一种制备、分离和提取L-色氨酸的方法与流程

本发明属于l-色氨酸生产技术领域，具体涉及一种制备、分离和提取l-色氨酸的方法。

背景技术：

l-色氨酸的分子式为c11h12o2n2，分子量为204.21，含氮13.72%。l-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽、六角片状自色晶体，无臭，有甜味，在水中溶解度1.14g/l（25℃），溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。

l-色氨酸是人和动物生命活动中八大必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用，被称为第二必需氨基酸。在生物体内，从l-色氨酸出发可合成5一羟基色胺、吲哚乙酸、烟酸、色素、生物碱和辅酶等生物活性物质。在临床上主要用于医药，它在神经系统中的含量与神经的兴奋和抑制状态有关，从而促进睡眠和精神安定，用做保健食品和安神药。l-色氨酸也是一些植物蛋白中比较缺乏的氨基酸，用它强化食品和饲料添加剂对提高植物蛋白的利用率具有重要作用。它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。另外，l-色氨酸还有防霉、消毒以及阻止氧化的作用，可以作为鱼类保鲜剂。

近年来，l-色氨酸作为必需氨基酸，价格一直较高，在工业生产中常常会受到生产成本的制约，而在生产成本的构成中，生产、分离提取等成本占例权重最大。因此研究提高l-色氨酸生产和提取收率的方法具有重要的理论意义和实用价值。

技术实现要素：

申请人之前的专利技术“一种提高l-色氨酸生产效率的方法”对发酵工艺进行了优化，提高了发酵效率。在此基础上，申请人进一步进行了分离和提取，以获得高纯度高收率的l-色氨酸产品。

为解决上述问题，本发明提供了一种制备、分离和提取l-色氨酸的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一种制备、分离和提取l-色氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）陶瓷膜过滤，步骤3）色谱分离，步骤4）脱色，步骤5）浓缩蒸发，步骤6）离心、烘干。

具体地，所述方法包括如下步骤：

步骤1）发酵：以5-12%的接种量将产l-色氨酸的大肠杆菌种子液接入到装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度36-37℃，溶氧量为20-30%，通过数控自动流加氨水维持罐内系统ph在6.8-7.2，流加消泡剂消泡；总发酵时间为40-42h，得到发酵液；

步骤2）陶瓷膜过滤：将发酵液加热升温至50℃后，通过陶瓷膜过滤，收集过滤液，截留物经板框压滤、烘干得饲料蛋白粉；

步骤3）色谱分离：将步骤2）所得过滤液经顺序式模拟移动床色谱分离得到提取液，色谱分离过程产生废液统一打往肥料车间进行处理；

步骤4）脱色：色谱分离得到的提取液进入脱色罐进行脱色；

步骤5）浓缩蒸发：将步骤4）所得脱色液进入双效蒸发器，得到浓缩液；

步骤6）离心、烘干：将浓缩液结晶离心、烘干得到高纯度的l-色氨酸。

优选地，所述步骤1）发酵，还包括如下步骤：

当发酵至12h时，将营养液a流加进发酵罐内，直至发酵结束；

当发酵至24h时，将营养液b流加进罐内，直至发酵结束；

所述营养液a的组分包括六水合氯化钴；

营养液b的组分包括葡萄糖，吲哚，肌醇，苯丙氨酸以及酪氨酸。

优选地，所述步骤2）中，陶瓷膜的截留分子量为1万da，过滤温度50℃。

优选地，所述顺序式模拟移动床色谱的参数为：流量5m³/h，温度50℃，压差0.5mpa。

优选地，所述营养液a的组分包括六水合氯化钴和脲。

更优选地，所述营养液a的组分为：六水合氯化钴10-30mg/l，脲5-20g/l，其余为水。

更优选地，所述营养液b的组分为：葡萄糖100g/l，吲哚1g/l，肌醇0.5g/l，苯丙氨酸0.3-0.8g/l，酪氨酸0.2-0.7g/l，其余为水。

最优选地，所述营养液a的组分为：六水合氯化钴20mg/l，脲10g/l，其余为水。

最优选地，所述营养液b的组分为：葡萄糖100g/l，吲哚1g/l，肌醇0.5g/l，苯丙氨酸0.5g/l，酪氨酸0.4g/l，其余为水。

本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：

本发明从大肠杆菌合成芳香族氨基酸的通路出发，采用多种方式通过对代谢途径进行调节，相互协同，提高了色氨酸的产量和产酸速率；

本发明通过在发酵中期添加苯丙氨酸和酪氨酸，此时芳香族氨基酸的产量处于快速积累过程中，会对分枝酸向预苯酸转化产生反馈抑制作用，从而使得分枝酸更多地流向邻氨基苯甲酸途径，使得色氨酸产量提高；

