本发明属于微生物检测
技术领域：
，尤其涉及一种应用于动物组织中核酸现场提取方法。
背景技术：
：从诊断到基因分型，核酸扩增在世界各地的实验室中已被证明是必不可少的。任何旨在扩增dna或rna的应用中的第一步都是从复杂的生物样品中提取核酸，尤其涉及动物组织中核酸的提取；传统上，这项任务需要专门的设备(如离心机、金属浴、磁力架等)，训练有素的技术人员以及多个液体处理步骤。当前核酸分离方法的这种复杂性限制了现阶段实验室环境之外许多dna扩增技术的使用。由于对更简单、更快速的核酸纯化方法的需求，目前有关核酸提取的商品化试剂盒层出不穷。这些试剂盒中的绝大多数是基于在离液盐存在下核酸与固体二氧化硅支持物的结合；然后，通过一系列洗涤和离心步骤除去污染物，最后在低盐溶液中从二氧化硅洗脱核酸。此外，具有多种旨在捕获和纯化核酸的功能化修饰表面化学物质的超顺磁性氧化硅纳米磁珠也已商业化。磁珠法核酸提取的操作步骤主要包括裂解、结合、洗涤、分离四部分，提取时使用磁力架(或磁铁)将磁珠吸引并固定在试管的侧面，以便在洗涤和洗脱步骤中去除上清液，从而摆脱了对离心机的需要。即使基于磁珠法的核酸纯化相对较快(约20分钟)并且不需要电气设备，但对于在现代实验室环境之外进行的应用(如基于采样现场或附近即刻进行分析)，它仍然过于复杂。本课题组前期基于cards,whatmantm(gehealthcare,usa)生产的核酸现场提取试剂盒可用于对虾组织核酸的快速提取，整个过程只需10-20分钟，中途无需过柱离心等烦琐步骤，通过直接从核酸吸附材料中扩增核酸而消除了对单独的核酸洗脱步骤的需要。然而，尽管省去了洗脱步骤，但核酸吸附材料需要经70-95℃变性5分钟处理，不但增加了提取时间，而且需要加热设备(如，恒温金属浴)；此外，在用于实时荧光检测实验中，反应管中的核酸吸附材料会影响荧光值的读取，这些再次限制了这一方法在现场检测中的应用。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是现有的无论是磁珠法核酸提取还是核酸现场提取试剂盒都存在或是操作复杂，或是提取时间长、需要加热等问题，不能满足对更简单、更快速的核酸纯化方法的需求。为了解决这些问题，我们提供了一种应用于动物组织中核酸现场提取方法，该方法不需要任何复杂的制造或专门的设备(例如移液器、离心机或金属浴等)，可在1～3分钟提取出与标准的商业化核酸提取试剂盒无显著差异的质量浓度核酸；所得的核酸可直接用于lamp、pcr、rt-pcr、qrt-pcr等不同的分子诊断和检测实验。为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种应用于动物组织中核酸现场提取方法，其中的组织裂解采用的提取试剂为semp液、3m醋酸钠、3～8m异硫氰酸胍和的混合液，体积比为4:1:4:2；漂洗和洗脱时采用核酸吸附材料作为载体。semp液作为样品保存液，可防止样品核酸的降解；3m醋酸钠在核酸提取中，可调节盐离子的浓度，中和核酸分子的负电荷，便于加入乙醇后使dna沉淀下来；异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质,主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放，提取rna和dna；试剂是一种完全的即用型试剂，可用于提取高质量的总rna或者从各种生物样本中同时提取rna、dna和蛋白质。这种酚和异硫氰酸胍单相溶液，可用于提取人、动物、植物、酵母或细菌来源的细胞和组织样本中的纯rna、dna和蛋白质。体积比的限定是根据实施例1中不同比例的提取筛选得到的最优体积比。进一步的，所述semp液的组成为1mtris·hcl(ph8.0)、700mmedta、10％sds、巯基乙醇、平衡酚和双蒸水，体积比为1:10:10:1:20:58，ph为8.0。tris·hcl是缓冲液；edta是二价阳离子的螯合剂，能抑制酶的活性，ph调至8时才能够完全溶解；sds可以迅速破坏组织结构，抑制rnase和脱氧核糖核苷酶(dnase)活性，所以sds也是核酸纯化试剂的关键组分，通常使用10％或者20％的sds储备液，sds的工作浓度是0.1-0.5％；巯基乙醇的主要作用是破坏rnase蛋白质中的二硫键；平衡酚适用于分离dna和rna。具体包括以下步骤：(1)组织裂解：取适量组织样品(约0.05-0.1g)与提取试剂按一定比例加入至1.5mlep管(无菌无酶)中采用研磨棒研磨30～90秒；(2)一次漂洗：取采样用核酸吸附材料(直径2～3mm)加入至上述组织研磨管中，用牙签搅动核酸吸附材料使其充分润湿后，挑取至新的1.5mlep管中，加入100～500μl95％乙醇，更换新牙签轻轻搅动5～15秒；(3)二次漂洗：更换新牙签将上述采样用核酸吸附材料转移到新的1.5mlep管中，加入100～500μl70％～80％乙醇，搅动核酸吸附材料10～30秒，挑取至滤纸条吸干再适当晾干(约5～15秒)；(4)洗脱核酸：更换新牙签挑取核酸吸附材料至新的0.2mlep管中，加入10～20μl双蒸水，手指弹动管底10～30秒；溶液即为组织核酸。