合成肽、前药、药物组合物及用途的制作方法

合成肽、前药、药物组合物及用途
1.交叉引用
2.本申请要求2018年7月5日提交的美国申请号62/694,162的优先权，其内容通过引用结合在此。
技术领域
3.本发明涉及作为平滑肌张力的调节剂的合成肽及其组合物。其还涉及含有此类肽的药物组合物及其在其中平滑肌张力的调节是有益的治疗中的用途。


背景技术：

4.平滑肌组织是各种器官和系统的功能的重要结构组分和调节剂。平滑肌收缩性病症与一系列临床表现，特别是呼吸道、血管、泌尿生殖道和胃肠道的疾病相关。
5.不同机制控制平滑肌的张力，以响应于局部或全身刺激。调节剂由相邻结构产生，例如一氧化氮(no)在局部水平微调张力。互补地，自主神经系统(ans)通过交感神经纤维或副交感神经纤维的作用调节平滑肌的收缩性以响应由中枢神经系统(cns)感知和处理的刺激。然而，神经递质受体根据插入有此类细胞的宏观结构而在平滑肌组织中差异表达。因此，平滑肌张力的药理学控制在呼吸道、血管和泌尿生殖系统的疾病中显著不同。药理学方法在不同系统中甚至可以产生相反的作用(即收缩与松弛)。
6.平滑肌细胞位于除毛细血管和周细胞小静脉之外的所有血管的壁上。只要存在，平滑肌是血管扩张性的主要调节剂，因此是血管直径的主要调节剂。因此，平滑肌的张力的变化决定血管直径，大大地影响了外周阻力，进而影响血流。在病理状况中，血管平滑肌与动脉高血压的发展和进展相关，因此，它们也被降低对血流的阻力的治疗方法所靶向。用于此类目的的药理学类别(pharmacological classes)包括交感神经ans刺激阻断剂(肾上腺素能拮抗剂)、血管紧张素转化剂抑制剂或no供体血管扩张剂。
7.类似地，海绵体
–
直接参与阴茎的膨胀的血管结构
–
也由平滑肌组织的层构成。勃起是取决于构成阴茎的血管、肌肉和神经子结构的完整性的神经血管事件。当被刺激时，与海绵体相邻的神经末端和覆盖那些血管的内皮细胞释放no。随后的信号级联放大导致海绵体平滑肌的松弛，进入这些结构的血流增加，最后勃起。该机制的失败可导致勃起受损，不足以进行性交，表征为勃起功能障碍(ed)。
8.ed的逆转疗法的目的是海绵体平滑肌的松弛并随后增加海绵体内部的血流。在这方面，磷酸二酯酶
‑
5抑制剂(pde5i)包括第一线治疗(first line of treatment)。然而，36％的患者对pde5i明显耐药或不耐受并且必须使用其它药理学选项。通常，替代疗法的有效性有限并且在施用(即尿道内或海绵体内)和副作用方面均不便，因此与高停药率相关。然而，金标准治疗和第二线治疗都通过使海绵体平滑肌松弛来促进增加流入海绵体的血流。因此，对于能够以更方便的方式产生相同效果的药物的医疗需求尚未得到满足。
9.在呼吸道中，平滑肌细胞整合上气道和整个气管支气管树，积极地调节这些结构的管径，进而调节气流。生理状况中的平滑肌张力也由局部调节剂调节和由ans调节。然而，
tools for treatment of erectile dysfunction.in:animal toxin:state of the art.perspectives in health and biotechnology.maria elena de lima,adriano monteiro de castro pimenta,marie france martin
‑
eauclaire,russolina benedeta zingali and herv
é
rochat(编辑),759p.,2009)。此外，提出了在用毒素pntx2
‑
6处理后，一些参与no途径的基因在小鼠的勃起组织中表达增强(villanova f.e.,andrade e.,leal e.,andrade,p.m.,borra,r.c.,troncone,l.r.,l.,leite,k.r.,paranhos,m.,claro,j.,srougi,m.erection induced by tx2
‑
6 toxin of phoneutria nigriventer spider:expression profile of genes in the nitric oxide pathway of penile tissue of mice.toxicon.54(6),793
‑
801,2009.)。专利us 9,279,004说明由毒素pntx2
‑
6构建的肽pntx(19)，其是19个氨基酸的衍生物，分子量为2,485.85da。该公开揭示了所述肽能够增强勃起功能，如通过离体诱导鼠海绵体带的松弛所证明的那样。之后，silva等人(silva,c.n.,nunes,k.p.,torres,f.s.,cassoli,j.s.,santos,d.m.,almeida,fde.m.,matavel,a.,cruz,j.s.,santos
‑
miranda,a.,nunes,a.d.,castro,c.h.,machado der.a.,c.,s.s.,felicori,l.,resende,j.m.,camargos,e.r.,borges,m.h.,cordeiro,m.n.,peigneur,s.,tytgat,j.,de lima,m.e.pnpp19,a synthetic and nontoxic peptide designed from a phoneutria nigriventer toxin,potentiates erectile function via no/cgmp.j ural；194(5):1481
‑
90.2015)证实了由pntx(19)促进的血管舒张由nos的激活和no的产生介导，特别是由神经元和nos的诱导亚型介导。因此，pntx(19)被要求作为ed治疗的潜在候选物，具有用于对基于pde5i的疗法为难治性的患者的潜力。
14.本发明所述的平滑肌张力调节肽比现有技术中报道的那些更有效。作为实例，在科学文献中已经建立的平滑肌收缩性实验模型中相对于pntx(19)评价所述肽。如将进一步显示的，平滑肌调节剂肽显示显著的活性，其中比较物(pntx(19))是完全失活的(气道的平滑肌)或具有明显的差的活性(阴茎海绵体的平滑肌)。此外，pntx(19)显示在气道平滑肌中发挥促炎作用。炎症是许多疾病的病理生理学的重要部分，其中，肺疾病如哮喘和copd，炎症作为引起或扩大所述疾病的恶化的机制。因此，在此类肺疾病中目前禁止使用促炎化合物。本发明所述的肽不具有促炎作用，而是抑制肺系统中的炎症。此外，本文所述的肽的作用由no介导，这是一种增加潜在治疗应用的广度的多效性机制。


技术实现要素：

15.在一些实施方案中，肽包括式(2)的药理学活性肽序列：xaa1
‑
xaa2
‑
xaa3
‑
xaa4
‑
xaa5
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
xaa9
‑
xaa1o
‑
xaa11
‑
xaa12
‑
xaa13
‑
xaa14
‑
xaa15(2)，氨基至羧基方向为从左至右；
16.其中：
17.xaa1、xaa2、和xaa15各自独立地为不存在或为ala、arg、lys或his；
18.xaa3独立地为不存在或为ala、phe、trp或tyr；
19.xaa4、xaa5、和xaa9各自独立地为不存在或为phe、trp或tyr；
20.xaa10独立地为不存在或为his、lys或arg；
21.xaa11为不存在或为ala、gly、val、leu、iie、pro、cys或met；
22.xaa12为不存在或为ala；和
23.xaa13和xaa14各自独立地为不存在或为asn、gin、ser或thr；
24.其中所述式(2)的药理学活性肽序列具有5个以上的连续的氨基酸残基。
25.在一些实施方案中，在式(2)中，不存在由xaa1、xaa2、xaa3、xaa4、xaa5、xaa11、xaa12、xaa13、xaa14、和xaa15组成的组的一个以上的氨基酸残基。
26.在一些实施方案中，所述式(2)的药理学活性肽序列是seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24或seq no id:5。
27.在一些实施方案中，所述式(2)的药理学活性肽序列具有15至18个连续的氨基酸残基。
28.在一些实施方案中，所述式(2)的药理学活性肽序列具有18个连续的氨基酸残基。
29.在一些实施方案中，所述肽包括至少第二肽或蛋白。
30.在一些实施方案中，所述肽包括式(1)的肽
31.–
z
–
x
–
z
’–ꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
32.其中：
33.x是如上所限定的式(2)的药理学活性肽序列；和
34.z和z’各自为独立地包括具有2至15个天然存在的氨基酸的细胞渗透增强氨基酸序列或活性增强氨基酸序列的肽。
35.在一些实施方案中，h、乙酰基、氯化物、或三氟乙酰基共价结合至
–
z
–
x
–
z
’–
的n末端。
36.在一些实施方案中，oh或nh2共价结合至
–
z
–
x
–
z
’–
的c末端。
37.在一些实施方案中，z是包括从n末端至c末端分别含有氨基酸残基gly、glu、和arg的序列的肽，具有seq id no:5的药理学活性肽序列，和z’不存在。
38.在一些实施方案中，上述任何肽连接至选自白蛋白结合部分的半衰期增强部分。在一些实施方案中，所述肽是其中n末端为乙酰基和c末端为nh2的肽。
39.在一些实施方案中，所述肽以多聚体形式包括由基于氨基酸的可切割接头例如通过c末端结构域的酯化间隔的、两个以上的具有式(2)的序列的肽，其中所述多聚体为任选地n末端乙酰化的和c末端酰胺化的。
40.在一些实施方案中，本发明包括含有平滑肌张力调节肽和药学上可接受的载体、赋形剂或添加剂的药物组合物，用于治疗与平滑肌的收缩性的异常调节相关的疾病。例如，在一些实施方案中，药物组合物包括一种以上的如上所限定的肽和药学上可接受的赋形剂。
41.在一些实施方案中，本发明包括平滑肌张力调节肽用于治疗受益于平滑肌收缩性的调节的疾病的用途，所述疾病包括但不限于：勃起功能障碍(ed)，女性性功能障碍(fsd)，良性前列腺增生(bph)，雷诺氏综合征，肺动脉高压(pah)，系统性动脉高压(sah)和与哮喘、copd相关的气道的高反应性，肺纤维化，矽肺，过敏性支气管肺曲霉病，遗传性血管性水肿，和新生儿缺氧呼吸衰竭。
42.例如，一种制备药物组合物的方法，其包括将足以治疗其中平滑肌的张力的调节
是有益的病症的量的上述任何一种至多种肽引入至药学上可接受的赋形剂。
43.在一些实施方案中，所述病症选自由以下组成的组：勃起功能障碍(ed)，女性性功能障碍(fsd)，良性前列腺增生(bph)，雷诺氏综合征，肺动脉高压(pah)，系统性动脉高压(sah)和与哮喘、copd相关的气道的高反应性，肺纤维化，矽肺，过敏性支气管肺曲霉病，遗传性血管性水肿，和新生儿缺氧呼吸衰竭。
44.在一些实施方案中，所述肽具有seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:23、或seq id no:24的氨基酸序列，和进一步地其中所述病症为pah。
45.在一些实施方案中，一种用于治疗有调节平滑肌的张力的需要的患者的病症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的上述任何一种或多种肽。
46.在一些实施方案中，所述病症选自由以下组成的组：勃起功能障碍(ed)，女性性功能障碍(fsd)，良性前列腺增生(bph)，雷诺氏综合征，肺动脉高压(pah)，系统性动脉高压(sah)和与哮喘、copd相关的气道的高反应性，肺纤维化，矽肺，过敏性支气管肺曲霉病，遗传性血管性水肿，和新生儿缺氧呼吸衰竭。
47.在一些实施方案中，所述肽具有seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:23、或seq id no:24的氨基酸序列，和进一步地其中所述病症为pah。
附图说明
48.图1显示pntx(19)(0.01至10 1
‑
jm)对离体下由组胺诱导的气管环痉挛性收缩的作用。该图显示以来自不同动物的8个气管环获得的结果的平均值
±
sem。
49.图2显示pntx(19)(1o
‑8m)对离体下由苯肾上腺素预收缩的海绵体带中通过电刺激诱导的松弛的增强作用。该图显示以来自不同动物的6个海绵体带获得的结果的平均值
±
sem。
50.图3显示平滑肌张力调节肽对由苯肾上腺素(pe)收缩的海绵体带中通过电刺激诱导的松弛的离体增强作用。在所讨论的模型中的示例性模式中评价肽seq id no:5(a)、seq id no:19(b)、和seq id no:24(c)。该图显示以来自不同动物的6个海绵体带获得的结果的平均值
±
sem。
51.图4显示比较物pntx(19)(1o
‑8m)和平滑肌张力调节肽对由苯肾上腺素(pe)预收缩的海绵体带中通过电刺激(8hz)诱导的松弛的离体作用。该图显示以提取自不同动物的6个海绵体带获得的结果的平均值
±
sem。组间差异通过用单向方差分析(one
‑
way anova)然后通过bonferroni事后检验进行分析。*表示p<0.05，与对照相比；**表示p<0.01，与对照相比。
52.图5显示日常处理后14天seq id no:19(0.06mg/kg)在肺动脉高压(pah)的野百合碱诱导模型中的肺动脉压继而右心室(rv)压的恢复体内作用。该图显示与无疾病组(对照)和用载体处理的野百合碱诱导组(mct)相比，seq id no:19对以下的作用：(a)由超声心动图测定的与肺动脉压等级成反比的pat/pet比(肺动脉加速时间(pat)/肺动脉射血时间(ejection time)(pet)比)；(b)由侵入式rv导管插入法测定的rv的收缩压(rvsp)；(c)由rv导管插入法测定的与rv的压力相关的dp/dt比(压力的导数/最大时间的导数)。该图显示以
