藻或其培养液可以不包含选自天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和精氨酸中的至少一种氨基酸。例如，如实施例2中所见，可能无法从本公开的破囊壶菌属的cjm01微藻的培养液中检测到天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、和精氨酸。例如，与作为亲本菌株的破囊壶菌属的kc01菌株相比，本公开的破囊壶菌属cjm01微藻的氨基酸总生产量可以减少90％或更多、95％或更多、97％或更多、或99％或更多。这表明cjm01菌株与kc01亲本菌株相比将提供的碳源更有效地用于二十二碳六烯酸的生物合成途径中。具体地，由于本公开的破囊壶菌属的cjm01微藻很少生产氨基酸，因此菌株的培养液可以仅包含0.1至20mg/l、0.1至15mg/l、0.1至10mg/l、0.1至7mg/l、或0.1至5mg/l的量的氨基酸。本公开的另一方面提供了生产生物质的方法，包括以下步骤：培养破囊壶菌属的cjm01微藻；以及从微藻、其培养产物、其干燥产物、或其粉碎产物中回收含有二十二碳六烯酸(dha)的生物质。进一步，生物质可制成干菌体的形式，但本公开不限于此。本公开提供了通过该方法生产的生物质。基于生物质总重量，生物质可包括二十二碳六烯酸(dha)的量为15至40wt％、20至35wt％、或25至30wt％，但本公开不限于此。本公开的又一方面提供了生产生物油的方法，包括以下步骤：培养破囊壶菌属的cjm01微藻；以及从微藻、其培养产物、其干燥产物、或其粉碎产物中回收含有二十二碳六烯酸(dha)的脂质。本公开提供了通过该方法生产的生物油。基于脂肪酸总重量，生物油可以包括的二十二碳六烯酸(dha)的量为30至65wt％、30至60wt％、40至65wt％、或40至60wt％，但本公开不限于此。具体地，根据本公开的生产生物油的方法可以包括以下步骤：培养破囊壶菌属的cjm01微藻；由微藻、其培养产物、其干燥产物、或其粉碎产物生产含有二十二碳六烯酸(dha)的生物质；以及从生产的生物质回收含有二十二碳六烯酸(dha)的脂质。然而，本公开不限于此。“破囊壶菌属”和“二十二碳六烯酸”如上文所述。如本文所用，“生物油”通过生物提取工艺、热化学提取工艺、或物理化学提取工艺从生物质获得。根据本公开生产的生物油可以包括多不饱和脂肪酸，具体地，二十二碳六烯酸，但本公开不限于此。另外，“生物质”是指可被用作化学能的生物体(如植物、动物、微生物)，即生物能的能量源。此外，生物质在生态学上也是指在单位时间和空间内存在的特定生物体的重量或能量的量。进一步，虽然生物质包括细胞分泌的化合物，但其也可以包括细胞外物质以及细胞和/或细胞内的内容物。如本文所用，生物质可以是破囊壶菌属的cjm01微藻本身、其培养产物、其干燥产物、其粉碎产物、或通过培养或发酵微藻生产的产物，或者可以是生物质的浓缩物或生物质的干燥产物。然而，生物质不限于此。如本文所用，破囊壶菌属cjm01微藻的培养产物是指通过培养微藻而获得的产物，且具体地，可以是包括微藻的培养液或不包括微藻的培养液，但本公开不限于此。如本文所用，破囊壶菌属cjm01微藻的培养产物是指通过从微藻中移除水分而获得的产物，并且具体地，可以以干菌体的形式制作，但本公开不限于此。如本文所用，破囊壶菌属的cjm01微藻的粉碎产物统称为通过粉碎微藻而获得的产物，并且可以以上清液或丸粒的形式制作，但本公开不限于此。破囊壶菌属的cjm01微藻本身、其培养产物、其干燥产物、或其粉碎产物包含二十二碳六烯酸，并且可以用于生产生物质或生物油。如本文所用，术语“培养”是指微藻在适度控制的环境条件下生长。根据本公开的培养过程可以根据适当的培养基和培养条件进行。本领域技术人员可以根据所选择的微藻容易地调节这样的培养过程。具体地，根据本公开的破囊壶菌属的cjm01微藻的培养可以在异养条件下进行，但本公开不限于此。本文所用，“异养营养”是依赖从体外能量(营养)源获得的有机物的营养形式，且是对应于独立营养的术语。根据本公开的破囊壶菌属的cjm01微藻可以通过优化异养条件下的碳源或氮源的培养基的组成来提高二十二碳六烯酸的量和生产率。进一步，如本文所用，术语“异养营养”可与“暗培养”互换使用。