进一步的，步骤(1)中样本与提取试剂的质量体积(g/ml)比为5:1～5。进一步的，所述采样用核酸吸附材料为whatmantmqualitativefilterpaper:grade1circles(gehealthcare,usa)经打孔器制作成直径2～3mm，能够有效吸附样品裂解液中的核酸。本发明进一步提供一种动物组织核酸快速提取试剂盒，包括组分如下表1所示：表1动物组织核酸快速提取试剂盒组分编号名称数量备注1采样用核酸吸附材料4个2样品采集管4个4至-20℃保存3漂洗管a(红盖)4个4漂洗管b(蓝盖)4个5核酸洗脱管4个6研磨棒4个7牙签1包(20支)8吸管4个9手术刀片1个10滤纸条4条11说明书1份进一步的，所述表中样品采集管内预装30～50μl提取试剂；漂洗管a中预装100～500μl95％乙醇；漂洗管b中预装100～500μl70％～80％乙醇；核酸洗脱管中预装10～20μl双蒸水。进一步的，所述动物组织核酸快速提取试剂盒的提取量为4个样本使用量，即4t，样本量可以扩大到8t，16t，32t。与现有技术相比，本发明具有以下优势：(1)简单、便携：整个提取过程既不需要吸取液体，也不需要离心，更不需要温浴，完全做到了无设备，而且试剂盒中的所有试管均预装试剂，极大简化了操作复杂性，非常适用于核酸现场快速检测中。这其中，首先是裂解液能够高效稳定的使样品中的核酸释放出来，进而被核酸吸附材料高效吸附，配合最优的洗涤条件，从而实现了不需吸取液体，也不需要离心，更不需要温浴的核酸提取技术。(2)快速、准确：既往的核酸提取技术基本都需要温浴、清洗、离心等步骤，耗时约40分钟～2小时，本发明1～3分钟就能完成核酸提取，且通过与商品化试剂盒提取核酸对比分析发现，本发明提取核酸后的检测灵敏度与之相当。(3)成本非常低：包括有形成本(试剂盒成本)和无形成本(时间成本和设备成本)都明显低于现有的提取方法。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，均采用分析纯试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为灭菌、失活降解酶的去离子水配置。采样用核酸吸附材料：whatmantmqualitativefilterpaper:grade1circles购自美国gehealthcare公司，经打孔器制作成直径2～3mm。700mmedta：将260.4gna2edta·2h2o溶于800ml双蒸水，用10mnaoh调节ph至8左右可助溶，完全溶解后，加双蒸水至1000ml。10％sds：将100gsds溶解于双蒸水至1000ml，使用前溶液如果结晶，可在微波炉中略微加热使之溶解。平衡酚：将苯酚重蒸馏，冷却后加入双蒸水至饱和并形成等体积水相，加入1/100总体积的1mtris·hcl(ph8.0)，用浓盐酸调节混合物的ph至8.0；分装后，在-20℃保存。核酸提取试剂配制：分别取1mtris·hcl(ph8.0)、700mmedta、10％sds、巯基乙醇、平衡酚和双蒸水，按体积比1:10:10:1:20:58配置适量semp液，调ph到8.0。然后，将semp液、3m醋酸钠、3～8m异硫氰酸胍和trizol，按体积比为4:1:4:2配置核酸提取试剂。动物组织核酸快速提取试剂盒的组装：包括盒体、盒体内的试剂和耗材，说明书。盒体内的试剂分别为预装30～50μl核酸提取试剂的样品采集管、预装100～500μl95％乙醇的漂洗管a、预装100～500μl70％～80％乙醇的漂洗管b和预装10～20μl双蒸水核酸洗脱管；盒体内的耗材分别为采样用核酸吸附材料、研磨棒、牙签、滤纸条以及备用的定量吸管和手术刀片。实施例1：核酸提取试剂配方和提取方法的筛选本发明的核酸提取试剂配方和方法是经过筛选获得的，以感染致急性肝胰腺坏死弧菌(vahpnd)的对虾组织为例，对虾组织中核酸提取步骤如下：步骤(1)：取适量(约0.1g)感染组织加入含50μl提取试剂(不同成分配比见表2)的1.5mlep管(无菌无酶)中采用研磨棒充分研磨(约30～90秒)后，取核酸吸附材料浸入研磨液中，搅动使其充分吸收；步骤(2)：用牙签挑取核酸吸附材料至新的1.5mlep管中，加入200μl70％乙醇，搅动核酸吸附材料10～30秒，挑取至滤纸条吸干再适当晾干(约5～15秒)；步骤(3)：更换新牙签挑取核酸吸附材料至新的0.2mlep管中，加入10～20μl双蒸水，手指弹动管底10～30秒；溶液即为组织核酸；步骤(4)：等量取步骤(3)中的核酸作为模板，采用检测vahpnd的tagman探针实时荧光定量pcr法(qrt-pcr)进行检测，均重复3次；根据检测结果筛选出核酸提取试剂最优的比例。