7个不同的动物获得的结果的平均值
±
sem。组间差异通过双向方差分析(two
‑
way anova)然后通过bonferroni事后检验进行分析。*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001；全部与对照相比。
53.图6显示日常处理后14天seq id no:19(0.06mg/kg)在pah的野百合碱诱导模型中的心脏重塑中的体内作用。该图显示与无疾病组(对照)和用载体处理的野百合碱诱导组(mct)相比，seq id no:19对区域(a)rv出口区域和(b)lv区域的作用。该图显示以7个不同的动物获得的结果的平均值
±
sem。组间差异通过用双向anova然后通过bonferroni事后检验进行分析。*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001；全部与对照相比。
54.图7显示日常处理后28天seq id no:19(0.06mg/kg)在pah的野百合碱诱导模型中的体内抗炎作用。该图显示与无疾病组(对照)和无处理的野百合碱诱导组(mct)相比，seq id no:19对以下促炎细胞因子释放的心脏匀浆减少的作用：(a)显示对预防纵隔淋巴结肿大的作用，(b)干扰素(ifn)
‑
y，(c)白介素(il)
‑
113，以蛋白的pg/mg表示，由elisa测定和对图(d)肿瘤坏死因子(tnf)
‑
a的作用。该图显示以7个不同动物获得的结果的平均值
±
sem。组间差异通过单向anova然后通过bonferroni多重比较检验进行分析。*和#表示p<0.05，分别与对照和mct组比较；***表示p<0.001，和##表示p<0.01。
55.图8显示在小鼠模型(n＝5)中攻击后6h气管内滴注肽(10nmol和30nmol)后，pntx(19)、seq id no:19、和seq id no:24对支气管肺泡空间中的中性粒细胞迁移的作用。数值表示来自至少五个动物的平均值
±
sem，+++表示与pbs刺激的pbs处理的小鼠相比，p<0.001。
具体实施方式
[0056]1‑
定义
[0057]
除非另有说明，否则本文所用的所有术语和表达对于本发明领域的技术人员来说具有相同的含义。对于本领域的定义和术语，本领域技术人员特别关注文献(ausubel,f.m.,brent,r.,kingston,r.e.,moore,d.d.,seidman,g.,smith,j.a.,struhl,k.current protocols in molecular biology.john wiley and sons,inc.,media pa.2015)。
[0058]
氨基酸残基的缩写是本领域中用于参考常见的20种l氨基酸之一的3个字母和/或1个字母的标准代码。
[0059]“保守氨基酸取代”是不会导致给定多肽或蛋白的平滑肌松弛活性(例如，平滑肌的松弛的促进活性)或三级结构的显著改变的取代。此类取代通常涉及通过具有相似理化性质的不同残基选择的氨基酸残基的取代。例如，用天冬氨酸(asp)取代谷氨酸(giu)被认为构成保守取代，因为他们都是相似大小的带负电的氨基酸。按理化性质对氨基酸分组是本领域技术人员已知的。
[0060]“肽”和“多肽”在本文以可互换的形式使用，并且指由通过肽键连接的氨基酸残基链构成的化合物。除非另有说明，否则肽的序列以氨基末端至羧基末端的顺序给出。
[0061]
序列的“同一性”通过在比对时比较多肽的氨基酸的序列以最大化叠加、最小化序列的空位，然后计算序列之间的相同残基而确定的。氨基酸或核酸的两条序列的同一性百分比可以通过目视检查和/或数学计算来确定，通常使用计算机程序进行序列信息的较长序列的比较。可以被本领域技术人员使用来比较肽和核酸的序列的程序的实例是blast
(blastp)和blastn，可在美国国家医学图书馆的网站[ncbi.nlm.nih.gov/blast]上免费获得。在优选的形式中，当从目视检查或合适的计算机程序确定时，如果序列的氨基酸序列为至少50％同一、更优选如果序列为70％或75％同一、仍更优选如果序列为80％或85％同一、仍更优选如果序列为90或95％同一，则序列被认为彼此是同源的或同一的。
[0062]
如果氨基酸的序列与原始肽或多肽的氨基酸的序列为同一或同源的，则肽或肽片段“源自”原始肽或肽片段。
[0063]
11
‑
平滑肌松弛肽和组合物
[0064]
在一些实施方案中，本发明涉及能够促进平滑肌、特别是存在于气道中和血管中的平滑肌的松弛的合成肽。现有技术中提供具有类似活性的其它肽，但是没有公开或预期本文提供的化合物的可用的报告。所讨论的肽在结构上是独特的，并且在对其它肽不是非常敏感或绝对不敏感的系统中具有生物学作用，因此可以认为与其相关。
[0065]
在一些实施方案中，一种肽，其包括式(2)的药理学活性肽序列：xaa1
‑
xaa2
‑
xaa3
‑
xaa4
‑
xaa5
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
xaa9
‑
xaa1o
‑
xaa11
‑
xaa12
‑
xaa13
‑
xaa14
‑
xaa15(2)，氨基至羧基方向为从左至右；
[0066]
其中：
[0067]
xaa1、xaa2、和xaa15各自独立地为不存在或为ala、arg、lys或his；
[0068]
xaa3独立地为不存在或为ala、phe、trp或tyr；
[0069]
xaa4、xaa5、和xaa9各自独立地为不存在或为phe、trp或tyr；
[0070]
xaa10独立地为不存在或为his、lys或arg；
[0071]
xaa11为不存在或为ala、gly、val、leu、iie、pro、cys或met；
[0072]
xaa12为不存在或为ala；和
[0073]
xaa13和xaa14各自独立地为不存在或为asn、gin、ser或thr；
[0074]
其中式(2)的药理学活性肽序列具有5个以上的连续的氨基酸残基。
[0075]
在一些实施方案中，在式(2)中，不存在由xaa1、xaa2、xaa3、xaa4、xaa5、xaa11、xaa12、xaa13、xaa14、和xaa15组成的组的一个以上的氨基酸残基。
[0076]
在一些实施方案中，式(2)的药理学活性肽序列是seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24或seq no id:5。
[0077]
在一些实施方案中，式(2)的药理学活性肽序列具有15至18个连续的氨基酸残基。
[0078]
在一些实施方案中，式(2)的药理学活性肽序列具有18个连续的氨基酸残基。
[0079]
在一些实施方案中，所述肽包括至少第二肽或蛋白。
[0080]
在一些实施方案中，本发明涉及包括具有式(1)的药理学活性肽序列的组合物：
[0081]
–
z
–
x
–
z
’–ꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0082]
其中：
[0083]
z和z’各自为独立地包括具有2至15个天然存在的氨基酸的细胞渗透增强氨基酸序列或活性增强氨基酸序列的肽，其中h、乙酰基、氯化物、或三氟乙酰基共价结合至
–
z
–
x
–
z
’–
的n末端，并且x是具有式(2)的药理学活性肽序列的肽x：
[0084]
xaa1
‑
xaa2
‑
xaa3
‑
xaa4
‑
xaa5
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
xaa9
‑
xaa1o
‑
xaa11
‑
xaa12
‑
xaa13
‑
xaa14
‑
xaa15(2)，氨基至羧基方向为从左至右；
[0085]
其中：
[0086]
xaa1、xaa2、和xaa15各自独立地为不存在或为ala，或为具有碱性侧链的氨基酸(arg、lys或his)；
[0087]
xaa3独立地为不存在、或为ala或为具有芳香族侧链的氨基酸(phe、trp或tyr)
[0088]
xaa4、xaa5、和xaa9各自独立地为不存在或为具有芳香族侧链的氨基酸(phe、trp或tyr)；
[0089]
xaa10独立地为不存在或为具有碱性侧链的氨基酸(his、lys或arg)；
[0090]
xaa11为不存在或为非极性氨基酸(ala、gly、val、leu、iie、pro、cys或met)；
[0091]
xaa12为不存在或为ala；
[0092]
xaa13和xaa14各自独立地为不存在、或为具有不带电侧链的氨基酸(asn、gin、ser或thr)；
[0093]
其中x具有5个以上的氨基酸连续残基。
[0094]
在一些实施方案中，x具有以下序列：
[0095]
ac
‑
arg
‑
aia
‑
tyr
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
leu
‑
aia
‑
asn
‑
ser
‑
lys
‑
nh2(seq id no:1)。
[0096]
在一些实施方案中，肽包括式(1)的肽
[0097]
–
z
–
x
–
z
’–ꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0098]
其中：
[0099]
x为如上所限定的式(2)的药理学活性肽序列；和
[0100]
z和z’各自为独立地包括具有2至15个天然存在的氨基酸的细胞渗透增强氨基酸序列或活性增强氨基酸序列的肽。
[0101]
在一些实施方案中，h、乙酰基、氯化物、或三氟乙酰基共价结合至
–
z
–
x
–
z
’–
的n末端。
[0102]
在一些实施方案中，oh或nh2共价结合至
–
z
–
x
–
z
’–
的c末端。
[0103]
在一些实施方案中，z是包括从n末端至c末端分别包含氨基酸残基gly、glu、和arg的序列的肽，具有seq id no:5的药理学活性肽序列，和z’不存在。
[0104]
在一些实施方案中，上述任何肽连接至选自白蛋白结合部分的半衰期增强部分。在一些实施方案中，所述肽是一种其中n末端为乙酰基且c末端为nh2的肽。
[0105]
在一些实施方案中，所述肽以多聚体形式包括由基于氨基酸的可切割接头例如通过c末端结构域的酯化间隔的、两个以上的具有式(2)的序列的肽，其中所述多聚体任选地为n末端乙酰化的和c末端酰胺化的。
[0106]
在一些实施方案中，本发明包括含有平滑肌张力调节肽和药学上可接受的载体、赋形剂或添加剂的药物组合物，用于治疗与平滑肌的收缩性的异常调节相关的疾病。例如，在一些实施方案中，药物组合物包括一种以上的如上所限定的肽和药学上可接受的赋形剂。
[0107]
iii
‑
肽合成
[0108]
可以通过本领域技术人员已知的任何方法来制备本发明的肽，所述方法包括重组和非重组方法。合成途径(非重组)包括但不限于肽的固相化学合成、肽的液相化学合成、和生物催化合成。在优选实施方案中，通过使用手动、自动或半自动系统在液相或固相中化学
合成来获得肽。
[0109]
例如，固相肽合成(spps)自从由merrifield(merrifield,r.b.solid phase peptide synthesis.i.the synthesis of a tetrapeptide j.am.chem.soc.,85:2149
‑
2154.1963)描述以来是已知的并广泛应用。spps的变化范围对本领域技术人员来说是可获得的(参见gutte,b.peptide synthesis,structures,and applications.academic press,san diego,ca,第3章,1995；和white,p.d.,和chan,w.c.fmoc solid phase peptide synthesis:a practical approach.oxford university press,oxford,2004；machado,a.,liria,c.w.,proti,p.b.,remuzgo,c.,miranda,t.m.s
í
nteses qu
í
mica e enzim
á
tica de pept
í
deos:princ
í
pios b
á
sicos equim.nova,5:781
‑
789 2004)。简而言之，通过spps的肽的构建发生在有意义的cn末端。为此目的，将目标的c末端氨基酸偶联至固体支撑物。其后，待连接的氨基酸的n末端部分被boc基团、fmoc基团或其它合适的保护自由基保护，而c末端部分则由标准偶联剂激活。随后，与支撑物结合的氨基酸的游离末端胺与随后的氨基酸的末端羧基部分反应。然后将二肽的末端胺脱保护，并重复该过程直至完成多肽。只要足够，起始氨基酸在侧链上也可以具有保护。
[0110]
可选地，本发明的肽可以通过重组方法获得。在不限制可能的方法学变化的情况下，示例性方案包括：构建编码目标肽的核酸；在表达载体中克隆所述核酸；用所述载体转化宿主细胞(细胞，植物细胞、例如大肠杆菌等细菌、例如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)等酵母、或例如中国仓鼠卵巢细胞等哺乳动物细胞)；表达核酸以产生目标肽。用于在体外以及在原核和真核宿主细胞中产生和表达重组多肽的方法是本领域技术人员已知的(参见u.s.4,868,122,和sambrook,j.,fritsch,e.f.,maniatis,t.molecular cloning:a laboratory manual.第2版.cold spring harbor laboratory press,1989).
