本发明属于作物抗病性鉴定
技术领域：
，具体涉及一种辣椒白绢病抗病性鉴定方法。
背景技术：
：辣椒白绢病是辣椒生产过程中发生的土传性病害，病原菌为齐整小核菌(sclerotiumrolfsiisacc.)，其症状为：茎基部着生白色绢丝状菌丝，呈辐射状扩散，湿度大的时候，地上和茎基部更加明显，发生后期，茎基部产生大量褐色油菜籽样小菌核。近年来，由于气候变化异常、连作、主栽品种退化等因素的共同影响，辣椒白绢病已经成为长江中下游地区辣椒生产过程中的主要流行性病害，给辣椒生产和产业造成了重大经济损失。防治白绢病主要采用化学农药等方法，但该方法防治效果不理想，并且一旦发现病状再防治，则收效甚微。而种植抗病品种是防治辣椒白绢病最有效的绿色、环保手段。抗病品种的培育需要利用有效的抗病性鉴定方法进行抗性材料的筛选、评价和鉴定。目前，辣椒白绢病及其抗病性鉴定尚未有系统性的研究和报道，缺乏相应对的行业标准和地方标准，导致白绢病的抗病性鉴定异常困难，抗病品种的培育进度滞后于病害发生发展速度。而生产中对辣椒白绢病的抗性鉴定以田间鉴定为主，主要方法为将不同辣椒品种种植在一定范围的田间里，在生产过程中采用目测法调查发病率，这种方法受环境条件和气候条件的限制，不准确、不精准，随意性强，不适合作为辣椒白绢病抗性的技术标准。因此，建立辣椒白绢病的抗病性鉴定方法显得尤为必要和迫切。技术实现要素：针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种辣椒白绢病抗病性鉴定方法，能够快速、准确地对育种材料进行辣椒白绢病抗病性鉴定，有利于抗病品种的培育筛选。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种辣椒白绢病抗病性鉴定方法，包括以下步骤：(1)活化并培养辣椒白绢病菌，制备病原菌接种菌条；(2)在灭菌基质中播种，培育接种用辣椒苗，采用菌条包埋法进行接种，辣椒苗的接种部位为距辣椒茎基部1cm处；(3)接种后进行日常管理，6d后记录各植株的病级数并计算病情指数，评价辣椒品种对辣椒白绢病的抗病性；其中，所述步骤(1)的具体过程为：从采集的病苗上用消毒镊子挑取菌丝或菌核接种于pda培养基中，于28℃暗培养4-5d，选择无杂菌污染、生长状况良好的菌落，挑取白绢病菌菌丝或菌核接入新的pda培养基中，然后置入28℃的培养箱中暗培养4-5天，重复3-4次直至无杂菌污染；使用前挑取菌核或菌丝块移至装有pda培养基的无菌培养皿中央，于28℃进行活化5d，将培养5d的pda培养基用0.3mm×0.5mm的打孔器打孔，制作成接种用的白绢病菌菌条待用。进一步地，所述步骤(2)中育苗基质于121℃蒸汽灭菌30min。进一步地，所述步骤(2)中待鉴定辣椒种子用84消毒液浸种6-10min，灭菌水冲洗后28℃温箱催芽，后播种于育苗钵内。进一步地，所述步骤(2)中育苗温度为22-28℃。进一步地，所述步骤(2)中菌条包埋法具体为：将菌条置于距辣椒茎基部1cm处，覆盖0.2-0.5mm育苗基质，接种后浇水至育苗基质湿度饱和。进一步地，所述步骤(2)中辣椒苗的接种时期为6-8片真叶完全展平期。进一步地，所述步骤(3)中接种后日常管理具体为：辣椒苗先暗培养12h，后16h/8h白天黑夜交替，温度白天28℃±2℃，黑夜22℃±2℃，接种期间保持育苗基质水分含量接近饱和。进一步地，所述步骤(3)中病级数按如下病害分级标准判断：0级：全株无症状；1级：茎基部轻微变色，部分叶片萎蔫；3级：茎基部超过二分之一变褐色，半数叶片萎蔫；5级：茎基部形成褐色圈，全株叶片萎蔫；7级：整株萎蔫枯死。进一步地，所述步骤(3)中病情指数的计算公式为：病情指数＝σ(病级值×相应病株数)/(调查总株数×最高病级值)×100；进一步地，所述步骤(3)中抗病性的评价标准为：按病情指数(di)：di＝0，免疫；0＜di≤10％，高抗；10％＜di≤30％，抗病；30％＜di≤50％，中抗；50％＜di≤70％，感病；di＞70％，高感。