粗多糖及其制备工艺、保健口服液及其制备方法与流程

本发明属于生物制药技术领域，特别是涉及一种粗多糖及其制备工艺、保健口服液及其制备方法。

背景技术：

现在社会中高压白领阶层、频繁出差的工作人员、运动量大易疲劳的运动选手以及时刻准备迎考的学生人群等，普遍存在体质下降、慢性病多发的现象，处于健康与疾病之间的过渡状态，即“第三状态”－亚健康状态，但目前尚未彻底明确导致亚健康的真正原因，缺乏针对性的治疗措施，所以开发增强免疫力的保健食品，具有广阔的市场空间，适应当前人们生活和工作的需要，具有较高的实际应用价值。

液体发酵技术是将营养物质溶解在液体中作为培养基，然后接入菌种、通过培养得到目的产物的过程，液体发酵的规模大、产量高，可以进行工业化连续生产，生产效率高，是当前微生物发酵工业的主要方式。

液体发酵技术于20世纪40年代应用于保健食品，于20世纪80年代应用于中药研究，将中药材与辅料搅拌，置于一定温度和湿度下，通过微生物的发酵达到改变中药药性、提高药效、降低毒副作用、扩大用药品种等目的，随着微生物研究的深入以及分离技术和结构鉴定技术的不断发展，通过对中药进行液体培养，能够大量增殖菌丝或孢子，还可在发酵液中得到多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、酶、核酸、氨基酸等多种具有生理活性的物质，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老及提高免疫力等功效，将发酵技术应用于药食共有资源，可制得集营养与保健功能于一体的新型食品。

综上所述，液体发酵技术在保健食品的研究方面尚处于起步阶段，不可避免地存在一些问题，特别在药物毒性药理方面的研究较少，发酵后其化学成分的变化及发酵产物药效学评价的相关研究方法学标准也没有建立，严重影响着中药液体发酵技术的发展，液体发酵技术通过微生物作用可将药物降解成小分子活性物质，其更易于通过血脑屏障与人体细胞蛋白结合，可被直接利用，具有在人体中吸收较快、较完全，效果较好等优势。

蝙蝠蛾拟青霉（paeilyeshepiali)经深层发酵所得的干菌丝具有与冬虫夏草相似的有效成分和药理作用，临床验证了其药用价值，是我国卫生部公布较早的可用于保健食品生产的两种虫草类真菌之一，其菌丝粉已有大量产品面市，该菌种具有发酵周期短，生产工艺较简单的特点；从菌丝粉中获得的多糖具有重要生物活性，在对人类一些疑难病症的治疗方面显示出很好的疗效；多糖及其衍生物具有多种生物学功能（如细胞特异性识别，细胞表面对各种抗原和药物的受体，激活免疫细胞等），多糖具有多方面的药理作用，如降血压、降血脂、健胃保肝、抗氧化、延缓衰老、提高免疫、缓解疲劳等，是目前药用真菌研究的热点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种粗多糖制备工艺，通过优化蝙蝠蛾拟青霉的培养基组成和培养条件，使用人参粉末制备培养基对蝙蝠蛾拟青霉进行液体深层发酵，制得营养成分丰富的发酵液，进而分离得到粗多糖，该制备过程操作简单、易控制，制备的菌丝体中粗多糖含量高，可用于工业连续化生产。

本发明的目的还在于提供一种粗多糖，该粗多糖中的营养成分种类较多，且各成分含量较高，具有抗衰老、提高免疫力的功效。

本发明的目的还在于提供一种保健口服液，保健口服液口感微甜、略有苦涩味，能够舒缓疲劳、提高免疫力。

本发明的目的还在于提供一种保健口服液的制备方法，通过对原料进行提纯、混合等处理，极大限度地保留了原料的营养价值，制得的成品口感丰富，营养价值高。

本发明所采用的技术方案是，粗多糖制备工艺包括以下步骤：

步骤1，配置发酵培养基，使用发酵培养基在恒温摇床上对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行活化培养，活化培养过程中发酵培养基的ph值为5.5～7.5，培养温度为22℃～28℃，摇床的转速为120rpm～180rpm；