[0111]
iil.a
–
相关肽
[0112]
本领域技术人员认识到可以对例如本发明所述的那些肽等肽进行特定的修饰，导致所述肽的性质的小的改变或无改变。因此，与本文说明的肽有关的肽包括保留了原始肽的一些或全部治疗活性的类似物和/或衍生物。在此背景下，术语“类似物”表示通过本文所述的肽的取代、缺失或添加氨基酸来获得的变体；而“衍生物”表示在本文所述的肽和/或其类似物的一级序列上含有化学修饰的变体。在某些方面，此类变体可证明肽的至少一种治疗活性得到改善。另外，本发明的肽可以包含l
‑
amina acid、d
‑
氨基酸或二者的任何比例的组合。
[0113]
另一个实施方案包括在向有此需要的患者施用之前、之后或施用期间化学或酶促转化成任何活性肽的前药或药物前体。此类化合物可以包括氨基酸的酯、n
‑
烷基、磷酸酯或缀合物(arnab,de,application of peptide
‑
based prodrug chemistry in drug development；springer,new york heidelberg dordrecht london,2013)，更亲脂性的肽(caccetta,r.,blanchfield,j.t.,harrison,j.,toth,i.,benson,h.a.e.epidermal penetration of a therapeutic peptide by lipid conjugation；stereo
‑
selective peptide availability of a topical diastereomeric lipopeptide.international journal of peptide research and therapeutics,12(3),327
–
333.2006)，并且在某些情况下，通过添加极性接头，例如通过c末端结构域的酯化，可以使此类化合物具有更大的亲水性。
[0114]
本发明还包括能够转换成任何线性活性肽的任何环状肽。其还包括由生物缀合物或大分子的化学修饰，例如e.糖基化或聚乙二醇化(huttunen,k.m.,raunio,h.,rautio,j.prodrugs—from serendipity to rational design.pharmacol rev.63:750
–
771,2011)。
[0115]
本发明进一步包括一种使用任何活性肽作为支撑物来基于氨基酸基团的生物酯来投射活性结构的拟肽方法(vagner,j.,qu,h.和hruby,v.j.peptidomimetics,a synthetic tool of drug discovery；curr opin chem biol.12(3):292
–
296.2008.)。
[0116]
本发明包括含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个与本文所述的肽相关的保守或非保守氨基酸取代的类似物。保守或非保守的期望的氨基酸取代可以由本领域技术人员使用常规方法确定。在本发明的某些方面，平滑肌张力调节肽包括含有产生具有与原始肽的功能特性和化学特性相似的功能特性和化学特性的变体的保守取代的类似物。在另一方面，类似物含有可产生特性显著不同于原始肽所证明的特性的非保守取代。
[0117]
天然氨基酸可以按照如下的侧链性质进行分类：非极性(非极性：(甘氨酸(giy)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(iie)、甲硫氨酸(met))；不带电极性：(半胱氨酸(cys)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、脯氨酸(pro)、天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gin))；酸性(天冬氨酸(asp)、谷氨酸(giu)；碱性(组氨酸(his)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg))；和芳香族(色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)、苯丙氨酸(phe))。作为实例，非保守取代可涉及一类氨基酸与来自不同组的另一氨基酸的交换；它们可以进一步被引入至对治疗活性不是关键的肽的区域。然而，取代优选保守的。即,它们涉及氨基酸与相同类的另一种氨基酸的交换。这种类型的修饰也包含通过人工和/或非必需氨基酸残基的取代，这些氨基酸包括可以在肽的合成期间有规律地使用的氨基酸的肽模拟物和其它非典型形式。
[0118]
限定氨基酸的取代的策略可以通过侧链的亲水性指数来指导。本领域技术人员理解亲水氨基酸对多肽的功能的重要性(kyte,j.和doolittle.r.f.a simple method for displaying the hydropathic character of a protein.j.mol.biol.157:105
‑
31.1982)。每个氨基酸都有一个根据亲水性和电荷特性确定的亲水指数。这些是iie(+4.5)；val(+4.2)；leu(+3.8)；phe(+2.8)；cys(+2.5)；met(+1.9)；ala(+1.8)；gly(
‑
0.4)；thr(
‑
0.7)；ser(
‑
0.8)；trp(
‑
0.9)；tyr(
‑
1.3)；pro(
‑
1.6)；his(
‑
3.2)；glu(
‑
3.5)；gin(
‑
3.5)；asp(
‑
3.5)；asn(
‑
3.5)；lys(
‑
3.9)；和arg(
‑
4.5)。本领域技术人员理解具有相似亲水指数的氨基酸可以互换而不会显著丧失生物学活性。
[0119]
已知保守取代也可以基于亲水性。由相邻氨基酸的亲水性确定的多肽的平均亲水性与化合物的生物学特性相关。根据专利us 4,554,101，天然氨基酸具有以下亲水性值：arg(+3.0)；lys(+3.0)；asp(+3.0
±
1)；glu(+3.0
±
1)；ser(+0.3)；asp(+0.2)；gin(+0.2)；gly(0)；thr(
‑
0.4)；pro(
‑
0.5
±
1)；ala(
‑
0.5)；his(
‑
0.5)；cys(
‑
1.0)；met(
‑
1.3)；val(
‑
1.5)；leu(
‑
1.8)；iie(
‑
1.8)；tyr(
‑
2.3)；phe(
‑
2.5)；和trp(
‑
3.4)。
[0120]
本发明所指的保守取代包括但不限于：
[0121]
ac
‑
arg
‑
gin
‑
tyr
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
leu
‑
aia
‑
asn
‑
ser
‑
aia
‑
nh2(seq id no:2)
[0122]
ac
‑
arg
‑
gin
‑
aia
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
leu
‑
aia
‑
asn
‑
ser
‑
lys
‑
nh2(seq id no:3)
[0123]
ac
‑
aia
‑
gin
‑
tyr
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
leu
‑
aia
‑
asn
‑
ser
‑
lys
‑
nh2(seq id no:4)
[0124]
ac
‑
arg
‑
gin
‑
tyr
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
leu
‑
aia
‑
asn
‑
ser
‑
lys
‑
nh2(seq id no:5)
[0125]
ac
‑
arg
‑
gin
‑
tyr
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
ile
‑
aia
‑
ser
‑
asn
‑
lys
‑
nh2(seq id no:6)
[0126]
在本发明的某些方面，与最初描述的肽相比，肽的类似物包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸缺失。缺失的氨基酸(一个或多个)可以发现在肽的n末端或c末端区域中、两个侧翼上、或序列内部或者还在一个或两个侧翼上以及序列内部。当类似物具有多于一个缺失时，去除的氨基酸可以是连续的或可以位于不同的区域。
[0127]
本发明所预期的缺失包括但不限于：
[0128]
ac
‑
gin
‑
tyr
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
leu
‑
aia
‑
asn
‑
ser
‑
nh2(seq id no:17)
[0129]
ac
‑
tyr
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
leu
‑
aia
‑
asn
‑
nh2(seq id no:18)
[0130]
ac
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
leu
‑
aia
‑
nh2(seq id no:19)
[0131]
ac
‑
arg
‑
gin
‑
tyr
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
nh2(seq id no:20)
[0132]
ac
‑
arg
‑
gin
‑
tyr
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
nh2(seq id no:22)
[0133]
ac
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
leu
‑
nh2(seq id no:23)
[0134]
ac
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
nh2(seq id no:24)
[0135]
本发明的另一方面包括与本文最初描述的肽相比，具有1、2、3、4或5个氨基酸添加的类似物。所讨论的插入可以发生在肽的n末端或c末端区域中、两个侧翼上、或序列内部，或者还在一个或两个侧翼上以及序列内部。当类似物具有多于一个添加时，氨基酸可连续地或在分子的不同区域插入。
[0136]
本发明还包括两种以上的活性肽的任何组合，所述活性肽通过连接基团连接并转化为唯一的活性肽，或作为整个分子显示药物活性(huttunen,k.and rautio,j.prodrugs
–
an efficient way to breach delivery and targeting barriers.current topics in medicinal chemistry.11,2265
‑
2287.2011)。氨基酸的插入也包括氨基酸、融合肽和渗透增强序列的接头，其可以添加至本文所述的肽的n
‑
末端或c
‑
末端区域。能够增强细胞渗透和/或经皮吸收的肽序列对于本领域技术人员来说是已知的并且可以见于例如kumar eta/(kumar,s.,narishetty,s.t.,tummala,h.peptides as skin penetration enhancers for low molecular weight drugs and macromolecules.in:dragicevic n.,maibach h.(eds)percutaneous penetration enhancers chemical methods in penetration enhancement.springer,berlin,heidelberg.2015)和专利us 14,911,019和w02012064429中。
[0137]
在某些方面，氨基酸、融合肽和渗透增强序列的上述接头可以具有2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个另外的氨基酸，并且可以通过如seq id no:28、seq id no:29、和seq id no:30中示例的连接部分连接至平滑肌张力调节肽。这样的部分可以是任选地用于将治疗肽连接至其它治疗肽的原子或原子的集合。可选地，连接子分子可以由设计用于蛋白水解裂解的氨基酸序列组成，以允许在合适的环境中释放生物活性部分。此外，本文所述的平滑肌张
力调节肽可与设计用于改善药理学性质(药代动力学和/或药效学)和或理化性质的肽融合。
[0138]
本发明预期的添加包括但不限于：
[0139]
ac
‑
gly
‑
glu
‑
arg
‑
arg
‑
gln
‑
tyr
‑
phe
‑
trp
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
leu
‑
aia
‑
asn
‑
ser
‑
lys
‑
nh2(seq id no:27)
[0140]
ac
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
nh2(seq id no:28)
[0141]
ac
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
arg
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
arg
‑
lys
‑
tyr
‑
trp
‑
aia
‑
ile
‑
nh2(seq id no:29)
[0142]
ac
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
giy
‑
ile
‑
aia
‑
trp
‑
tyr
‑
lys
‑
nh2(seq id no:30)
[0143]
在一些方面，本发明包括含有在肽链的一个以上的位置上具有一个以上的甲基或其它小的烷基的化学修饰的衍生物。此类组的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基等。可选地，衍生物由将一个以上的糖苷部分连接至肽序列而产生。例如，所引用的衍生物可以通过将一个以上的单糖、二糖或三糖连接至肽序列而获得。例如，所述衍生物可以通过在肽的任何位置连接一个以上的单糖、二糖或三糖而获得。糖基化可以针对肽的天然氨基酸，或者可选地，可以取代或添加一个氨基酸以接受修饰。