与其他金属离子相比较，钴离子对dahp合成酶构象的影响更大，可作为酶的激活剂来使用，本研究发现，发酵初期添加钴离子对dahp合成酶的活性影响有限，并不能提高色氨酸的产量，可能是发酵初期，芳香族氨基酸合成途径并未启动，此时酶的分泌量也相对较少，选择在色氨酸大量合成的时间点来添加钴离子，能够有效色氨酸的产量。

在发酵初期添加脲，其主要作为无机氮源供菌株增殖使用，并不会对dahp合成酶的活性造成影响，而发酵至12h时，菌株增殖放缓，此时以合成代谢物为主，通过添加脲，能够提高dahp合成酶的活性，从而促进芳香族氨基酸合成途径的代谢流增大，进而促进色氨酸产量的增加。

本发明采用顺序式模拟移动床色谱技术提取l-色氨酸，与传统的三串联离子交换法相比，酸碱消耗与水耗大大降低，在生产的过程中交换介质树脂可以再生重复利用，生产过程节能环保，减少了环境的污染。

本发明在生产的过程中将产生的废液制成饲料蛋白粉和有机肥，整个生产过程没有污染物的排放，绿色环保。

本发明l-色氨酸料液经陶瓷膜过滤、顺序式模拟移动床色谱分离、脱色罐脱色等工序等环节，极大的去除了盐分和其它氨基酸，产品纯度与收率大幅上升。

说明书附图

图1：苯丙氨酸和酪氨酸对色氨酸产量的影响；

图2：苯丙氨酸和酪氨酸对发酵产酸速率的影响；

图3：六水合氯化钴浓度对色氨酸产量的影响；

图4：脲浓度对色氨酸产量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种提高l-色氨酸生产效率的方法，其包括如下步骤：

发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾9g/l，酵母膏5g/l，柠檬酸4.6g/l，硫酸铵1.8g/l，七水硫酸镁1.6g/l，氯化胆碱0.4g/l，七水硫酸亚铁65mg/l，生物素0.2mg/l；营养液a的组分为：六水合氯化钴20mg/l，脲10g/l；

营养液b的组分为：葡萄糖100g/l，吲哚1g/l，肌醇0.5g/l，苯丙氨酸0.5g/l,酪氨酸0.4g/l；

以大肠杆菌菌株e.colitrth为例，以8%的接种量将种子液（od600值为11.2）接入到装有600l发酵培养基的1000l发酵罐中，培养温度36.8℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统ph在7.0-7.2，流加消泡剂消泡；总发酵时间为42h，得到l-色氨酸发酵液。

当发酵至12h时，将营养液a流加进发酵罐内，按每l发酵液计，流加速度为0.01ml/min，直至发酵结束；

当发酵至24h时，将营养液b流加进罐内，维持罐内糖浓度为1g/l，直至发酵结束。

实施例2

一种提高l-色氨酸生产效率的方法，其包括如下步骤：

发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾9g/l，酵母膏5g/l，柠檬酸4.6g/l，硫酸铵1.8g/l，七水硫酸镁1.6g/l，氯化胆碱0.4g/l，七水硫酸亚铁65mg/l，生物素0.2mg/l；

营养液a的组分为：六水合氯化钴30mg/l，脲15g/l；

营养液b的组分为：葡萄糖100g/l，吲哚1g/l，肌醇0.5g/l，苯丙氨酸0.4g/l,酪氨酸0.3g/l；

以大肠杆菌菌株e.colitrth为例，以8%的接种量将种子液（od600值为11.8）接入到装有600l发酵培养基的1000l发酵罐中，培养温度36.8℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统ph在7.0-7.2，流加消泡剂消泡；总发酵时间为40h，得到l-色氨酸发酵液。

当发酵至12h时，将营养液a流加进发酵罐内，按每l发酵液计，流加速度为0.008ml/min，直至发酵结束；

当发酵至24h时，将营养液b流加进罐内，维持罐内糖浓度为1g/l，直至发酵结束。

对比例1

一种提高l-色氨酸生产效率的方法，其包括如下步骤：

发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾9g/l，酵母膏5g/l，柠檬酸4.6g/l，硫酸铵1.8g/l，七水硫酸镁1.6g/l，氯化胆碱0.4g/l，七水硫酸亚铁65mg/l，生物素0.2mg/l；