发酵培养基中各物质的质量浓度如下：葡萄糖10g/l、酵母浸粉5g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、znso4·7h2o50mg/l、维生素b110mg/l；

步骤2，采用亚硝基胍溶液诱导活化的蝙蝠蛾拟青霉菌种发生突变，使用接种针将突变菌种逐一接种到250ml锥形瓶中，在26℃、转速为150rpm的恒温摇床中培养48h，获得突变蝙蝠蛾拟青霉菌种，然后进行连续传代培养；

步骤3，配置添加有人参粉末的液体深层发酵培养基，对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，液体深层发酵培养时培养温度为22℃～28℃，摇床的转速为120rpm～180rpm；

步骤4，在步骤3的基础上，对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行补料分批发酵放大培养获得蝙蝠蛾拟青霉发酵液，放大培养时蝙蝠蛾拟青霉菌种的接种量为培养基体积的7%，培养基的ph值为7.0，放大培养时培养温度为22℃～28℃，摇床的转速为120rpm～180rpm；

步骤5，使用转速为4000rpm的离心机处理蝙蝠蛾拟青霉发酵液15min后获得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体，将菌丝体煮沸、浓缩，使用乙醇沉淀法提取菌丝体中的粗多糖。

进一步的，所述步骤1活化培养时培养基的ph值为6.0，培养温度为25℃，转速为150rpm。

进一步的，所述步骤2中传代培养的种子培养基由各物质按照以下质量百分数配制而成：3%葡萄糖、2%酵母膏、0.2%硫酸镁、0.1%磷酸氢二钾，0.2%磷酸二氢钾和0.03%氯化钙，余量为水，种子培养基的ph值为6.0，酵母膏中的总氮含量≥9%。

进一步的，所述步骤3中液体深层发酵培养基中各物质的质量浓度如下：玉米淀粉40g/l、葡萄糖5g/l、玉米浆25g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾1g/l、硫酸锌1.5g/l、维生素b125mg/l，培养基的ph值为7.0，液体深层发酵培养基中人参粉末添加质量与发酵培养基体积的比为1：50。

进一步的，所述步骤5中粗多糖的提取过程如下：

步骤51，称取200g蝙蝠蛾拟青霉菌丝体置于500ml三角瓶中，向三角瓶中加入300ml蒸馏水和0.3g胃蛋白酶，将三角瓶置于往复式调速摇床中提取3h，摇床的转速为170rpm、温度为55℃；

步骤52，将三角瓶置于100℃的水浴锅中加热3h后自然冷却至室温，然后置于4℃冰箱冷藏过夜；

步骤53，将过夜的三角瓶置于转速为4000rpm的离心机内离心20min，弃去残渣获得上清液；

步骤54，将上清液转移至200ml的容量瓶中加蒸馏水定容，再将定容的上清液转移至1000ml的烧杯中，加入体积为上清液体积4倍的无水乙醇混合均匀，置于4℃冷藏室过夜；

步骤55，将过夜溶液置于转速为4000rpm的离心机内离心20min，弃去上清液获得粗多糖醇沉产物；

步骤56，将粗多糖醇沉产物置于60℃的干燥箱中烘干至恒重，获得粗多糖。

粗多糖制备工艺制备获得的粗多糖。

保健口服液由以下体积百分数的各原料制备而成：粗多糖9%、牛磺酸0.35%、蜂蜜4.0%、维生素b10.1%、维生素b20.1%、维生素b60.05%、维生素c0.1%、苯甲酸钠0.04%及柠檬酸0.15%，余量为水。

保健口服液的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，按照以下体积百分数量取各原料：粗多糖9%、牛磺酸0.35%、蜂蜜4.0%、维生素b10.1%、维生素b20.1%、维生素b60.05%、维生素c0.1%、苯甲酸钠0.04%及柠檬酸0.15%，余量的水；

步骤2，将粗多糖升温至30℃溶解后，在0.2mpa的压力下使用孔径为0.6µm的滤网精滤得到粗多糖提取母液；

步骤3，将粗多糖提取母液、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c、苯甲酸钠及柠檬酸倒入配料罐中混合均匀；