[0144]
所述糖基化的肽可以通过常规spps技术获得，其中在肽的合成之前制备目标糖基
‑
氨基酸，然后在所需位置添加至序列。因此，平滑肌张力调节肽可以在体外糖基化。在这种情况下，糖基化可以在先发生。文献us 5,767,254、wo 2005/097158、和doores eta/(doores,k.,gamblin,d.p.and davis,b.g.exploring and exploiting the therapeutic potential of glycoconjugates.chem.commun.,1401
‑
1403,2006)(为了参考目的结合在此)描述氨基酸的糖基化。作为实例，丝氨酸和苏氨酸的残基的α或β选择性糖基化可以使用koenigs
‑
knorr反应和使用介导性席夫碱的lemieux原位异构化方法实现。然后在弱酸性条件下或通过氢解作用进行糖基化席夫碱的脱保护。
[0145]
可以引入本文所述的肽的一个以上的氨基酸残基的单糖是葡萄糖(右旋糖)、果糖、半乳糖、和核糖。可能适合使用的其它单糖是甘油醛、二羟基丙酮、赤藓糖、苏糖、赤藓酮糖、阿拉伯糖、来苏糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、n
‑
乙酰神经氨酸、岩藻糖、n
‑
乙酰半乳糖胺、n
‑
乙酰葡萄糖胺等。用于修饰平滑肌张力调节肽的例如单糖、二糖和三糖等糖苷可以是合成的或天然原始的。可以引入本文所述氨基酸的一个以上的残基的二糖包括蔗糖、乳糖、海藻糖、alose、蜜二糖、纤维二糖等。三糖可以是阿卡波糖、棉子糖、和松三糖。
[0146]
在本发明的其它方面，平滑肌调节肽可以与生物素偶联。然后可以将此类肽
‑
生物素复合物偶联至抗生物素蛋白。
[0147]
如前所述，本文所述的肽可以经修饰以仅显示所述肽的生物学活性和特性的部分降低或不降低。在某些情况下，可以实现这样的修饰以引起预期的治疗活性的改善。因此，本发明的范围包括相对于未修饰的肽保留至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，以及由此衍生的任何范围，例
如至少70％至至少80％、和优选至少81％直到90％、或仍更优选在91％至99％之间的治疗活性的变体。本发明的范围也包括与未修饰的肽相比具有高于100％、110％、125％、150％、200％或大于300％的治疗活性，或仍证明100或100倍更高的活性，以及由此衍生的任何范围的变体。
[0148]
本发明中描述的平滑肌张力调节肌也可以直接或通过间隔基团共价缀合至水溶性聚合物。本发明范围中的插入的肽
‑
聚合物缀合物的实例包括：含有以可分离或稳定的方式偶联至肽，特别是偶联至n
‑
末端部分的水溶性聚合物的缀合物；含有以可分离或稳定的方式偶联至肽，特别是偶联至c
‑
末端部分的水溶性聚合物的缀合物；含有以可分离或稳定的方式偶联至肽，特别是偶联至位于肽链内部的氨基酸的水溶性聚合物的缀合物；含有多于一个的以可分离或稳定方式偶联至肽的水溶性聚合物的缀合物，所述水溶性聚合物偶联至不同区域，例如偶联至肽序列的n末端部分和偶联至位于肽序列的内部的氨基酸(特别是赖氨酸)的侧链。可选地，将与水溶性的偶联的氨基酸可以插入肽的n末端或c末端部分、或插入肽的一级结构中。
[0149]
通常，上述预期的聚合物是亲水的、非肽的、生物相容的和非免疫原性的。在这方面，如果有益作用与物质单独或物质与另一物质(例如，生物学活性成分，例如治疗肽)联合施用于活生物体相关，克服了临床上可观察到的任何有害作用，则该物质被视为具有生物相容性。如果物质在体内的预期用途不会产生不良的免疫应答(例如，抗体的形成)或如果触发了免疫应答，此类事件在临床上也不显著或不重要，则该物质被视为非免疫原性。此类水溶性聚合物的实例包括但不限于：聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚烯烃醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、硫酸化或非硫酸化多糖、聚噁唑啉、聚(n
‑
丙烯酰吗啉)、以及这些聚合物(包括其共聚物和三元聚合物)的组合。
[0150]
以上引用的水溶性聚合物不限于特定的结构，并且可以具有线性或非线性结构，例如支链、分叉、多枝状(例如，偶联至多元醇核的peg)，或树突状(具有多个末端基团的密集分支结构)。在现有技术中描述了将聚合物与肽缀合的方法以及合适的试剂，所述试剂可以选自烷基化剂或乙酰化剂(参见harris,j.m.和zalipsky,s.,poly(ethylene glycol),chemistry and biological applications.acs,washington,1997；veronese,f.,和harris,j.m.peptide and protein pegylation.advanced drug delivery reviews,54(4)；453
‑
609.2002；zalipsky,s.,lee,c.use of functionalized poly(ethylene glycols)for modification of polypeptides.in polyethylene glycol chemistry:biotechnical and biomedical applications,j.m.harris,编辑,plenus press,new york,1992；zalipsky,s.functionalized poly(ethylene glycol)for preparation of biologically relevant conjugates.advanced drug reviews,16:157
‑
182,1995；和在roberts,m.j.,bentley,m.d.,harris,j.m.,chemistry for peptide and protein pegylation.adv.drug delivery reviews,54,459
‑
476,2002中)。通常，水溶性聚合物的平均分子量可在100道尔顿(da)和150,000da(150kda)之间。例如，可以使用平均分子量为250da至80kda、500da至65kda、750da至40kda、或1kda至30kda的水溶性聚合物。在本发明的另一方面，平滑肌张力调节肽可以在肽链的一个以上的位置乙酰化以改善理化、药代动力学和/或药效学特性。例如，广泛采用亲脂酰基的引入以增加治疗肽的血浆半衰期，因为它
们使偶联于其上的基团不易被氧化。用于肽乙酰化的方法和试剂对本领域技术人员来说是已知的。文献wo 98/08871、us2003/0082671、wo 2015/162195(作为参考结合在此)例示了用于肽的乙酰化的试剂和条件。用酰基修饰游离胺对促进肽和蛋白质的乙酰化特别有用(abello,n.,kerstjens,h.a.,postma,d.s.,bischoff,r.selective acylation of primary amines in peptides and proteins.journal of proteome research,6(12):4770
‑
4776.2007)。在这种特定情况下，平滑肌张力调节肽可以在n
‑
末端胺处或最初存在于序列中或为了接收所讨论的乙酰化目的而插入的一个以上的氨基酸的侧链中被乙酰化。
[0151]
iv
‑
药物形式
[0152]
在本发明的一方面，提供包含本发明的一种以上的肽的药物形式。在特定方式中，将本发明的肽与药学上可接受的载体和/或赋形剂和/或添加剂组合。
[0153]
可以根据例如在英国、欧洲和美国药典(英国药典.第1卷.london:medicines and healthcare products regulatory agency；2018；欧洲药典.第9版,strassbourg:council of europe:2018；美国药典,42,national formulary 37,2018)、雷明顿药物科学(remington’s pharmaceutical sciences)(remington,j.p.,和gennaro,a.r.remington’s pharmaceutical sciences.mack publishing co.,第18版.1990)、马丁代尔大药典(martindale:the extra pharmacopoeia)(martindale,w.和reynolds,j.e.f.martindale:the extra pharmacopoeia.london,the pharmaceutical press第31版,1996)和哈里化妆品学(harry’s cosmeticology)(harry,r.和rosen,m.r.harry’s cosmeticology.leonard hill books,第9版.2015)、制药工艺(pharmaceutical technology)(prista,l.v.n.,alves,a.c.,morgado,r.m.r.t
é
cnica farmac
ê
utica e farm
á
cia gal
ê
nica.第4版.calouste gulbenkian.dee bolsas,1996)中公开的常规方法制备和配制本发明的药物形式。
[0154]
药物形式可包括，例如，一份或多份水、缓冲液(例如，碳酸氢钠、用磷酸盐缓冲的盐水溶液的缓冲中性盐水溶液)、乙醇、矿物油、植物油、二甲基亚砜、碳水化合物(例如，乳糖、山梨糖醇、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、酰胺、甘油、甘露醇或右旋糖酐)、蛋白质、佐剂(例如像聚合物和环糊精的稳定剂)、多肽或氨基酸(例如his、gly、lys、asp、glu和arg)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、α
‑
生育酚、亚硫酸盐、bha(丁基羟基茴香醚)、bht(丁基羟基甲苯)、表面活性剂(例如非离子型洗涤剂
–
triton x
‑
100、聚山梨酯20、聚山梨酯80、pluronic f68、pluronic f88、pluronic f127、brij 35)、螯合剂(例如edta和/或谷胱甘肽)和/或防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯、山梨酸、咪唑脲、氨季铵化合物乙内酰脲、酚衍生物、酸性衍生物卤代化合物)。
[0155]
可以将药物形式配制成用于任何施用途径，包括例如局部、口鼻、直肠或肠胃外施用。如本文所用，术语肠胃外包括皮下注射、皮内注射、血管内注射(例如，静脉内)、肌肉内注射、脊柱注射、颅内注射、鞘内注射、和腹膜内注射，以及任何类似的注射或输注技术。在某些形式中，优选用于口服的组合物。这样的组合物包括例如丸剂、片剂、溶液、水性或油性悬浮液、可分散的粉剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂或糖浆剂或酏剂。在其它形式中，药物组合物可以用冻干粉末配制。
[0156]
旨在用于口服的药物形式可以进一步包含其它组分，例如甜味剂、调味剂、着色剂和/或防腐剂，以提供有吸引力且可口的制剂。
[0157]
丸剂具有与适用于制造丸剂的生理相容性赋形剂混合在一起的活性成分。此类赋形剂包括，例如惰性稀释剂(例如，碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)、造粒剂和崩解剂(例如，玉米淀粉或海藻酸)、粘合剂(例如，淀粉、明胶或阿拉伯胶)、和润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉)。可以使用标准技术来形成丸剂，包括干法造粒、直接压片、和湿法造粒。丸剂可以没有包衣，或者可以使用已知技术进行包衣。
[0158]
用于口服的制剂也可以以硬明胶胶囊的形式呈现，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙、高岭土、滑石粉、一水乳糖、胶体二氧化硅、微晶纤维素、十二烷基硫酸钠、乙醇酸酰胺钠)混合或以软明胶胶囊的形式呈现，其中活性成分与水或油性介质(例如，花生油、液体凡士林或橄榄)混合。
[0159]
水性悬浮液包含与合适的赋形剂混合的活性物质(一种或多种)，例如悬浮剂(例如，纤维素羧甲基钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶)；和分散剂或湿润剂(例如，天然存在的磷脂，例如卵磷脂，环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如庚烷
‑
乙烯氧基
‑
鲸蜡醇，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和一种己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯(sorbitol polyoxyethylene mono
‑
oleate)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨醇单油酸酯(mono
‑
oleate of polyethylene sorbitan)。水性悬浮液还可以包含一种以上的防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙基、一种以上的着色剂、一种以上的调味剂和/或一种以上的甜味剂，例如蔗糖或糖精。
[0160]
油性悬浮液可以通过将活性成分(一种或多种)悬浮在植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或例如液体石蜡等矿物油中来配制。油性悬浮液可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂，例如以上所述的甜味剂和/或调味剂，以提供可口的口服制剂。这样的悬浮液可以通过添加例如抗坏血酸等抗氧化剂来保存。
[0161]
足以通过添加水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒在与分散剂或湿润剂、分散剂和一种以上的防腐剂的混合物中提供活性成分。合适的分散剂或湿润剂由上面已经提到的那些作为示例。也可以存在其它赋形剂，例如甜味剂、调味剂、和着色剂。