另外，培养微藻的步骤没有特别限制，且可以通过已知的分批培养法、已知的连续培养法、补料分批培养法等进行。在培养本公开的微藻中使用的培养基和其它培养条件只要可以通常用于培养微藻，则可以不受限制地使用。具体地，本公开的微藻可以在包含碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸、和/或维生素的一般培养基中，同时在需氧条件下调节温度、ph等来进行培养。具体地，可以通过使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)来调节最佳ph(例如ph为5至9、具体地，ph为6至8、且最具体地，ph为6.8)，但本公开不限于此。进一步，可以向培养物中注入氧气或含氧气体以维持培养物的需氧状态，或者可以向培养物中注入氮气、氢气、或二氧化碳气体而不注入氧气或含氧气体以维持培养物的厌氧或非需氧状态，但本公开不限于此。进一步，培养温度可维持在20℃至45℃，具体地，25℃至40℃，并且培养可进行约10至160小时，但本公开不限于此。此外，在培养期间，可以通过使用诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来抑制气泡的形成，但本公开不限于此。根据本公开的破囊壶菌属的cjm01微藻的培养可以通过使用包含碳源和氮源的培养基进行。如本文所用，术语“培养基”是指用于培养本公开的微藻的培养基和/或在培养微藻之后获得的产物。培养基既可以具有包含微藻的形式，也可以具有通过离心、过滤等从包含微藻的培养液中移除微藻而获得的形式。另外，在用于本公开的培养基中，作为碳源，可以单独或组合使用糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、糖蜜、淀粉、和纤维素)，脂肪和油(大豆油、向日葵籽油、花生油、和椰子油)，脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸、和亚油酸)，醇(例如，甘油和乙醇)，和有机酸(例如，乙酸)。具体地，碳源可以是选自葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、和甘油中的至少一种，但只要其能够用于培养微藻就不受限制。进一步，在本公开中使用的培养基中，可以使用具有浓度为10至50g/l、10至40g/l、20至50g/l、20至40g/l、或25至35g/l的葡萄糖作为碳源，但本公开不限于此。在本公开中使用的培养基的氮源可分为有机氮源和无机氮源，但这些有机氮源和无机氮源可单独使用或组合使用。具体地，氮源可以是选自酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、和胰蛋白胨的有机氮源，或者可以是选自醋酸铵、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、尿素、和谷氨酸一钠(msg)的无机氮源。进一步，在用于本公开中的培养基中，氮源的实例可包括酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠、和msg，但只要其可用于培养微藻就不限于此。具体地，酵母提取物可以以0.1至10g/l、0.5至10g/l、0.5至7g/l、0.5至5g/l、0.5至3g/l、0.5至2g/l、或0.5至1.5g/l的浓度被包含于培养基中，硫酸铵可以以1至5g/l、1至4g/l、2至5g/l、或2至4g/l的浓度被包含于培养基中，硝酸钠可以以0.1至10g/l、0.5至9g/l、1至9g/l、2至9g/l、3至9g/l、5至9g/l、或7至9g/l的浓度被包含于培养基中，且msg可以以0.1至2g/l、0.1至1.5g/l、0.5至2g/l、或0.5至1.5g/l的浓度被包含于培养基中。然而，本公开不限于此。为了本公开的目的，由于cjm01菌株的特征在于，它们没有氨抑制并且可以在宽盐浓度下生长，因此可以考虑这些特征适当地调节碳源和氮源。在本公开中使用的培养基中，作为磷源，可以单独使用或组合使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、和与其对应的含钠盐，但本公开不限于此。