步骤4，加入牛磺酸，充分搅拌、混合；

步骤5，加热煮沸灭菌30min，待溶液冷却后，加入蜂蜜充分搅拌、混合；

步骤6，加入纯化水至配液量，使用孔径为0.45µm的滤网过滤；

步骤7，使用摩尔浓度均为0.1mol/l的hcl溶液和naoh溶液调节配液的ph值为5.0～6.0，配液的相对密度为1.15～1.25kg/cm³；

步骤8，将配液输送至灌轧工序进行灌装、密封制得保健口服液。

本发明的有益效果是：1、本发明通过优化蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的培养基组成和培养条件，并将人参粉末加入培养液中对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，使得发酵液中的营养成分种类增多、含量提高，通过对发酵菌丝体进行处理获得粗多糖，粗多糖的制备过程简单易控制，可进行工业连续化生产，且发酵菌丝体内的粗多糖含量增高；2、本发明制备的粗多糖营养价值高，具有抗衰老、提高免疫力的功效；3、本发明用提取的粗多糖制备保健口服液，制备过程简单且极大限度的保留了原料的营养成分，制备的保健口服液口感酸甜、略有苦涩味，营养价值高，能舒缓疲劳，提高人体免疫力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是粗多糖的制备流程图。

图2是保健口服液的制备流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，粗多糖的制备方法包括以下步骤：

步骤1，配置发酵培养基，使用发酵培养基在恒温摇床上活化培养蝙蝠蛾拟青霉菌种，活化过程中发酵培养基的ph值为5.5～7.5，培养温度为22℃～28℃，摇床转速为120rpm～180rpm；

发酵培养基中各物质的质量浓度如下：葡萄糖10g/l、酵母浸粉5g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、znso4·7h2o50mg/l和维生素b110mg/l；

步骤2，采用亚硝基胍溶液诱导活化的蝙蝠蛾拟青霉菌种发生突变，使用接种针将突变菌种逐一接种到250ml锥形瓶中，在26℃、转速为150rpm的恒温摇床中培养48h，获得蝙蝠蛾拟青霉菌种，然后进行连续传代培养；

传代培养所用的种子培养基由各物质按照以下质量百分数配制而成：3%葡萄糖、2%酵母膏（总氮≥9%）、0.2%硫酸镁、0.1%磷酸氢二钾，0.2%磷酸二氢钾和0.03%氯化钙，余量为水，种子培养基的ph值为6.0；

步骤3，配置添加有人参粉末的液体深层发酵培养基，对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，液体深层发酵培养时培养温度为22℃～28℃，摇床转速为120rpm～180rpm；

发酵培养基中各物质的质量浓度如下：玉米淀粉40g/l、葡萄糖5g/l、玉米浆25g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾1g/l、硫酸锌1.5g/l、维生素b125mg/l，培养基的ph值为7.0，在液体深层发酵培养基中人参粉末添加质量与发酵培养基体积的比为1：50；

步骤4，在步骤3的基础上，对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行补料分批发酵放大培养获得蝙蝠蛾拟青霉发酵液，放大培养时蝙蝠蛾拟青霉菌种的接种量为培养基体积的7%，培养基的ph值为7.0，培养温度为22℃～28℃，摇床的转速为120rpm～180rpm；

步骤5，分离、提取蝙蝠蛾拟青霉发酵液中的粗多糖；

使用转速为4000rpm的离心机处理蝙蝠蛾拟青霉发酵液15min后获得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体，将菌丝体煮沸、浓缩，使用乙醇沉淀法提取菌丝体中的粗多糖。

步骤1中蝙蝠蛾拟青霉菌种活化培养时，发酵培养基的最适ph值为6.0，培养温度为25℃，转速为150rpm。

步骤2中采用亚硝基胍溶液诱导蝙蝠蛾拟青霉菌种突变的过程如下：

步骤21：取新鲜活化培养的蝙蝠蛾拟青霉菌种，使用ph值为6.0、摩尔浓度为0.1mol/l的磷酸缓冲液离心洗涤菌种，制成浓度为10⁶cfu/ml的蝙蝠蛾拟青霉菌悬液；