[0162]
药物形式也可以配制成油包水乳剂。油相可以是植物油(例如，椰子油、杏仁油、葡萄籽油、橄榄油或花生油)、矿物油(例如，液体凡士林)、或其混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶(例如，阿拉伯胶或黄蓍胶)、天然存在的磷脂(例如、磷脂酰丝氨酸)、酸酐(例如，失水山梨醇的单油酸酯)和衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇的单油酸酯)。乳剂还可以包含一种以上的甜味剂和/或调味剂。
[0163]
糖浆剂和酏剂可以用例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖等甜味剂配制。这样的制剂还可包含一种以上的防腐剂、调味剂和/或着色剂。
[0164]
用于局部施用的制剂通常包含具有或不具有其它任选组分的与活性剂(一种或多种)组合的局部用载体。合适的附加组分和局部用载体在本领域中是众所周知的，并且显而易见的是，载体的选择将尤其取决于物理形式和施用方式。局部用载体包括水；有机溶剂，例如醇(例如，乙醇或异丙醇)或甘油；二醇(例如，丁烯、异戊二烯或丙二醇)；脂肪醇(例如，羊毛脂)；水和有机溶剂的混合物以及例如甘油醇等有机溶剂的混合物；基于脂质的材料，例如脂肪酸、酰基甘油(包括油，例如矿物油、动物或合成脂肪)、磷酸甘油酯、鞘脂和蜡；基
于蛋白质的材料，例如胶原蛋白和明胶；基于硅酮的材料(挥发性和非挥发性)；以及烃基材料，例如微海绵和聚合物基质。组合物可以进一步包括一种以上的适于改善所应用的制剂的稳定性或功效的组分，例如稳定剂、悬浮剂、乳化剂、粘度调节剂、胶凝剂、防腐剂、抗氧化剂、皮肤渗透促进剂、湿润剂和缓释材料。在马丁代尔大药典(martindale,w.和reynolds,j.e.f.martindale:the extra pharmacopoeia.第31版,london,the pharmaceutical press.1996)和雷明顿：药物的科学和实践(remington:the science and practice of pharmacy,lippincott williams&wilkins,philadelphia,pa,第21版,2005)中描述了此类组分的实例。制剂可包含微胶囊，例如羟甲基纤维素或明胶的微胶囊、脂质体、白蛋白的微球、微乳剂、纳米颗粒或纳米胶囊。
[0165]
可以通过多种物理形式中的任何一种来制备局部用制剂，所述物理形式包括例如，固体、糊剂、乳膏、泡沫、洗剂、凝胶、粉末、水性液体和乳剂。此类药学上可接受的形式的物理外观和粘度可以通过制剂中存在的乳化剂(一种或多种)和粘度调节剂(一种或多种)的存在和数量来确定。
[0166]
固体通常是坚硬且不可倾倒的，通常被配制成条或棍或颗粒形式；固体可以是不透明的或透明的，并且可以任选地包含溶剂、乳化剂、湿润剂、润肤剂、香料、着色剂/染料、防腐剂和其它增强或强化终产物的功效的活性成分。
[0167]
乳膏和洗剂通常彼此相似，主要区别在于它们的粘度；洗剂和乳膏可以是不透明的、半透明的或透明的，并通常包含乳化剂、溶剂和调节粘度的试剂、以及湿润剂、润肤剂、香料、着色剂/染料、防腐剂和其它增强或提高终产物的功效的活性成分。
[0168]
可以制备具有从有高粘度的稠度到有低粘度的稀度的一系列粘度的凝胶。这些制剂以及洗剂和乳膏的制剂也可以包含溶剂、乳化剂、湿润剂、润肤剂、香料、着色剂/染料、防腐剂和其它增强或提高终产物的功效的活性成分。
[0169]
液体比乳膏、洗剂或凝胶稀，并且通常不含乳化剂。液体局部用产品通常包含溶剂、乳化剂、湿润剂、润肤剂、香料、着色剂/染料、防腐剂和其它增强或提高终产物的功效的活性成分。
[0170]
适合用于局部用制剂的乳化剂包括但不限于离子乳化剂、鲸蜡硬脂醇、非离子乳化剂，例如聚氧乙烯油基醚、peg
‑
40硬脂酸酯，鲸蜡硬脂醇例如鲸蜡硬脂醇聚醚
‑
12、鲸蜡硬脂醇聚醚
‑
20、鲸蜡硬脂醇聚醚
‑
30、peg
‑
100硬脂酸酯、和甘油硬脂酸酯。调节粘度的合适试剂包括但不限于非离子型胶的保护性胶体，例如羟乙基纤维素、黄原胶、硅酸铝镁、二氧化硅、微晶蜡、蜂蜡、石蜡、和棕榈酸十六烷基酯。凝胶组合物可以通过添加胶凝剂例如壳聚糖、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚季铵盐、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、卡波姆或甘草酸与氨来形成。合适的表面活性剂包括但不限于非离子表面活性剂、两性表面活性剂、离子表面活性剂、和阴离子表面活性剂。例如，可以在局部用制剂中使用聚二甲基硅氧烷共聚醇、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯80、月桂酰胺dea、椰油酰胺dea和椰油酰胺mea、油基甜菜碱、椰油酰胺基丙基磷脂酰pg
‑
二铵的氯化物和月桂基硫酸铵中的一种以上。合适的防腐剂包括但不限于抗微生物剂，例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸、苯甲酸、和甲醛，以及物理稳定剂和抗氧化剂例如维生素e、抗坏血酸和没食子酸丙酯。合适的润湿剂包括但不限于乳酸和其它羟基酸及其盐、甘油、丙二醇和丁二醇。合适的润肤剂包括羊毛脂、凡士林、新硬脂酸异硬脂酯和矿物油
的衍生物。合适的香料和着色剂包括但不限于，fd&c红色40号和fd&c黄色5号。可以局部使用的其它合适的附加成分包括但不限于，研磨剂、吸收剂、消泡剂、抗静电剂、收敛剂(例如，金缕梅、醇和草药提取物，例如洋甘菊提取物)、粘合剂/赋形剂、缓冲剂、螯合剂、成膜剂、调理剂、推进剂、遮光剂、ph调节剂和保护剂。
[0171]
在用于局部使用的制剂中，可以进一步指出皮肤渗透促进剂的赋形剂，其功能可以是在透皮系统中增强化合物通过角质层在皮肤表面的释放。用于药物释放的主要渗透促进剂包括醇、二醇和甘油酯，例如乙醇、丙二醇、乙氧基二甘醇、1
‑
癸醇、2
‑
(2
‑
乙氧基乙氧基)乙醇；脂肪酸和酯，例如棕榈酸、癸酸、油酸、肉豆蔻酸、或月桂酸(kanikkannan,n.k.,kandimalla,k.,lamba,s.s.,singh,m.structure
‑
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–
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‑
100.1990)；磷脂，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺；环糊精(α
‑
环糊精、β
‑
环糊精和γ
‑
环糊精)；十二烷基
‑
n,n
‑
二甲基氨基乙酸酯(ddaa)；例如本文前面已引用的聚合物；例如acssspskhcg等小肽，和例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等消化酶(magnusson,b.m.and runn,p.effect of penetration enhancers on the permeation of the thyrotropin releasing hormone analogue pglu
‑3‑
methyl
‑
his
‑
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‑
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‑
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‑
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–
1401.2007)。
[0172]
用于外用的局部用组合物的典型施用方式包括使用手套用手直接施涂产品；或使
用例如刮刀、定量注射器、定量尺、粘合剂或胶棒等物理施涂器间接施涂；喷涂(包括喷雾、气溶胶或泡沫)；使用1ml的单剂量小袋(sachet)；用液滴计数器施涂；分散和冲洗。局部使用的指示的另一种形式是吸入或在皮肤的其它不同组织中施用，例如在结膜组织中施用的眼药水或用于耳施涂的耳用溶液。
[0173]
这些吸入剂制剂的示例性形式包括气溶胶的气态形式(使用常规推进剂，例如二氯氟甲烷或三氯氟甲烷)，或喷雾干燥和乳剂形式的颗粒，用于雾化吸入液体的溶液或悬浮液。此外，我们可以通过眼或结膜途径的冷膏、重构后的、由眼滴管配药(dispensed)的等渗悬浮液中或无菌悬浮液中的滴眼剂来举例说明药物形式，和通过耳途径的冷膏或也用滴液分配器配药的液体等渗药物形式来举例说明药物形式。
[0174]
然而，在示例性方式中，在不限制可能的制剂的情况下，可以将本发明的肽配制在a
‑
环糊精、羟乙基纤维素、peg6000、peg400、羟丙基13
‑
环糊精、乳化剂和稳定剂聚山梨酯20(tween 20)或80(tween 80)的组合物中。
[0175]
可以将药物形式制备为无菌可注射的水性或油性悬浮液。根据使用的载体和浓度，本文提供的化合物(一种或多种)可以悬浮或溶解在此类组合物中，所述组合物可以根据已知技术使用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂，例如上文提到的那些来配制。在可接受的载体和溶剂中可以使用的是水、1,3
‑
丁二醇、林格氏溶液和氯化钠、柠檬酸钠的等渗溶液和赋形剂，所述赋形剂可以包括例如与环糊精包合的复合物等佐剂，或释放系统，例如纳米乳剂、纳米悬浮液，微乳剂、聚合物胶束、脂质体、泡囊(niosomes)、传递体和醇质体(melkamu,g.,wohlrab,j.,neubert,r.h.dermal delivery of desmopressin acetate using colloidal carrier systems.the journal of pharmacy and pharmacology,57(4):423
–
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–
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[0176]
此外，无菌固定油可以用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何软固定油，包括合成的甘油单酯或合成的甘油二酯。此外，例如油酸等脂肪酸可用于制备可注射的组合物和佐剂，例如可以溶解在载体中的局部麻醉剂、防腐剂和/或缓冲剂。
[0177]
药物形式也可以配制成栓剂(例如，用于直肠施用)。可以通过将药物与合适的无刺激性的赋形剂混合来制备这样的组合物，所述赋形剂在环境温度下为固体，但在直肠温度下变为液体，因此将在直肠中溶解以释放药物。
[0178]
药物形式可以配制为以预定速率释放。可以例如通过舌下施用(即，以使活性成分(一种或多种)通过舌下神经丛的血管被快速吸收的方式通过口腔施用)来获得立即释放。
[0179]
可以例如口服、直肠或皮下或通过目标位置中的植入物施用控释制剂(即，在施用后减少和/或延迟活性成分(一种或多种)的释放的诸如胶囊、丸剂或包衣片剂等的制剂)。通常，可以通过将活性成分(一种或多种)与其自身改变释放速率的基质材料结合和/或通过使用延迟肠道(或植入物的位置)的分解和吸收的控释的包衣来获得控释的制剂，从而在较长时间内提供延迟或持续的作用。一种这种类型的控释制剂是持续释放的制剂，其中至少一种活性成分在一段时间内以恒定速率连续释放。优选地，在至少4小时、优选至少8小时、更优选至少12小时的时间段内以使血液(例如，血浆)中的治疗剂的浓度保持在治疗范围内、然而低于毒性水平的速率释放治疗剂。通常可以使用众所周知的技术来制备这样的制剂。在此类制剂中使用的载体是生物相容的，并且也可以是生物可降解的。优选地，制剂提供调节剂的恒定水平的释放。持续释放的制剂中所含的调节剂的量取决于例如植入物的位置、预期的释放速率、和持续时间以及待治疗或预防的病况的性质。
[0180]
释放速率可以使用本领域众所周知的方法来改变，包括(a)包衣的组合物的厚度的变化，(b)包衣上的增塑剂的添加方式的量的改变(c)包含其它成分，例如改变释放的试剂，(d)基质的组合物、颗粒大小或颗粒形式的改变，以及(e)提供一个以上的通过包衣的通道。持续释放制剂中所含的调节剂的量取决于，例如施用方法(例如，植入物的位置)、预期的释放速率和持续时间以及待治疗或预防的病况的性质。
[0181]
其自身可以发挥或不发挥控释功能的基质材料通常是支撑活性成分(一种或多种)的任何材料。例如，可以使用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等材料。活性成分(一种或多种)可以在形成剂型(例如，丸剂)之前与基质材料组合。可选地或此外地，可以将活性成分(一种或多种)包被在包含基质材料的微粒、颗粒、球体、微球体、小球或丸粒的表面。这样的包衣可以通过常规方式，例如通过将活性成分(一种或多种)溶解在其它或另一种合适的溶剂中并喷雾来获得。任选地，在包衣之前添加额外的成分(例如，以帮助将活性成分(一种或多种)结合至基质材料上)。然后可以在施加控释包衣之前用阻隔剂包被基质。如果需要，可以封装多个包被的基质单元以产生最终剂型。
[0182]
控释包衣可以是连续且均匀的膜，能够支撑颜料和其它添加剂，无毒、惰性且无粘附性。调节调节剂的释放的包衣包括可用于在胃和肠溶衣中释放调节剂的非ph依赖或ph依赖包衣(使制剂完整地通过胃，在小肠中，包衣溶解，内容物被人体吸收)。ph依赖包衣包括，例如虫胶、邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸纤维素甲基羟丙基酯、甲基丙烯酸和玉米蛋白的酯的共聚物。
[0183]