培养基可包括其它金属盐(例如，硫酸镁和硫酸铁)、氨基酸、和必需的促生长物质(如维生素)。在从培养步骤中培养的微藻、其培养产物、干燥产物、或其粉碎产物中回收生物质的步骤中，可以使用本领域已知的合适方法收集所期望的生物质。在回收培养步骤中生产的二十二碳六烯酸的步骤中，可以通过使用本领域已知的合适方法从微藻本身或其培养产物中收集所期望的二十二碳六烯酸。例如，可以从通过本领域已知的合适方法培养的微藻、其培养产物、其干燥产物、或其粉碎产物中回收期望的生物质或期望的二十二碳六烯酸，并且在这种情况下，可以使用离心、过滤、阴离子交换层析、结晶、hplc等。回收生物质或二十二碳六烯酸的步骤可附加包括分离步骤和/或纯化步骤。例如，脂质和脂质衍生物(如脂肪醛、脂肪醇和烃(例如烷烃))可以通过疏水溶剂(如己烷)提取(frenz等人1989,enzymemicrob.technol.,11:717)。脂质和脂质衍生物也可以通过使用液化(sawayama等人1999,biomassandbioenergy17:33-39和inoue等人1993,biomassbioenergy6(4):269-274)；油液化(minowa等人1995,fuel74(12):1735-1738)；和超临界co2萃取(mendes等人2003,inorganicachimicaacta356:328-334)来提取。进一步，已知的微藻脂质回收方案公开了包括以下步骤的方法：i)使用离心收集细胞，用蒸馏水洗涤收集的细胞，然后冷冻干燥洗涤的细胞以获得细胞粉末，以及ii)在研钵中粉碎获得的细胞粉末，然后使用正己烷提取脂质[miaoandwu,biosourcetechnology(2006)97:841-846]。本公开的又一方面提供了组合物，其包括破囊壶菌属的cjm01微藻、其培养产物、其干燥产物、或其粉碎产物。组合物可以包括使用微藻生产的生物质或生物油。破囊壶菌属的cjm01微藻、其培养产物、其干燥产物、和其粉碎产物如上所述。使用微藻生产的生物质或生物油也如上所述。为了制备包含高含量二十二碳六烯酸的组合物，可以使用本公开的微藻。组合物可以溶液、粉末、或悬浮液的形式制备，但本公开不限于此。更具体地，可以提供包含破囊壶菌属的cjm01微藻、其培养产物、其干燥产物、或其粉碎产物的食品组合物、饲料组合物、或饲料添加剂。如本文所用，术语“饲料”是指用于食用、摄入和消化的动物食物，或指任何合适的天然或人工饮食、一餐、或一餐的成分。根据本公开的饲料——其包含用于预防或治疗代谢性疾病的组合物作为活性成分——可以制成本领域已知的各种类型的饲料，且其具体实例可以包括浓缩饲料、粗饲料、和/或特殊饲料。本文所用，术语“饲料添加剂”是指添加到饲料中以达到各种效果(如营养补充、防止体重下降、提高饲料中纤维素的消化利用率、改善油脂品质、预防繁殖障碍、提高受胎率、以及预防夏季高温胁迫)为目的的物质。本公开的饲料添加剂对应于饲料管理法下的补充饲料，并且可以进一步包括矿物制剂(如碳酸氢钠、皂土、氧化镁、或复合矿物)；是痕量矿物的矿物制剂(如锌、铜、钴、或硒)；维生素制剂(如胡萝卜素、维生素e、维生素a、维生素d、维生素e、烟酸、或维生素b复合物)；保护性氨基酸制剂(如甲硫氨酸或赖氨酸)；保护性脂肪酸制剂(如脂肪酸钙盐)；活菌制剂(如益生菌(乳酸菌)、酵母培养物、或霉菌发酵产物)；和酵母制剂。如本文所用，术语“食品组合物”包括所有类型的食品(如功能性食品、营养补充剂、保健食品、和食品添加剂)。上述食品组合物可以根据本领域公知的方法以各种形式生产。本公开提供了生产包含生物质或生物油的组合物的方法。生物质、生物油和组合物如上所述。在生产生物油的以上方法中，可以通过在异养条件下，在包含特定组成的碳源和特定组成的氮源的培养基中，培养具有二十二碳六烯酸高生产率的破囊壶菌属的cjm01微藻的步骤，来生产包含高含量二十二碳六烯酸的生物油。实施例以下，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅仅是说明本公开，并且本公开的范围不限于这些实施例。本公开的cjm01微藻是属于破囊壶菌科(thraustochytridfamily)的微藻，并且具有生产高含量的多不饱和脂肪酸(包括二十二碳六烯酸)的能力。