步骤22，配制亚硝基胍溶液；

由于亚硝基胍水溶性较差，所以先用少量的丙酮溶解亚硝基胍，然后在亚硝基胍丙酮溶液中加入磷酸缓冲溶液配置成亚硝基胍母液，其中磷酸缓冲溶液与亚硝基胍丙酮溶液的体积比为9：1，亚硝基胍母液中亚硝基胍的质量浓度为1mg/ml；

步骤23，在亚硝基胍母液中加入蝙蝠蛾拟青霉菌悬液制成诱变体系进行诱变处理，诱变体系中亚硝基胍的质量浓度为0.1～0.5mg/ml；

步骤24，诱变反应结束时使用生理盐水将诱变体系稀释至50倍，然后离心洗涤3次除去亚硝基胍母液；

步骤25，将突变的蝙蝠蛾拟青霉菌种接种至种子培养基中，冰水冷浴2h后，离心除去种子培养基，用无菌水悬浮菌种沉淀，并按照十倍浓度稀释法稀释沉淀悬浮液，将稀释的悬浮液涂布于马铃薯平面培养基于37℃下避光培养48h；

步骤26，将蝙蝠蛾拟青霉菌种转接至液体深层发酵培养基中进一步培养，使用苯酚硫酸法筛选出蝙蝠蛾拟青霉菌种中的粗多糖含量高的突变菌种，进行连续传代培养；

步骤5中粗多糖的提取过程如下：

步骤51，称取200g蝙蝠蛾拟青霉菌丝体置于500ml三角瓶中，向三角瓶中加入300ml蒸馏水和0.3g胃蛋白酶，将三角瓶置于往复式调速摇床中提取3h，摇床的转速为170rpm、温度为55℃；

胃蛋白酶能够除去蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中的蛋白，破坏胶体溶液的稳定性，降低菌丝体溶液的粘度，加速粗多糖的传质，提高粗多糖的提取率；

步骤52，将三角瓶置于100℃的水浴锅中水浴3h后自然冷却至室温，然后置于4℃冰箱冷藏过夜；

步骤53，将过夜的三角瓶置于转速为4000rpm的离心机内离心20min，弃去残渣获得上清液；

步骤54，将上清液转移至200ml的容量瓶中加蒸馏水定容，再将定容的上清液转移至1000ml的烧杯中，加入体积为上清液体积4倍的无水乙醇混合均匀，置于4℃冷藏室过夜；

步骤55，将过夜溶液置于转速为4000rpm的离心机内离心20min，弃去上清液获得粗多糖醇沉产物；

步骤56，将粗多糖醇沉产物置于60℃的干燥箱中烘干至恒重，获得粗多糖。

本发明以蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中粗多糖含量为观察目标，通过单因素实验确定碳源、氮源和人参全料的添加量，并以蝙蝠蛾拟青霉的原始工艺为对照，对发酵过程中的接种量、初始ph值、发酵温度和摇床转速进行考察，确定蝙蝠蛾拟青霉的最佳培养条件，本发明实施例培养的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中粗多糖的含量和得率较高，粗多糖中营养成分的含量提高，具有显著的抗疲劳、抗衰老和提高免疫力的效果。

本发明提取蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖时，加入人参粉末使得蝙蝠蛾拟青霉菌种发酵液中除含有粗多糖外，还含有稀有人参皂苷如rg3等，增加了菌丝体及粗多糖的产量，菌丝体生物量为25.9g/l，粗多糖得率和粗多糖含量分别为19.28%和50.34％。

保健口服液由以下体积百分数的各原料制备而成：粗多糖9%、牛磺酸0.35%、蜂蜜4.0%、维生素b10.1%、维生素b20.1%、维生素b60.05%、维生素c0.1%、苯甲酸钠0.04%及柠檬酸0.15%，余量为水。

保健口服液的制备方法如图2所示，包括以下步骤：

步骤1，按照如下体积百分数量取各物质：粗多糖9%、牛磺酸0.35%、蜂蜜4.0%、维生素b10.1%、维生素b20.1%、维生素b60.05%、维生素c0.1%、苯甲酸钠0.04%及柠檬酸0.15%，余量的水；