在某些形式中，包衣是疏水性材料，优选以有效减少施用后胶凝剂的水合的量使用。合适的疏水性材料包括烷基纤维素(例如，乙基纤维素或羧甲基纤维素醚)、纤维素醚、纤维素酯、丙烯酸类聚合物(例如，(聚)丙烯酸、(聚)甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸甲酯的共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、链烷醇酰胺/甲基丙烯酸的共聚物、(聚)甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸铵共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、(聚)甲基丙烯酸酐和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物)及其混合物。
[0184]
代表乙基纤维素的水性分散体包括，例如，(fmc corp.,philadelphia,pa)和(colorcon,inc.,west point,pa)，根据制造商的说明两者适用于基材。代表性的丙烯酸类聚合物包括，例如，各种聚合物
(rohm america,piscataway,nj)，可以单独使用或组合使用，取决于所需的释放曲线。
[0185]
包含疏水性材料的水性分散体的包衣的物理性质可以通过添加一种以上的增塑剂来改善。适用于烷基纤维素的增塑剂包括，例如癸二酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、和甘油三乙酸酯。适用于丙烯酸类聚合物的增塑剂包括，例如柠檬酸酯，例如柠檬酸三乙酯和柠檬酸三丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、聚乙二醇、丙二醇、邻苯二甲酸二乙酯、蓖麻油植物和三乙酸甘油酯。
[0186]
控释包衣通常使用常规技术施加，例如通过以水性分散体形式喷雾。如果需要的话，包衣可以包含孔或通道以促进活性成分的释放。可以使用公知的方法产生孔和通道，包括添加在使用环境中从包衣中溶解、提取或释放的有机或无机材料。此类孔形成材料中的一些包括亲水性聚合物，例如羟烷基纤维素(例如，羟丙基甲基纤维素)、纤维素醚、水溶性合成聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮、交联的聚乙烯吡咯烷酮、和聚环氧乙烷)、水溶性聚葡萄糖、糖类和多糖、以及碱金属盐。
[0187]
可与载体的材料结合以产生单位剂量的活性成分的量将根据例如，所治疗的患者、尤其是施用方式以及任何其它共同施用的药物而不同。剂量单位通常包含约5μg至约2g之间的活性成分。可以使用本领域众所周知的试验和常规程序来确定最佳剂量。
[0188]
在本发明的一方面，组合物除了包含本发明的一种以上的平滑肌张力调节肽以外，还可包含一种以上的其它活性成分，所述活性成分包括但不限于例如镇痛药、抗炎药、驱肠虫剂、抗心律失常药物、抗生素、抗凝剂、溶栓剂、利尿药、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗癫痫药、抗组胺药、抗高血压药、抗毒蕈碱剂、抗分枝杆菌剂、抗肿瘤药、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗病毒药、抗焦虑镇静药(催眠药和抗精神病药)、β
‑
肾上腺素受体阻滞剂、血液制品及其替代品、心脏正性肌力药(inotropic agents cardiac agents)、皮质类固醇、止咳药(祛痰剂和粘液溶解剂)、利尿剂、多巴胺能药(抗帕金森药)、止血剂、免疫剂、脂质调节剂、肌肉松弛药、拟副交感神经药、前列腺素、白三烯、支气管扩张药、性激素(包括类固醇)，抗过敏药、拟交感神经药、血管扩张药、促动力药、止吐药、化学治疗药、和黄嘌呤。
[0189]
在一些实施方案中，本发明包括平滑肌张力调节肽用于治疗受益于平滑肌收缩性调节的疾病的用途，所述疾病包括但不限于：勃起功能障碍(ed)，女性性功能障碍(fsd)，良性前列腺增生(bph)，雷诺氏综合征，肺动脉高压(pah)，系统性动脉高压(sah)和与哮喘、copd相关的气道的高反应性，肺纤维化，矽肺，过敏性支气管肺曲霉病，遗传性血管性水肿，和新生儿缺氧呼吸衰竭。
[0190]
例如，一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将足以治疗其中平滑肌的张力的调节是有益的病症的量的上述任何一种至多种肽引入至药学上可接受的赋形剂。
[0191]
在一些实施方案中，病症选自由以下组成的组：勃起功能障碍(ed)，女性性功能障碍(fsd)，良性前列腺增生(bph)，雷诺氏综合征，肺动脉高压(pah)，系统性动脉高压(sah)和与相关的气道的高反应性哮喘、copd，肺纤维化，矽肺，过敏性支气管肺曲霉病，遗传性血管性水肿，和新生儿缺氧呼吸衰竭。
[0192]
在一些上实施方案中，肽具有seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:23、或seq id no:24的氨基酸序列，并且进一步地其中所述病症为pah。
[0193]
v
‑
平滑肌张力调节肽的应用
[0194]
本发明的平滑肌张力调节肽可用于治疗受益于平滑肌张力的调节的疾病。在一个特定方面，本发明的肽可用于治疗其中平滑肌张力永久性或暂时性失衡的疾病。
[0195]
在一些实施方案中，一种用于治疗有调节平滑肌的张力的需要的患者的病症的方法，包括向患者施用治疗有效量的上述任何一种或多种肽。
[0196]
在一些实施方案中，病症选自由以下组成的组：勃起功能障碍(ed)，女性性功能障碍(fsd)，良性前列腺增生(bph)，雷诺氏综合征，肺动脉高压(pah)，系统性动脉高压(sah)和与哮喘、copd相关的气道的高反应性，肺纤维化，矽肺，过敏性支气管肺曲霉病，遗传性血管性水肿，和新生儿缺氧呼吸衰竭。
[0197]
在一些实施方案中，肽具有seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:23、或seq id no:24的氨基酸序列，并且进一步地其中所述病症为pah。
[0198]
以下临床病症非详尽地举例说明了所讨论的肽的可能治疗应用。
[0199]
a)ed：阴茎的海绵体平滑肌的松弛是最常应用于治疗ed的药理学类别作用机制中的常见事件。例如，pde5i(例如西地那非和他达拉非)防止鸟苷酸环化酶在被no激活后产生的对环鸟苷单磷酸(cgmp)的降解并增强阴茎的海绵体的松弛，因此促进或增强勃起。然而，pde5i需要能够诱导no从阴茎神经和局部血管内皮释放的刺激。因此，pde5i在具有神经或内皮损伤的患者中，例如具有高血压、糖尿病的患者或接受前列腺切除术并伴有进一步神经损伤的患者中无效(shamloul,r.；ghanem,h.erectile dysfunction.the lancet,381(9861):153
‑
165,2013)。本发明的肽即使在存在神经或内皮损伤的情况下也促进平滑肌组织的松弛。因此，所述肽可完全适用于ed的治疗，包括对pde5i具有耐药性的表型。此外，平滑肌张力调节肽的作用机制有利于与pde5i的协同作用，允许临床上共施用。
[0200]
b)fsd：fsd可能与渗透阴道和阴蒂的动脉网络中的血管损伤相关，后者构成促进女性性高潮的关键结构。由于与阴茎的解剖相似性，已知阴蒂也通过no依赖性机制响应性刺激而舒张(park,k.,goldstein,i.,andry,c.,siroky,m.b.,krane,r.j.,azadzoi,k.m.vasculogenic female sexual dysfunction:the hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency.international journal of impotence research,9,27
‑
38,1997)。此外，血管舒张和随之而来的局部血流增加有利于润滑和愉悦感(velten,j.,chivers,m.l.,brotto,l.a.does repeated testing impact concordance between genital and self
‑
reported sexual arousal in women？archives of sexual behavior.47(3):1
‑
10.2018)。因此，本发明的肽可用于治疗fsd。
[0201]
c)bph：前列腺增生是bph的特征，导致尿道内压力增加，阻碍尿液流出。最终，尿路完全阻塞，引起作为bph的急性并发症的急性尿潴留事件。急性尿潴留的治疗也基于能够引起尿道平滑肌松弛从而降低尿道内压力的作用机制(thomas,k.,chow,k.,kirby,r.s.acute urinary retention:a review of the aetiology and management.prostate cancer and prostatic diseases,7(1):32.2004)。考虑到本发明的肽对平滑肌的活性，预期它们可用于治疗bph。
[0202]
d)pah：pah是一种罕见的严重的慢性心肺疾病，其由小肺动脉的细胞增殖和纤维化、尤其是平滑肌细胞的增生和肥大引起。由于结构改变，临床上通过肺血管阻力的逐步增
加来识别pah。pah的当前治疗选择主要靶向三种信号传导途径：前列环素、内皮素
‑
1和no。所有这些药理学类别均调节血管舒缩张力(vasomotor tone)，促进血管的松弛和血管阻力的降低(lau,e.m.t.,giannoulatou,e.,celermajer,d.s.,humbert,m.epidemiology and treatment of pulmonary arterial hypertension.nature reviews cardiology,14(10):603
‑
614.2017)。根据其病因，pah被世界卫生组织进一步分为五个组。最大的一组是第1组pah，其包括特发性pah(ipah)、遗传性pah、药物、和毒素诱导的pah、与其它疾病相关的pah、以及新生儿的持续性肺高压(pphn)。其中，ipah具有最高的发病率。(chester,a.h.,yacoub,m.h.,moncada,s.nitric oxide and pulmonary arterial hypertension.global cardiology science and practice,14.2017)。pah已显示与强烈的全身性炎症相关，患者表现出包括il
‑
1、il
‑
6、il
‑
8、tnf
‑
a等循环炎症细胞因子的水平升高(price,l.c.,wort,s.j.,perros,f.,p.,huertas,a.,montani,d.,cohen
‑
kaminsky,s.,humbert,m.inflammation in pulmonary arterial hypertension.chest,141(1):210
‑
221.2012)。由于本发明的肽能够促进肺动脉的血管舒张、降低肺动脉压力、改善pah相关的继发性心血管改变并减轻炎症，因此本发明的肽可用于治疗pah。
[0203]
e)sah：血压的病理性升高导致心脏负荷(cardiac debt)和/或周围血管阻力的失调。当前可用的治疗方法靶向血压的一个或两个分量。采用了不同的药理学类别来降低外周阻力，然而它们中的很大一部分促进血管的平滑肌的松弛或阻断收缩性刺激(例如，由交感神经ans发出的刺激)的作用(参见goodman,l.s.和gilman,a.goodman&gilman's pharmacological basis of therapeutics.new york: mcgraw
‑
hill.p.846,2006)。本发明所述的平滑肌张力调节肽能够松弛血管结构并改善高血压继发的心血管特征，因此可用于治疗sah。
[0204]
f)雷诺氏综合征：该疾病的生理病理学特征是由寒冷或情绪紧张引起的手部肢体中的缺血性痉挛。建议的治疗是基于通过局部应用例如硝酸盐、pde5i、钙通道阻滞剂和前列腺素等血管扩张剂引起局部血管收缩的逆转(m.,m.recent achievements in the management of raynaud’s phenomenon.vasc health risk manag.6:207
–
214.2010)。因此，能够促进平滑肌松弛和随后的血管舒张的本发明的肽可用于预防和治疗雷诺氏病。
[0205]
g)气道高反应性：表述“高反应性”表示面对括约肌刺激时气道收缩性的增加。这种现象在呼吸道系统的各种疾病中都很常见，这些疾病中可指出哮喘、copd、支气管炎、和过敏性鼻炎等。气道的高反应性由覆盖上气道并延伸至细支气管的软肌肉组织层介导。治疗涉及对导致气道的高反应性的炎症过程的无症状控制，然而使用支气管扩张药可从危机中恢复，促进相邻平滑肌的松弛(参见braman,s.s.,barrows,a.a.,decotiis,b.a.,settipane,g.a.,corrao,w.m.airway hyperresponsiveness in allergic rhinitis:a risk factor for asthma.chest,91(5):671
‑
674.1987；postma,d.s.,and kertjens,h.a.m.characteristics of airway hyperresponsiveness in asthma and chronic obstructive pulmonary disease.american journal of respiratory and critical care medicine,158(supplement_2):s187
‑
192,1998；inman,m.d.airway hyperresponsiveness.chest journal,123(3):411s
‑
416s.2003)。本发明的肽逆转由痉挛
allergic bronchopulmonary aspergillosis.respir med.97(4):331
‑
6,2003)。此外，在气管环中继发于平滑肌细胞松弛的本发明的支气管扩张剂作用对于气流阻塞的患者来说是有用的，而不会引起肺组织炎症的增加。
[0209]
l)新生儿缺氧呼吸衰竭：这是可以受益于本发明的新生儿病症。新生儿的持续性肺动脉高压(pphn)是在出生时或出生后不久无法进行正常肺血管适应，导致高的肺血管阻力。pphn的治疗旨在降低肺血管阻力，为此目的采用了不同形式的机械呼吸器。在衰竭的情况下，使用静脉内血管扩张剂(托拉唑啉、依普斯汀醇和依诺西酮)和pde5i。然而，这些化合物具有不利的风险状况，已知会在某些患者中出现低血压、肾衰竭和出血。吸入性一氧化氮施用对这类患者的安全性较好，然而这些患者的欠佳的肺膨胀损害潜在结果(muraca,m.c.,negro,s.,sun,b.,buonocore,g.nitric oxide in neonatal hypoxemic respiratory failure.the journal of maternal