本公开的cjm01微藻具有seqidno.1代表的18srrna基因的dna核苷酸序列，且在异养条件下而非在光培养的生长条件下，具有高含量的生物质。在以下的实施例中，将更详细地描述实验方法。实施例1：破囊壶菌科的kc01微藻的分离为了分离破囊壶菌科的微藻菌株，进行了以下实验。具体地，从韩国庆尚南道的巨济与统营地区的20个沿海地区采集了海水、土壤和叶片环境样品。然后，将这些样品保存在10℃的冰盒中，并带到实验室。样品在2至3天内被用于细菌分离工作。将这些样品直接涂抹在琼脂培养基上，然后使用液体松粉施用方法分离了破囊壶菌菌株。将包括通过显微镜观察到的微藻样形态的样品涂抹在了iyp培养基上用于微生物分离(1g/l酵母提取物、1g/l蛋白胨、2g/lmgso4·7h2o、20g/l海盐、5.0mg/lh3bo3、3.0mg/lmncl2、0.2mg/lcuso4、0.05mg/lnamo4·2h2o、0.05mg/lcoso4、0.7mg/lznso4·7h2o、和15g/l琼脂)，以获得菌落。将获得的菌落进行多次继代培养以纯化和分离，然后只选择并分离形成游动孢子囊(其是破囊壶菌微藻典型特征)的菌株。使用盐度为1.5％的灭菌海水稀释和洗涤通过显微镜观察无法确认的环境样品，然后将这些样品用松粉喷洒并培养。将通过在与各采集环境相似的温度和ph条件下培养得到的微生物群落涂抹在了iyp培养基上进行微生物分离和继代培养以纯化和分离。在这种情况下，在调节其浓度的同时引入抗生素混合物混合溶液(0至500mg/l硫酸链霉素、0至500mg/l氨苄青霉素、0至500mg/l青霉素g、和0至500mg/l硫酸卡那霉素)，并且由此控制了其他微生物的生长和污染。使用iggyp培养基(甘油10g/l、葡萄糖10g/l、酵母提取物1g/l、蛋白胨1g/l、mgso4·7h2o2g/l、太阳盐20g/l、h3bo35.0mg/l、mncl23.0mg/l、cuso40.2mg/l、namo4·2h2o0.05mg/l、coso40.05mg/l、znso4·7h2o0.7mg/l、和维生素混合溶液10ml/l)，将分离的菌落在15℃至28℃的温度下以50至200rpm的转速在500ml烧瓶中培养约7天。最终选择了一种生长速度快并且培养条件不复杂的微藻，并回收了菌体。使用光学显微镜观察了选择的菌株的形态(如图1中所示)。用磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.5)洗涤选择的菌体，然后在55℃下在干燥烘箱中干燥16小时以获得干菌体。为了最终选择的微藻菌株的分子鉴定，分析了18srrna基因序列。从选择物种的纯分离菌落中分离了dna，然后使用用于18srrna区域的基因扩增的引物通过聚合酶链反应(pcr)扩增了18srrna。用于基因扩增的引物概述于下表1中。[表1]引物序列(5'-3')seqidno.18s-001faacctggttgatcctgccagta218s-013rccttgttacgacttcaccttcctct3在这种情况下，在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行了pcr共25个循环：在95℃下变性30秒；在52℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分30秒。之后，在72℃下进行了聚合反应7分钟。作为使用扩增反应溶液分析核苷酸序列的结果，获得了大小为约1792bp的核苷酸序列1(seqidno.1)。作为ncbiblast检索的结果，发现了核苷酸序列1与先前报道的破囊壶菌属菌株具有约99％的同源性，且与橙黄壶菌属和裂殖壶菌属菌株具有约84％的同源性。因此，表现出了菌株间的系统树，且其结果示于图2中。相应菌株经鉴定为破囊壶菌科破囊壶菌属的微藻，且因此命名为破囊壶菌属的kc01。实施例2：突变微藻的开发实施例2-1：通过人工突变方法的突变微藻的选择在本公开中，进行了以下实验，以通过对实施例1中分离的破囊壶菌属的kc01菌株γ射线照射突变而分离二十二碳六烯酸(dha)的生产率提高的菌株。