步骤2，将粗多糖升温至30℃溶解后，在0.2mpa的压力下使用孔径为0.6µm的滤网进行精滤提纯得到粗多糖提取母液；

步骤3，将粗多糖提取母液、维生素类液（维生素b1、维生素b2、维生素b6和维生素c）、苯甲酸钠及柠檬酸倒入配料罐中混合均匀；

步骤4，加入牛磺酸，充分搅拌、混合；

步骤5，加热煮沸灭菌30min，待溶液冷却后，加入蜂蜜充分搅拌、混合；

步骤6，加入纯化水至配液量，使用孔径为0.45µm的滤网过滤；

步骤7，使用摩尔浓度均为0.1mol/l的hcl溶液和naoh溶液调节配液的ph值为5.0～6.0，配液的相对密度为1.15～1.25kg/cm³；

步骤8，将配液输送至灌轧工序进行灌装、密封制得保健口服液。

本发明制备保健口服液时并未对各原料进行过多的处理，极大限度的保留了各原料中的营养成分，定期服用后能够改善亚健康人群的身体状况，舒缓疲劳、提高人体免疫力。

实施例1

步骤1，配置发酵培养基，使用发酵培养基在恒温摇床上活化培养蝙蝠蛾拟青霉菌种，活化过程中发酵培养基的ph值为6.0，培养温度为25℃，摇床转速为150rpm；

发酵培养基中各物质的质量浓度如下：葡萄糖10g/l、酵母浸粉5g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、znso4·7h2o50mg/l和维生素b110mg/l；

步骤2，采用亚硝基胍溶液诱导活化的蝙蝠蛾拟青霉菌种发生突变，使用接种针将突变菌种逐一接种到250ml锥形瓶中，在26℃、转速为150rpm的恒温摇床中培养48h，获得蝙蝠蛾拟青霉菌种，进行连续传代培养；

传代培养所用的种子培养基由各物质按照以下质量百分比配制而成：3%葡萄糖、2%酵母膏（总氮≥9%）、0.2%硫酸镁、0.1%磷酸氢二钾，0.2%磷酸二氢钾和0.03%氯化钙，余量为水，种子培养基的ph值为6.0；

步骤3，配置含有人参粉末的液体深层发酵培养基，液体深层发酵培养基中人参粉末添加质量与发酵培养基的体积比为1：50，利用液体深层发酵培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，液体深层发酵培养时培养温度为25℃，摇床转速为150rpm；

发酵培养基中各物质的质量浓度如下：玉米淀粉40g/l、葡萄糖5g/l、玉米浆25g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾1g/l、硫酸锌1.5g/l、维生素b125mg/l，培养基的ph值为7.0；

步骤4，在步骤3的基础上，对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行补料分批发酵放大培养获得蝙蝠蛾拟青霉发酵液，放大培养时蝙蝠蛾拟青霉菌种的接种量为培养基体积比的7%，培养基的ph值为7.0，培养温度为25℃，摇床转速为150rpm；

步骤5，分离、提取蝙蝠蛾拟青霉发酵液中的粗多糖；

使用转速为4000rpm的离心机处理发酵液15min后获得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体，将菌丝体加热煮沸、浓缩，使用乙醇沉淀法提取、分离菌丝体中的粗多糖。

实施例2

在实施例1其他培养条件不变的情况下，在液体深层发酵培养基中不添加人参粉末，对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵培养，提取获得粗多糖。

实施例3

将实施例1中活化培养、液体深层发酵培养和放大培养的培养条件修改为：ph值5.5、培养温度22℃、摇床转速120rpm。

实施例4

将实施例1中活化培养、液体深层发酵培养和放大培养的培养条件修改为：ph值7.5、培养温度28℃、摇床转速180rpm。

使用苯酚硫酸法分别检测实施例1～实施例4提取的粗多糖，检测结果显示实施例1制备的粗多糖含量达到50.34%，得率为19.28%，且实施例1制备的粗多糖中营养成分较为丰富，发酵后提取的粗多糖中人参皂苷rh2、ck、rg3等营养成分的含量增加，mrb1、mrb2等分子量大的人参皂苷含量显著降低，粗多糖的抗氧化能力和免疫力提高。

本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。