表2不同比列核酸提取液对组织核酸提取及检测结果(vahpnd)vahpnd基因结果显示：经荧光定量和等温扩增检测，结果均为阴性。260/280比值均低于1.80，分析原因可能是核酸吸附材料漂洗不充分，核酸提取试剂残留影响检测结果。因此，在原有试验方案的基础上增加一步95％乙醇洗涤，实验结果见表3：表3不同比列核酸提取液对组织核酸提取及检测结果(vahpnd)vahpnd基因检测结果显示：采用样品3的提取试剂组分，一步95％乙醇洗涤+一步70％乙醇洗涤为最优提取方式。试验进一步以rna病原(引起铁虾的iptv基因)为例考察上述提取方法的准确性，已知样品20190722001-20190722006为弱阳性，20190723001-20190723006为阴性。试验结果见表4：表4组织核酸提取及检测结果(iptv基因)样品conc.(ng/μl)260/280qrt-pcr(ct值)2019072200177.3±13.71.76±0.0933.60±1.322019072200220.6±10.21.80±0.1330.97±2.1020190722003111.0±15.61.62±0.0831.54±1.872019072200420.9±13.81.78±0.0732.93±1.562019072200523.2±11.71.84±0.0528.9±1.432019012200651.6±8.51.82±0.0429.6±1.922019072300184.5±18.81.80±0.05-2019072300249.4±5.21.65±0.10-2019072300371.8±10.01.80±0.02-2019072300439.9±9.11.62±0.06-2019072300557.9±8.31.68±0.08-2019072300615.5±5.42.04±0.09-检测结果显示：通过筛选的最优核酸提取试剂配方和方法，采用qrt-pcr检测符合率为100％。实施例2：本发明提供的动物组织核酸快速提取试剂盒与商品化组织核酸提取试剂盒的提取效果对比分析分别以感染vahpnd和iptv为对虾组织为研究对象，商品化组织核酸提取试剂盒分别选用天根生化科技(北京)有限公司的海洋动物组织基因组dna提取试剂盒(dp324)和动物组织总rna提取试剂盒(dp431)，按照试剂盒说明书进行组织核酸(dna和rna)的提取。本发明提供的动物组织核酸快速提取试剂盒提取步骤如下：步骤(1)：取适量(约0.05g)感染组织加入含20μl提取试剂的样品采集管中采用研磨棒充分研磨(约30～60秒)后，取采样用核酸吸附材料浸入研磨液中，搅动使其充分吸收(约10～30秒)；步骤(2)：用牙签挑取核酸吸附材料至漂洗管a中，轻柔搅动核酸吸附材料5～15秒；更换新牙签挑取核酸吸附材料至漂洗管b中，搅动核酸吸附材料10～30秒，挑取至滤纸条吸干再适当晾干(约5～15秒)；步骤(3)：更换新牙签挑取核酸吸附材料至核酸洗脱管中，手指弹动管底10～30秒；溶液即为组织核酸；步骤(4)：等量取步骤(3)中的核酸作为模板，采用检测vahpnd和iptv的tagman探针实时荧光定量pcr法(qrt-pcr)进行检测，均重复3次。检测结果见表5、表6。表5组织核酸提取试剂盒的提取效果对比分析(vahpnd)注：1-6为感染副溶血弧菌的对虾组织；7、9、11是将107copies/μl的dna10μl加到模拟样品的定量虾组织；8、10、12是模拟样品的定量虾组织。p＞0.05表示差异不显著，p＜0.05表示差异显著。表6组织核酸提取试剂盒的提取效果对比分析(iptv)注：1-6为铁虾组织；7、9、11是将107copies/μl的rna10μl加到模拟样品的定量虾组织；8、10、12是模拟样品的定量虾组织。p＞0.05表示差异不显著，p＜0.05表示差异显著。本实施例是从检测灵敏度和回收率两方面对比分析本发明提供的动物组织核酸快速提取试剂盒与商品化组织核酸提取试剂盒的提取效果，检测结果表明二者的提取效果无显著差异。由上述实施例可知，本发明提供了一种应用于动物组织中核酸现场提取方法及其配套提取试剂盒，利用该检测方法具有简便、快速、低成本、精确、无需特殊仪器等特点，可应用于各类病原组织核酸的现场快速提取与即时检测。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。当前第1页12