具体地，在gyep培养基(葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、和太阳盐2％)中培养了破囊壶菌属的kc01菌株24小时以活化菌株。将活化菌株接种到在121℃下已经灭菌15分钟的继代培养基(葡萄糖5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、和太阳盐2％)中并培养14小时，然后回收了菌体。将回收的菌体悬浮在50ml的pbs缓冲液中，用剂量为1至5kgy的γ射线照射1小时，然后使用500ml烧瓶在28℃温度下以120rpm转速在50ml的基本培养基(葡萄糖5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、和太阳盐2％)中培养了2天。然后，当死亡率为99％时，将悬浮菌体适当稀释，并在gyep平板培养基(葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、和太阳盐2％、琼脂2％，ph7.0)中继代培养2次。首先，选择了颜色变白的菌落，以选择预测除了含多不饱和脂肪酸的油之外生产的硫酸化色素减少的菌株。通过上述方法获得的突变菌株被命名为破囊壶菌属的cjm01菌株，于2018年5月30日保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国典型培养物保藏中心(koreancollectionfortypecultures)(kctc)，并授予保藏号kctc13538bp。实施例2-2：新分离的微藻和突变菌株生产含有多不饱和脂肪酸的油的能力的分析为了比较cjm01菌株生产含有多不饱和脂肪酸的油的能力和kc01菌株生产含有多不饱和脂肪酸的油的能力，如下培养了选自实施例2-1的cjm01和kc01菌株。具体地，为了培养根据本公开的破囊壶菌属的微藻cjm01和kc01菌株，将cjm01和kc01菌株在mjw01培养基(葡萄糖30g/l、mgso4·7h2o3.0g/l、na2so410g/l、nacl1.0g/l、酵母提取物9.0g/l、msg·1h2o1.0g/l、nano31.0g/l、kh2po40.1g/l、k2hpo40.5g/l、cacl20.5g/l、和维生素混合溶液10ml/l)中，在28℃、300rpm、1vvm、和ph7.5的基本培养基条件下培养了约4天。通过离心回收了菌体，用pbs缓冲液洗涤三次，然后在55℃下干燥了12小时以测量菌体的重量。如下测量了利用干燥的菌体的含有二十二碳六烯酸的油的含量。具体地，将8.3m盐酸溶液应用于2g干燥的菌体，以在80℃下水解微藻的菌体细胞壁，向干燥的菌体加入30ml乙醚和20ml石油醚并搅拌30秒，然后将混合物进行离心分离。这个程序重复了三次或更多。然后，回收了分离的溶剂层，将其放入预先测量了重量的圆底烧瓶中，用氮气吹扫以移除溶剂，然后放入已经移除了水分的容器中，并干燥。测量了干燥油的重量以计算总油含量。用甲醇性0.5nnaoh和14％三氟硼烷甲醇(bf3)对油进行预处理后，通过色谱法测量油中dha的含量。通过以上方法培养的破囊壶菌属的kc01菌株的培养性能和通过γ射线照射选择的cjm01突变菌株的培养性能在表2和表3中给出。从表2和表3中发现，生产了dha(其是高度功能性的ω-3油)。表2和表3中的“生物质”是指培养液中菌体的浓度，并且可以与细胞干重(dcw)互换使用。dha的含量以其相对于生物质或总脂肪酸(tfa)的含量表示。如以下结果所示，发现与亲本菌株(破囊壶菌属的kc01菌株)的dha生产量相比，cjm01突变菌株的dha生产量提高了(参见表2和表3)。具体地，与kc01菌株的dha生产量相比，cjm01突变菌株的dha生产量增加了约1.3倍。进一步，发现因为在菌体没有减少的情况下培养时间显著缩短，与kc01菌株的dha生产率相比，cjm01突变菌株的dha生产率增加了约1.7倍。[表2]根据破囊壶菌属kc01亲本菌株的培养的二十二碳六烯酸(dha)的含量和生产率[表3]根据破囊壶菌属cjm01突变菌株的培养的二十二碳六烯酸(dha)的含量和生产率从以上结果发现与作为亲本菌株的kc01菌株相比，作为突变菌株的cjm01菌株具有增加的dha含量和提高的dha生产率。