‑
fetal and neonatal medicine,25(s(1)):47
–
50.2012)。本发明中描述的肽，由于在通过合适的装置或吸入器鼻内施用时没有全身暴露，而可以具有更好的安全性，并且由于本发明的肽能够诱导nos亚型的表达、因此产生局部可用的no的事实，而具有比吸入一氧化氮更有效的潜力。
[0210]
因此，本发明还考虑了使用平滑肌张力调节肽来治疗患有上述病况的个体。
[0211]
本发明还考虑了平滑肌张力调节肽在制备用于治疗上述疾病的药物中的用途。
[0212]
平滑肌张力调节肽、其类似物和衍生物的生物活性可以通过离体(ex vivo)和体内(in vivo)的不同方法来验证。下面的实施例在基于气管环、肺动脉和阴茎海绵体带、富含平滑肌组织结构的片段的“分离的器官”模型中，描述了平滑肌张力调节肽的离体松弛活性，而没有引发炎症。下面的其它实施例描述了在pah大鼠模型中的所选的平滑肌张力调节肽的血管舒张、血液动力学参数的改善和抗炎作用引起的肺动脉压降低的体内作用，所述pah大鼠模型的特征为由持续的平滑肌过度收缩引起的肺动脉压升高引起的心肺疾病。
[0213]
因此，下文将通过实施例描述本发明，所述实施例另外说明了本发明，但是无意于限制本发明的范围。
[0214]
实施例
[0215]
实施例1：肽的合成
[0216]
本发明的肽通过在巴西里约热内卢的genone公司制造的rink
‑
amide树脂(0.68mmol/g)中(批次:p170313
‑
tl569356、p170313
‑
tl569357、p170313
‑
tl569358、p170315
‑
tl569368、p170315
‑
tl569382、p170313
‑
tl569361、p170315
‑
tl569362、p170313
‑
tl569359、p170313
‑
tl569360、p170315
‑
tl569363、p170315
‑
tl569364、p170313
‑
tl569366、p170313
‑
tl569367、wb170023
‑
p171025、wb170024
‑
p171025、p170315
‑
tl569382、p170315
‑
tl569383、p170315
‑
tl569384、p170315
‑
tl569380、wb170028
‑
p171025、p170315
‑
tl569381、p170315
‑
tl569385、p170315
‑
tl569386、p170315
‑
tl569387、p170315
‑
tl569380、wb170017
‑
p171025、wb170025
‑
p171025、wb170027
‑
p171025、wb170026
‑
p171025和wb170022
‑
p171025)，通过在固相支撑物中的fmoc/叔丁基合成来化学合成。用水
‑
tfa
‑
1.2
‑
乙二硫醇
‑
三异丙基硅烷、92.5
‑
2.5
‑
2.5
‑
2.5(v/v)、25℃、180分钟实现最终的裂解和脱保护。用50％(v/v)的乙腈的水溶液提取肽并通过sephasil c8肽(5μst 4.6/100
‑
hplc)的柱中的反相色谱(rpc)纯化，用水tfa0.1％平衡。使用具有0.1％de tfa的乙腈的梯度液，在280nm、2ml/min的流速下洗脱样品。纯化后，可以将来自所有组合物的tfa的平衡离子交换更改为氯离
子或乙酸根离子，以保持所有所需的理化特性(例如溶解度、pi、pk、稳定性等)。此外，所有肽都被n
‑
末端乙酰化和c
‑
末端酰胺化以增加溶解度。
[0217]
实施例2：气道肌中的体外松弛作用
[0218]
通过气管环的痉挛收缩模型离体评价肽的松弛作用的强度，该模型主要用于试验新的支气管扩张剂(参见cullum,v.a.,farmer,j.b.,jack,d.,levy,g.p.salbutamol:a new,selectiveβ
‑
adrenoceptive receptor stimulant.british journal of pharmacology,35(1):141
‑
151.1969；kao,c.h.,chu,y.h.,wang,h.w.effects of lidocaine on rat’s isolated tracheal smooth muscle.european archives of oto
‑
rhino
‑
laryngology,267(5):817
‑
820.2010；m.a.,i.,arellano
‑
mendoza,m.g.,correa
‑
basurto,j.,trujillo
‑
ferrara,j.g.synthesis,pharmacological and in silico evaluation of 1
‑
(4
‑
dihydroxy
‑
3,5
‑
dioxa
‑4‑
borabycyclo[4.4.0]deca
‑
7,9,11
‑
trien
‑9‑
yl)
‑2‑
(tert
‑
butylamine)ethanol,a compound designed to act as aβ2adrenoceptor agonist.european journal of medicinal chemistry,44(7):2840
‑
2846.2009)。
[0219]
对于各个试验，将dunkin
‑
hartley豚鼠(400
–
500g)在co2气氛中安乐死；然后，将气管暴露、取出并切成1至3个软骨气管环段(segment)。在37℃、在用碳质混合物(carbogenic mixture)(95％的o2和5％的co2)持续通气的情况下，将各段转移至含有krebs营养液(nacl 118mm；kcl 4.8nm；cacl
2 2.5mm；mgso
4 1.2mm；kh2po
4 1.2mm；nahco
3 24mm；葡萄糖11mm)的单独器官浴系统中。在每个系统中，固定在容器底部的杆和连接至等距传感器(grass ft
‑
03)的另一个杆构成了片段(fragment)的支撑。连接至等距传感器的数据数字化系统允许记录由气管环收缩产生的张力变化(powerlab
tm
16/30,labchart,8.1版本,ad instruments,australia)。将基础张力调节至1g，随后，通过用卡巴胆碱(2.5μm)刺激来评价片段的收缩性。静置1小时后，恢复基础张力，使组织经受由组胺(50μm)诱导的收缩，然后暴露于增加浓度的处理(0.01至10μm；n＝8)中或比较物pntx(19)中。
[0220]
表1列出了以将电压降低至组胺诱导的最大收缩的50％的浓度的负对数表示的效能值(pec50)、和使用软件graph prism 5.0(graphpad software,la jolla,ca,usa)的sigmoid非线性回归方程由至少8个独立试验计算的功效(emax)的平均值
±
sem。以比较物pntx(19)获得的结果示于表1。
[0221]
表1：由气管环的平滑肌的离体松弛中的活性肽的浓度
‑
响应曲线获得效能(pec50)和功效值(emax)
[0222]
simplified in vitro preparation of the corpus cavernosum as a tool for investigating erectile pharmacology in the rat.pharmacological research,30(4):325
‑
334.1994；gemalmaz,h.,waldeck,k.,chapman,t.n.,tuttle,j.b.,steers,w.d.,andersson,ke.in vivo and in vitro investigation of the effects of sildenafil on rat cavernous smooth muscle.the journal of urology,165(3):1010
‑
1014.2001)。
[0232]
用铡刀(guillotine)处死sprague dawley(sd)系的雄性大鼠；手术去除阴茎并将其置于含有krebs
–
碳酸氢盐溶液(nacl 118.1mm；kcl 4.7mm；kh2po
4 1.0mm；mgso
4 1.0mm；nahco
3 25.0mm；cacl
2 2.5mm和葡萄糖11.1mm)的培养皿中。通过去除龟头、尿道、海绵状体和背静脉来解剖海绵体，然后通过切割它们之间的纤维隔膜将其分开。在37 0c、充入95％的02和5％的c02的情况下，将尺寸为2
×2×
7mm的海绵体带分别置于含有碳酸氢盐溶液
‑
krebs(ph 7.4)的用于分离的器官的浴中。将组织连接至张力传感器，并且持续记录张力的变化。用苯肾上腺素(10
‑5m)收缩海绵体带，随后以不同频率(1至32hz)通过电刺激进行松弛。为了说明，在存在或不存在作为非特异性nos阻断剂的l
‑
name的情况下，用不同浓度的肽seq id no:5、seq id no:8、seq id no:19和seq id no:24(10
‑
10
m；10
‑8m；10
‑6m)孵育10分钟后发生刺激。可选地，所述肽在单个浓度(1o
‑8m)，n＝6下被比较物pntx(19)代替。通过双向方差分析(two
‑
way anova)，然后进行bonferroni事后检验，评价处理和对照之间的松弛百分比差异的统计学上的显著性。为了根据单一频率的刺激进行处理和对照之间的比较，通过单向分析方差(one
‑
way anova)然后进行bonferroni事后检验评价结果。在所有情况下，对于所有低于0.05的值p，都认为结果具有统计学差异。
[0233]
如本领域中所述，pntx(19)在增强由对预收缩海绵体带的电刺激促进的平滑肌松弛方面有效(图2)。然而，本发明的平滑肌张力调节肽在低至1o
‑
10
m的浓度下增强电刺激诱导的海绵体带的松弛(图3)。因此，与pntx(19)相比，当在最佳的刺激频率范围下比较时，本发明的肽至少100倍更有效(1o
‑
10
m相对1o
‑8m)(图4)。然而，在存在作为非特异性nos阻断剂的l
‑
name的情况下，本发明的肽不能促进海绵体平滑肌的松弛，表明本文所述的化合物的治疗作用是由no介导的。
[0234]
尽管本发明是针对特定方式进行描述的，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以在其中进行各种修改和变型。
[0235]
实施例4：肺动脉的离体松弛作用
[0236]
具有苯肾上腺素的肺动脉平滑肌收缩的离体模型对于筛选用于需要血管舒张作用的肺疾病的候选化合物是非常有用的(alencar,a.k.,pereira,s.l.,montagnoli,t.l.,maia,r.c.,a.e.,landgraf,s.s.,caruso
‑
neves,c.,ferraz,e.b.,tesch,r.,nascimento,j.h.,de sant'anna,c.m.,fraga,c.a.,barreiro,e.j.,sudo,r.t.,zapata
‑
sudo,g.beneficial effects of a novel agonist of the adenosine a2a receptor on monocrotaline
‑
induced pulmonary hypertension in rats.br j pharmacol,169:953
–
62.2013)。
[0237]
由于这种血管舒张可以通过产生no的化合物来实现，在使用雄性wistar大鼠肺动脉进行的离体测定中证明了在松弛来自不同组织的平滑肌中的应用程度。通过腹膜内施用，用咪达唑仑和氯胺酮(分别为2mg/kg和100mg/kg)麻醉大鼠。通过腹膜内施用(50mg/kg)输注致死剂量的硫喷妥钠后，通过胸骨切开术仔细地切除肺动脉干。仔细地解剖肺动脉并
去除结缔组织。将动脉连接至力传感器，将其置于充满krebs溶液的垂直腔室中，充氧并保持在37℃。
[0238]
在1.5克张力下稳定2小时后，将动脉暴露于增加剂量的苯肾上腺素(1nm
–
10 1
‑
jm)中以获得最大的平滑肌收缩，然后暴露于增加剂量的各浓度为1nm
‑
10 1
‑
jm(n＝9)的所选的肽中。以5分钟间隔对各剂量评价肺动脉产生的张力(alencar,a.k.,pereira,s.l.,montagnoli,t.l.,maia,r.c.,a.e.,landgraf,s.s.,caruso
‑
neves,c.,ferraz,e.b.,tesch,r.,nascimento,j.h.,de sant'anna,c.m.,fraga,c.a.,barreiro,e.j.,sudo,r.t.,zapata
‑
sudo,g.beneficial effects of a novel agonist of the adenosine a2a receptor on monocrotaline
‑
induced pulmonary hypertension in rats.br j pharmacol 169:953
–
62.2013；alencar,a.k.,pereira,s.l.,da silva,f.e.,mendes,l.v.,cunha vdo,m.,lima,l.m.,montagnoli,t.l.,caruso
‑
neves,c.,ferraz,e.b.,tesch,r.,nascimento,j.h.,sant'anna,c.m.,fraga,c.a.,barreiro,e.j.,sudo,r.t.,zapata
‑
sudo,g.n
‑
acylhydrazone derivative ameliorates monocrotaline
‑
induced pulmonary hypertension through the modulation of adenosine aa2r activity.international journal of cardiology,173(2):154
‑
62.2014)。该测定法排除未由苯肾上腺素实现任何收缩的动脉。
