一种定位线粒体检测羟基自由基的双光子比率型探针的合成方法与应用与流程

本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种定位线粒体检测羟基自由基的双光子比率型探针的合成方法与应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

抑郁症作为一类发病率极高、治愈率极低的精神疾病，严重危害人类的健康。抑郁症的临床症状表现复杂多变，人们目前对于抑郁症的发病机制了解的不够全面。为了对抑郁症进行有效的预防和治疗，我们必须对抑郁症的发生和发展过程进行彻底的了解。双光子荧光成像技术具有高灵敏度、深组织穿透能力、高时空分辨率等优点，能够对生物活体内的活性分子进行实时动态的荧光成像。比率型荧光探针可以减少背景信号的干扰，因此应用比率型荧光显微成像可视化示踪细胞内生物活性分子是目前化学、生物学及医学领域研究的热点问题之一。

生物体在氧化应激过程中会产生大量的活性氧(ros)，羟基自由基(·oh)是一类反应活性、氧化性最强的ros。过量的·oh会造成dna断裂、细胞膜损伤，对神经细胞产生不可逆转的危害甚至是引起神经退行性疾病。线粒体是细胞内进行有氧呼吸的主要场所，除了为细胞供能外，线粒体还参与细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长的能力。因此探究在由氧化应激导致的抑郁症发病过程中线粒体内·oh的含量变化具有十分重要的生物意义。近年来已经发展了很多检测·oh的荧光探针，但定位于线粒体检测·oh水平浮动的双光子比率型荧光探针还未见报道。

技术实现要素：

为了克服上述问题，本发明提供了一种双光子比率型荧光探针用于在活体中检测线粒体内的·oh。因此，本发明发展了一种由三苯基膦(线粒体定位基团)、3-甲基-5-吡唑啉酮(·oh识别基团和荧光团1)和4-溴-1,8-萘酐(荧光团2)构成的比率型荧光探针。本发明具有制备简单、检测灵敏、选择性好等优点。值得注意的是，本发明成功实现了活体水平上成像分析抑郁症小鼠脑中线粒体内·oh的变化。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一种定位线粒体检测羟基自由基的双光子比率型探针的合成方法，包括：

将溴丙胺和三苯基膦反应，形成化合物ⅰ；

将化合物ⅰ与4-溴-1,8-萘酐反应，形成化合物ⅱ；

将化合物ⅱ与水合肼反应，形成化合物ⅲ；

将化合物ⅲ与乙酰乙酸乙酯反应，即得定位线粒体检测羟基自由基的双光子比率型探针。该类荧光探针结构新颖、灵敏度高、光稳定性好。

在一些实施例中，所述溴丙胺和三苯基膦的质量比为1：0.8～0.85，以提高反应效率和产品的得率。

在一些实施例中，溴丙胺和三苯基膦在乙腈回流的条件下，于85℃～90℃回流14～16h。反应结束后，反应液冷却至室温后加入15ml己烷、100ml异丙醇，固体溶解后再加入30ml乙醚，静置析出固体，抽滤得到白色粉末。

在一些实施例中，所述4-溴-1,8-萘酐与化合物ⅰ的质量比为0.65～0.7：1，以提高反应效率。

在一些实施例中，4-溴-1,8-萘酐与化合物ⅰ在无水乙醇回流的条件下，于80℃回流6～8h。反应结束后冷却至室温，将反应液倒入水中析出固体，抽滤得淡黄色固体。

在一些实施例中，化合物ⅱ与水合肼在无水乙醇回流的条件下，于130～140℃回流6～8h。

在一些实施例中，所述化合物ⅲ与乙酰乙酸乙酯的质量比为2.8～3：1。

在一些实施例中，将化合物ⅲ与乙酰乙酸乙酯分散在醇溶液中，于60～70℃回流10～12h。反应结束后，柱层层析法(环己烷：乙酸乙酯＝1:1)得到最终产物

本发明还提供了任一上述的方法制备定位线粒体检测羟基自由基的双光子比率型探针。

本发明还提供了上述的定位线粒体检测羟基自由基的双光子比率型探针在化学、生物学及医学领域中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明合成简单，检测速度快，检测过程中不需要长时间的孵育。

(2)本发明检测过程不需要外加其他化学物质，操作简单，细胞毒性小，有利细胞内检测。

(3)本发明的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1是本发明的光学性质图；

图2是本发明的细胞定位图；

图3是本发明细胞成像图；

图4是本发明活体成像图；

图5是本发明质谱图；

图6是本发明合成路线图；

图7是本发明探针的识别机理图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对目前缺少定位于线粒体检测·oh水平浮动的双光子比率型荧光探针的问题。因此，本发明提出一种检测细胞及活体中线粒体内·oh的新型比率型荧光探针及制备方法和应用，该类荧光探针结构新颖、灵敏度高、光稳定性好。

检测细胞及活体中线粒体内·oh的双光子比率型荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤a：1.0g溴丙胺和0.838g三苯基膦投入两口瓶中，加入5ml乙腈，85℃回流16h，反应结束后，反应液冷却至室温后加入15ml己烷、100ml异丙醇，固体溶解后再加入30ml乙醚，静置析出固体，抽滤得到白色粉末。

步骤b：0.83g的4-溴-1,8-萘酐和1.2g的步骤a的产物投入两口瓶中，加入20ml无水乙醇，80℃回流6h，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入水中析出固体，抽滤得淡黄色固体。

步骤c：在氮气保护下，0.58g的步骤b的产物溶于10ml无水乙醇中，加入过量(步骤b中产物的3～5倍当量)的水合肼，130℃回流8h，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入水中析出固体，抽滤得淡黄色固体。