实施例2-3：新分离的微藻和突变菌株生产氨基酸的能力的分析为了评价cjm01菌株的培养特性，测定了以上培养液中氨基酸的总含量。具体地，从以上各培养液中收集了10ml样品，用蒸馏水稀释20倍，并过滤，然后使用液相色谱法分析了氨基酸的总含量。作为分析氨基酸总浓度的结果，在kc01亲本菌株的培养液中分别检测出10mg/l以上的天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、和精氨酸，而在dha含量提高的cjm01菌株的培养液中检测不到大多数的氨基酸。具体地，发现在cjm01突变菌株的情况下，与kc01亲本菌株相比，作为dha以外的副产物的氨基酸的总浓度平均降低了约99％或更多(见表4)。因此，发现在cjm01突变菌株的情况下，与kc01亲本菌株相比，菌体的生长处于等同水平，并且与菌体的含量相比，脂质的总含量没有大幅降低，且因此与kc01亲本菌株相比，cjm01突变菌株更有效地将所供应的碳源用于dha生物合成机制。[表4]根据破囊壶菌属的kc01亲本菌株和破囊壶菌属的cjm01突变菌株的培养的培养液中总氨基酸的分析实施例3：培养基条件的优化为了使用氨基酸含量降低且dha含量提高的cjm01菌株进一步提高dha的含量和生产率，已经从实施例2选择了菌株，优化了培养基条件。具体地，基于实施例2-2中使用的mjw01培养基，为了增加培养基中氮源的含量并降低生产成本，减少了作为有机氮源的酵母提取物的浓度，添加了作为无机氮源的(nh4)2so4，并增加了nano3的浓度，以将mjw01培养基转化成mjw02培养基(葡萄糖30g/l、mgso4·7h2o5.0g/l、na2so43g/l、nacl0.5g/l、酵母提取物1.0g/l、msg·1h2o1.0g/l、nano38.0g/l、(nh4)2so43.0g/l、kh2po40.1g/l、k2hpo40.5g/l、cacl20.1g/l、以及维生素混合溶液10ml/l)。为了比较mjw01培养基的条件和mjw02培养基的条件，将cjm01菌株分别在以上培养基中培养。结果，如下表5中所示，菌体的量随着酵母提取物浓度的降低而降低，但培养时间随着无机氮源的增加而显著缩短。结果，发现mjw02培养基中dha的含量等于或大于mjw01培养基中dha的含量，并且mjw02培养基中dha的生产率相对于mjw01培养基中dha的生产率增加了1.13倍。[表5]根据培养基条件的二十二碳六烯酸(dha)的含量和生产率如上所述，本领域技术人员将能够理解，在不改变其技术精神或必要特征的情况下，可以以其它详细形式容易地执行本公开。因此，应当理解，前述实施方式在所有方面都是说明性的，而不是限制性的。本公开的范围由下面将要描述的权利要求，而不是由详细说明来代表，并且应当解释为，权利要求的含义和范围以及从其等同物衍生的所有变化或修改形式都在本公开的范围内。<110>cj第一制糖株式会社<120>破囊壶菌属的新型微藻菌株及使用其生产多不饱和脂肪酸的方法<130>opa19013<150>kr10-2018-0075945<151>2018-06-29<160>3<170>kopatentin3.0<210>1<211>1792<212>dna<213>未知<220><223>破囊壶菌种<400>1aacctggttgatcctgccagtagtcatacgcttatctcaaagattaagccatgcatgtct60aagtataaaggcttatactctgaaactgcgaacggctcattatatcagttatagtttctt120tgatagtgttttttctacatggatacttgtggcaaatctagaaacaatacatgcgtacag180gcctgactttgggggagggctgcatttatttgacttaagccaatacccctcggggttgtt240ttggtgattcagaataactgagcgaatcgcatagctttcgggcggcgatgaatcattcaa300gtttctgccccatcagctgtcgatggtagggtataggcctaccatggctgtcacgggtga360