[0239]
试验的结果总结在下面的表2中。效能值显示为将电压降低至组胺诱导的最大收缩的50％的浓度的负对数(pec50)，并将其表示为平均值
±
sem。在给定动脉中实现的最大收缩被认为是收缩的100％，并且有效性(emax)表示为与该最大值相关的松弛百分比。结果是使用sigmoid非线性回归方程从至少3个独立试验中计算得出的，并且通过对激动剂相对响应的对数进行非线性拟合来完成浓度曲线的统计分析。以上所有计算均在软件graph prism 5.0(graphpad software,la jolla,ca,usa)上进行。张力分析是在软件labchart7(ad instruments,sydney,australia)上进行的。作为确定生物学意义的截止值，我们将高于30％的肺动脉松弛值视为具有生物学相关性，将其视为活跃的，然后计算emax值(sun,c.k.,lin,y.c.,yuen,c.m.,chua,s.,chang,l.t.,sheu,j.j.,lee,f.y.,fu,m.,leu,s.,yip,h.k.enhanced protection against pulmonary hypertension with sildenafil and endothelial progenitor cell in rats.international journal of cardiology,162(1):45
–
58.2012；alencar,a.k.,pereira,s.l.,da silva,f.e.,mendes,l.v.,cunha vdo,m.,lima,l.m.,montagnoli,t.l.,caruso
‑
neves,c.,ferraz,e.b.,tesch,r.,nascimento,j.h.,sant'anna,c.m.,fraga,c.a.,barreiro,e.j.,sudo,r.t.,zapata
‑
sudo,g.n
‑
acylhydrazone derivative ameliorates monocrotaline
‑
induced pulmonary hypertension through the modulation of adenosine aa2r activity.international journal of cardiology,173(2):154
‑
62.2014)。
[0240]
表2：由肺动脉的平滑肌的离体松弛中的活性肽的浓度
‑
响应曲线获得效能(pec
50
)和功效值(e
max
)(n＝9)。
[0241]
序列pec
50
有效性(emax)(％)seq id no:177.8
±
3.015％
±
2.6seq id no:186.5
±
9.318％
±
9.12
seq id no:196.9
±
6.5524％
±
9.71seq id no:206.1
±
6.96％
±
7.64seq id no:225.8
±
3.18％
±
2.83seq id no:236.1
±
6.24％
±
6.07seq id no:244.4
±
6.45％
±
5.96
[0242]
所有试验的肽具有大于30％的肺动脉松弛的绝对值，因此它们全部具有一定程度的有效性。由于seq id no:19的高有效性值，选择seq id no:19用于进一步的体内实验。
[0243]
实施例5：seq id no:19在野百合碱诱导的肺动脉高压(pah)模型中诱导体内血液动力学参数的恢复。
[0244]
野百合碱(mct)模型是pah中最广泛使用的动物模型，其是现存的最古老的并且在可用模型中描述得最好的模型。在单个腹膜内或皮下mct注射后该模型提供模仿人类pah的几个关键方面的优势，所述关键方面包括血管重塑、平滑肌细胞增殖、内皮功能障碍、炎性细胞因子上调、以及右心室衰竭(gomez
‑
arroyo,j.g.,farkas,l.,alhussaini,a.a.,farkas,d.,kraskauskas,d.,voelkel,n.f.,bogaard,h.j.the monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective.am j physiol lung cell mol physiol,302(4):l363
‑
9.2012)。
[0245]
目前用于研究mct诱导的pah的优选物种是大鼠，所述疾病的临床症状为在mct注射后3
‑
7天内表现厌食、精神不振、体重减轻、和呼吸急促。随着肺损伤和血管重塑的进展，动物会出现不同程度的呼吸困难、无力、腹泻和周围性发绀(schoental r.,head,m.a.pathological changes in rats as a result of treatment with monocrotaline.br j cancer,9(1):229
‑
37.1955)。mct注射后一周，可观察到内皮损伤、炎症浸润和水肿，但肺动脉压(pap)未升高。两周后，在药物施用后第三周，pap升高导致右心室(rv)肥大(west,j.,hemmes,a.experimental and transgenic models of pulmonary hypertension.compr physiol,1(2):769
‑
82.2011)。
[0246]
为了评价seq id no:19在pah的治疗中的潜在益处，我们使用成年健康的雄性wistar大鼠，然后将其随机分为两组：野百合碱诱导的pah(mct,n＝14)，其中动物接受60mg/kg的mct腹膜内注射(c2401,sigma chemical co.,st louis,mo,usa,批号:wxbc4737v)和2)对照(ctrl,n＝7)，其中动物腹膜内接受类似体积的盐水溶液。这是研究的第0天。在同一天，在随机分配之前，对动物进行超声心动图分析以建立基线。在第14天，进行另一超声心动图，并将pah动物进一步随机分配接受鼻内盐水(sal)或seq id no:19(0.06mg/kg)，每天两次，共14天。在第28天，重复进行超声心动图，rv出口区，左心室(lv)区，和pat/pet(肺动脉加速时间(pat)/肺动脉射血时间(pet)比率)。在pah疾病中，pap的增加导致由于压力增加而引起的rv区的增加，由于流向左心室的血流减少导致lv区减少。pat/pet比测定可预测轻度至中度pah，被认为是最具预测性的非侵入性测量之一(koskenvuo,j.w.,mirsky,r.,zhang,y.,angeli,f.s.,jahn,s.,alastalo,t.p.,schiller,n.b.,boyle,a.j.,chatterjee,k.,de marco,t.,yeghiazarians,y.a comparison of echocardiography to invasive measurement in the evaluation of pulmonary arterial hypertension in a rat model.int j cardiovasc imaging,26(5):509
‑
18.2010)。血流动力学参数通过有创rv插管进行测定，包括rv的收缩压(rvsp和
dp/dt比(压力的导数/最大时间的导数)，其与rv中的压力相关。
[0247]
使用双向方差分析对实验进行分析，然后进行bonferroni事后检验以确定统计学显著性。同样，图5和图6的图中描述的是受试者之间的标准偏差。
[0248]
与用载体处理的野百合碱诱导组(mct+载体)相比时，seq id no:19将pat/pet比增加至与未处理组(对照)相似的值，这对应于将pap降低至正常值范围(图5a)。用seq id no:19处理14天后发生了该改善。pap的降低导致rv压力降低，这由seq id no:19处理的组与mct+载体组相比较的rvsp和dp/dt最大比的降低所证明(分别为图5b和5c)。
[0249]
与mct+载体组相比，seq id no:19处理还诱导rv出口区减少(图6a)和lv区增加(图6b)，达到与对照相似的值，这意味着seq id no:19能够将心脏重塑回正常。
[0250]
这些结果表明，除了作为血管舒张剂外，seq id no:19还可用作如本文其它部分所述的pah和其它具有或不具有炎症成分的肺疾病的潜在治疗。
[0251]
实施例6：seq id no:19的体内抗炎作用
[0252]
在实施例5所述的实验中，处死动物以进行炎症标记物的尸体解剖分析。
[0253]
正如本文其它地方详细讨论的那样，所有肺疾病，包括哮喘、copd、和pah，都具有某种程度的炎症，这是该疾病生理病理学的一部分。旨在治疗这些疾病的药物不能引发炎症，即促炎。
[0254]
抗炎作用的机制之一是平滑肌细胞松弛可降低内皮的通透性，从而减少血液中炎性因子的迁移，减少了炎症过程(wallace,j.l.nitric oxide as a regulator of inflammatory processes.mem inst oswaldo cruz,100:5
‑
9.2005)。
[0255]
在五分之一的pah患者中，由于炎症相关的水肿而引起纵隔淋巴结肿大(bergin,c.j.,park,k.j.lymph node enlargement in pulmonary arterial hypertension due to chronic thromboembolism.j med imaging radiat oncol,52(1):18
‑
23.2008)。由于增加的液体含量，水肿器官的重量更大，因此我们称重了安乐死后的实施例5的动物的几个器官的重量。seq id no:19处理能够减少mct处理在纵隔淋巴结上引起的水肿增重，使其与ctrl组没有区别(图7a)。
[0256]
研究了野百合碱研究的心脏的样品，以揭示seq id no:19的潜在抗炎作用。在所有样品均质化过程中，将心脏置于冰上。以对于各样品为1ml的比例添加含有1％的在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中稀释的蛋白酶抑制剂混合物(sigma)的裂解缓冲液。还添加了1mm的原钒酸钠(sigma)。将组织均质化，然后以10,000g离心10分钟。将每个样品的上清液收集到无菌的鉴定管中，以测定总蛋白和细胞因子水平(肿瘤坏死因子(tnf)
‑
a、干扰素(inf)
‑
)(、和白介素(il)
‑
113)。
[0257]
根据制造商的说明，使用bradford检验(biorad,hercules,ca,usa)测定样品中的总蛋白值。简而言之，该方案在微量培养板中以150 1
‑
jl的最终体积进行。用牛血清白蛋白(bsa,sigma)制备0.025至2.0mg/ml之间范围的校准曲线。一式两份测定蛋白溶液。将样品20倍稀释至裂解缓冲液中，然后将来自这些样品的25 1
‑
jl装入每个孔中。使用多通道移液器添加125 1
‑
jl的quick starttm bradford 1x染料试剂溶液产生150 1
‑
jl的终体积。将样品在室温下孵育5分钟，然后在595nm下使用分光光度计测定吸光度(spectramax microplate读板仪,molecular devices,san jose,ca,usa)。标准曲线绘制为线性回归线，并与每个样品的平均吸光度进行内插，以求出样品的总蛋白浓度，表示为mg/ml。
[0258]
使用酶联免疫吸附测定(elisa)测定心脏匀浆的tnf
‑
a、inf
‑
)(、和il
‑
113的浓度。tnf
‑
a(目录号900
‑
k54)和inf
‑
y(目录号900
‑
k98)试剂盒购自peprotech(rocky hill,co,usa)，而il
‑
113(dy401)试剂盒则购自r&d系统(minneapolis,mi,usa)。并按照制造商的建议进行测定。
[0259]
数据分析使用统计软件包(prism 5.0版本,graph
‑
pad software,san diego,ca)进行。数据表示为平均值
±
sem。所有的试验使用单向方差分析(anova)然后进行bonferroni多重比较检验进行。如果p<0.05，则认为统计学差异是显著的。
[0260]
在心脏匀浆中，与对照组相比，mct组显示所有测定的细胞因子(tnf
‑
a、inf
‑
)(、和il
‑
113)均增加。seq id no:19将细胞因子降低至与对照相似的值(图7b、7c、7d)。
[0261]
实施例7：与pntx(9)相比，seq id no:19和seq id no:24的体内抗炎作用
[0262]
根据haspelagh等人(haspeslagh,e.,debeuf,n.,hammad,h.,lambrecht,b.n.murine models of allergic asthma.methods mol biol,1559:121
‑
136.2017)的方案，使雄性a/j小鼠(18
–
20g)对室内尘螨(hdm)敏感以产生急性过敏性哮喘。通过流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液(balf)中的炎症细胞浸润。
[0263]
通过气管内滴注，以每只动物10nmol和30nmol的剂量，用载体(pbs)、seq id no:19、seq id no:24或pntx(19)处理小鼠(每组n＝5)，并在攻击后6小时收集材料。
[0264]
暴露于pntx(19)(30nmol)的小鼠显示balf中总白细胞数目大量增加，这主要是由于中性粒细胞的积累所致(图8)。seq id no:19和seq id no:24处理未在气管内滴注所述肽6小时后诱导支气管肺泡空间中的中性粒细胞的积累(图8)，表明这两种肽与比较物pntx(19)不同，其在小鼠肺部没有促炎作用。值得注意的是，哮喘和其它诸如copd等肺疾病的慢性炎症主要涉及中性粒细胞向小气道的浸润，所述中性粒细胞是参与该过程的主要炎症细胞。
[0265]
抗炎作用的一种可能机制是平滑肌细胞的松弛可以降低内皮细胞的通透性，从而减少血液中炎症因子的迁移，减少了炎症过程。因此，与pnt(x)19相比，引起更有效的血管舒张的有效肽，例如seq id 24和seq id:19，具有更强的抗炎作用。
[0266]
序列(x)的列表
[0267]
1 arg
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