步骤d：在氮气保护下，1.2g的步骤c的产物溶于4ml的无水乙醇中，加入400μl的乙酰乙酸乙酯，60℃反应12h，反应结束后，柱层层析法(环己烷：乙酸乙酯＝1:1)得到最终产物。

具体合成路线如图6所示；

探针的识别机理如图7所示：

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：

检测细胞及活体中线粒体内·oh的双光子比率型荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤a：1.0g溴丙胺和0.838g三苯基膦投入两口瓶中，加入5ml乙腈，85℃回流16h，反应结束后，反应液冷却至室温后加入15ml己烷、100ml异丙醇，固体溶解后再加入30ml乙醚，静置析出固体，抽滤得到白色粉末。

步骤b：0.83g的4-溴-1,8-萘酐和1.2g的步骤a的产物投入两口瓶中，加入20ml无水乙醇，80℃回流6h，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入水中析出固体，抽滤得淡黄色固体。

步骤c：在氮气保护下，0.58g的步骤b的产物溶于10ml无水乙醇中，加入过量(步骤b中产物的3.5倍当量)的水合肼，130℃回流8h，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入水中析出固体，抽滤得淡黄色固体。

步骤d：在氮气保护下，1.2g的步骤c的产物溶于4ml的无水乙醇中，加入400μl的乙酰乙酸乙酯，60℃反应12h，反应结束后，柱层层析法(环己烷：乙酸乙酯＝1:1)得到最终产物。

本发明的光学性质。

荧光检测具体步骤：

对照组：探针溶于dmso，配置成1mm的溶液，取10μl的溶液加入到1ml的ep管中，加入100μl的0.1m的pbs溶液，最后用水定容至1ml。

实验组：取0.0099g的fecl2和0.0186g的edta溶于水定容到10ml，得到5mm的·oh溶液。探针溶于dmso，配置成1mm的溶液，取10μl的溶液加入到1ml的ep管中，加入100μl的0.1m的pbs溶液，加入1μl的·oh溶液，最后用水定容至1ml。

配制完成后，用双光子共聚焦荧光显微镜扫描得到荧光光谱，其中激发波长为800nm，发射波长范围为420～480nm和500～600nm。

在800nm双光子激发下，如图1中a所示，探针在450nm(荧光团2)处有一个稳定强度的荧光发射，在550nm(荧光团1)有较高的荧光发射强度。如图1中b所示，随着·oh浓度增加，探针在450nm处的荧光强度几乎不变，550nm处的荧光强度在逐渐增强，这证明了探针的比率性质。如图1中c所示，探针对·oh具有高选择性，几乎不受其他ros和金属离子的干扰。以上实验结果证明，探针具有良好的光学性质，能够应用于活体实现对·oh的比率双光子荧光成像。

本发明的细胞定位效果。用10μm的探针和100nm的线粒体商业化染料(mito-trackerdeepred)共同孵育pc12细胞30min。随后用pbs溶液冲洗细胞，洗掉多余的探针，进行荧光成像。绿色通道是荧光的探针，激发波长405nm，发射波长范围500-600nm。红色通道是商业化染料，激发波长是633nm，发射波长范围650-750nm。如图2所示，绿色通道是探针的荧光，红色通道是商业化线粒体定位染料的荧光，最后一张是叠加图。以上实验结果证明探针能够定位于线粒体。

本发明在细胞中的实验。如图3所示，正常组使用10μm的探针孵育细胞30min，进行荧光成像。谷氨酸组先用10mm谷氨酸刺激pc12细胞10h，使细胞产生氧化应激，然后加入10μm的探针孵育细胞30min，进行荧光成像。甘露醇组是用10mm谷氨酸和10mm甘露醇共同孵育pc12细胞10h，然后加入10μm的探针孵育细胞30min，进行荧光成像。双光子激发波长为800nm，发射波长范围为420～480nm和500～600nm。

本发明发现与对照组相比，用谷氨酸刺激的细胞表现出强烈的绿色荧光(荧光团1)，而蓝色荧光(荧光团2)强度几乎不变，证明细胞中的·oh浓度上升。为了确定荧光变化是由氧化应激变化引起的，接下来，本发明用甘露醇(·oh的清除剂)处理用谷氨酸刺激过得细胞，甘露醇清除·oh后，绿色荧光强度明显降低而蓝色荧光强度不变，这说明·oh浓度降低。以上成像结果表明，该探针能够观察活细胞中·oh的浓度变化，且利用荧光团1的稳定荧光强度，可以减少背景的干扰。

本发明在活体中的实验。探针对抑郁症模型中小鼠脑部线粒体中·oh的双光子成像检测。抑郁模型(cums)参照文献(x.wang,p.li,q.ding,c.wu,w.zhangandb.tang,angewandtechemie(internationaled.inenglish),2019,131,4722-4726.)建立。成像前，先将小鼠麻醉，随后腹腔注射100ul100μm的探针。孵育30分钟后，进行脑部的双光子成像。如图4所示，本发明通过腹腔注射探针，对小鼠脑部进行成像，发现与对照组相比，抑郁小鼠的绿色荧光强度明显增强、蓝色荧光强度基本不变。说明，抑郁症的小鼠脑部线粒体内的·oh含量上升。通过以上实验，本发明首次通过荧光成像分析了抑郁小鼠脑内线粒体内·oh水平较正常小鼠有一定程度的升高。该结果为·oh水平和抑郁程度之间的正相关关系提供了直接证据。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。