cggagaattagggttcgattccggagagggagcctgagagacggctaccacatccaagga420aggcagcaggcgcgtaaattactcaatgttgactcgacgaagtagtgacgagaattaaca480atgcggagcgctacgcgttttgcaattggaatgagagcaatgtaaaagcctcatcgagga540tccattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtata600ctaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaacctctggtagggccgaccttggcgc660gcggtgaatgccgcggtgcttgaaagcgtcgttgcccggccatcctcccccggtcttttg720ggctgggggtcgtttactgtaaaaaaaatagagtgttccaagcagggggtaatgtcccgg780tatatagtagtatggaataatgagataggactttggtactattttgttggtttgcatgcc840aaggtaatgattaagagggacagttgggggtattcgtatttagatgtcagaggtgaaatt900cttggattttcgaaagacgaactactgcgaaagcatttaccaaggatgttttcattaatc960aagaacgaaagttaggggatcgaagatgattagataccatcgtagtcttaaccgtaaact1020atgccgacttgcgattgtccggcgtcgcttttagatgacctgggcagcagcacatgagaa1080atcaaagtctttgggttccggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattga1140cggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaaactt1200accaggtccggacataggaaggattgacagattgagagctctttcttgattctatgggtg1260gtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctggttaattccgttaacgaac1320gagaccacagcctactaaatagtggccgttatggcgacatagcggtgaacttcttagagg1380gacatttcgggtataccggaaggaagtttgtggcaataacaggtctgtgatgcccttaga1440tgttctgggccgcacgcgcgctacactgatcggttcaacgagtatttgttgtttttcccg1500ttttgggagggggcagagtccttggccggaaggtctgggtaatcttttgaatgccgatcg1560tgatggggctagatttttgcaattattaatctccaacgaggaattcctagtagacgcaag1620tcatcagcttgcatcgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgcacctaccg1680attgaacgatccggtgagaccttgggattctgttgtggctgattaattttggctgcgatg1740ggagaacttgagcaaaccttatcgtttagaggaaggtgaagtcgtaacaagg1792<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>18s-001f<400>2aacctggttgatcctgccagta22<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>18s-013r<400>3ccttgttacgacttcaccttcctct25pct/ro/134表当前第1页12