营养液的组分为：葡萄糖100g/l，吲哚1g/l，肌醇0.5g/l；

以大肠杆菌菌株e.colitrth为例，以8%的接种量将种子液（od600值为11.2）接入到装有600l发酵培养基的1000l发酵罐中，培养温度36.8℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统ph在7.0-7.2，流加消泡剂消泡；总发酵时间为42h，得到l-色氨酸发酵液。

当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为1g/l，直至发酵结束。

实施例3

一种分离和提取l-色氨酸的方法，其包括如下步骤：

1）以实施例1制备的发酵液为例；

2）将发酵液加热升温至50℃后，通过陶瓷膜过滤，截留分子量为1万da，过滤温度50℃，压力1.5mpa，过滤液进入提取工序，截留物经板框压滤、烘干得饲料蛋白粉。

3）将步骤2）所得过滤液经顺序式模拟移动床色谱分离得到提取液，顺序式模拟移动床色谱控制参数：流量5m³/h，温度50℃，压差0.5mpa；经色谱分离过程进入脱色工序中，色谱分离过程产生废液统一打往肥料车间进行处理。

4）色谱分离后的提取液进入脱色工序，开始用脱色罐回流脱色液至清晰为止，待滤液透光率达到50%后，清液入清液暂存罐待用。

5）将步骤4）所得清液进入双效蒸发器，浓缩3倍，得到浓缩液。

6）将浓缩液结晶离心、烘干后的得到高纯度的l-色氨酸。

经测定l-色氨酸指标：

l-色氨酸含量：99.4%比旋度[α]：-31.3

ph值：6.5干燥失重：0.3

粗灰分：0.4

实施例4

在已有研究成果对比文件1的基础上进行研究。

验证苯丙氨酸和酪氨酸对色氨酸产量和发酵产酸速率的影响，方式1：在发酵培养基中添加苯丙氨酸0.5g/l,酪氨酸0.4g/l；方式2：在营养液中添加苯丙氨酸0.5g/l,酪氨酸0.4g/l；如图1所示，方式2选择在营养液中添加苯丙氨酸和酪氨酸，色氨酸产量和发酵产酸速率均高于方式1，该营养液是在发酵中期添加，此时，芳香族氨基酸的产量处于快速积累过程中，此时添加苯丙氨酸和酪氨酸，会对分枝酸向预苯酸转化产生反馈抑制作用，从而使得分枝酸更多地流向邻氨基苯甲酸途径，使得色氨酸产量提高；而方式1在发酵培养基中添加，发酵初期芳香族氨基酸的积累较少，苯丙氨酸和酪氨酸对分枝酸向预苯酸转化的反馈抑制并未启动，此时添加苯丙氨酸和酪氨酸会被菌体细胞吸收利用，对色氨酸合成的正向调节效果并不佳。

在上述研究的基础上，选择在营养液b中添加苯丙氨酸和酪氨酸；进一步探讨六水合氯化钴对色氨酸产量的影响；钴离子能够影响dahp合成酶的构象，作为酶的激活剂来使用，本研究发现，发酵初期添加钴离子对dahp合成酶的活性影响有限，并不能提高色氨酸的产量，可能是发酵初期，芳香族氨基酸合成途径并未启动，此时酶的分泌量也相对较少；因此，我们选择在色氨酸大量合成的时间点来添加钴离子，考虑到过大量营养液的添加会对发酵液造成稀释作用，设定每l发酵液计，流加速度为0.01ml/min较为合适，在该流速下，设置浓度分别为1,2.5,5,10,20,30,40,60,80（mg/l）；如图3所示，随着六水合氯化钴浓度的增加，色氨酸产量也所有提高，20-30mg/l时对色氨酸影响最大，继续增大浓度并没有明显改变，当浓度为60mg/l以上后，色氨酸产量反而有所下降，过大量的钴离子可能对菌株生长造成抑制。

选择六水合氯化钴的浓度为20mg/l，添加时机为发酵至12h时，按每l发酵液计，流加速度为0.01ml/min；验证脲添加时机和添加浓度对色氨酸产量的影响，申请人尝试在发酵培养基中添加脲，对色氨酸产量没有影响，发酵初期添加脲，其主要作为无机氮源供菌株增殖使用，并不会对dahp合成酶的活性造成影响，而发酵至12h时，菌株增殖放缓，此时以合成代谢物为主，通过添加脲，能够提高dahp合成酶的活性，从而促进芳香族氨基酸合成途径的代谢流增大，进而促进色氨酸产量的增加，设置脲的浓度分别为1,5,10,15,20,25,30（g/l）；如图4所示，随着脲浓度的增加，色氨酸产量也所有提高，当增大10g/l后，增幅放缓，然后趋于平稳。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。