调查完毕后，只有当感病对照材料达到其相应感病程度(di＞50)时，该批次的抗白绢病鉴定认定为有效。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明首次提出了一种辣椒白绢病抗性鉴定方法，本发明的接种方法操作简便，鉴定结果准确可靠，病情判别灵敏度高，不易受环境和气候因素影响，接种后发病均匀、结果稳定性好，可操作性强，有利于提高抗病材料的筛选效率。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中所使用的材料均可自常规途径购买得到。实施例1病原菌的分离和鉴定辣椒白绢病菌株(sclerotiumrolfsiisacc.)是由湖南省长沙市湖南省蔬菜研究所科研示范园辣椒种植基地中采集到的具有典型白绢病症状的发病植株上分离纯化得到的，其症状为：茎基部着生白色绢丝状菌丝，呈辐射状扩散，湿度大的时候，地上和茎基部更加明显，发生后期，茎基部产生大量褐色油菜籽样小菌核。其纯化过程为：从采集的病株上用消毒镊子将菌丝(hypha，h)挑出置入pda培养基中间，同时将菌核(sclerotium，s)挑出置入pda培养基中间，菌丝和菌核菌各制备5皿。将挑好菌丝核菌核的培养皿放入28℃的培养箱中暗培养4-5天，观察菌丝核菌核生长情况。将无杂菌污染、生长状况良好的菌丝和菌核各挑取一皿，采用5mm打孔器打孔，制作成菌饼，将菌饼移入新的pda培养基中后置入28℃的培养箱中暗培养4-5天，观察菌丝生长情况，如此重复3-4次，直至无杂菌污染，最终得到分离纯化的菌丝-h和菌核-s菌株各1株。采用聚合美生物科技有限公司的m5fungalgenomicdnakti，提取经纯化后的菌株h和s基因组各一个。以提取的菌株h和s基因组为模板，以真菌18srdna通用引物nu-0817(5’-tagcatggaataatagaatagga-3’)和nu-1536(attgcaatgctctatcccca-3’)为扩增引物，进行pcr扩增。pcr反应体系为：上下游引物各1μl，dna模板1μl，10×easytaqbuffer2μl，2.5mmdntps2μl，easytaqdnapolymerase0.25μl，加ddh2o至20μl。pcr反应参数为：94℃变性5min；随后95℃30sec，58℃30sec，72℃40sec，30循环，随后72℃延伸5min。将扩增的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当条带范围为650-750bp时，说明扩增结果符合预期。随后将条带在这一范围内的pcr扩增产物送测序公司测序。为保证测序结果的准确性，每个产物分别用上下游引物进行测序。将上下游测序结果进行拼接，选择完全重复区域，pcr产物测序结果为菌丝培养物h和菌核培养物s序列结果一致，大小均为682bp。将测序获得的682bp序列在ncbi网站的blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中进行比对，结果发现扩增获得的菌株与atheliarolfsii18srrna(genebanknumber:ay665774.1和jf819726.1)基因序列100％一致。atheliarolfsii中文名为罗氏阿太菌，罗氏阿太菌是半知菌亚门真菌齐整小核菌(sclerotiumrolfsiisacc.)的有性态，主要引起作物白绢病，以发病作物茎基部长出白色辐射状菌丝，后期产生褐色油菜籽状小菌核为主要特征。实施例2辣椒白绢病抗病性鉴定(1)活化并培养辣椒白绢病菌，制备病原菌接种菌条1.pda培养基制备：取新鲜土豆去皮称重200g，切碎，加入1l蒸馏水放入锅中煮烂，后用2层纱布过滤，去掉滤渣，在滤液中加入20g葡萄糖，用蒸馏水定容至1l。准备5只200ml三角瓶，每瓶中加入5g琼脂粉，随后将含有葡萄糖的土豆汁倒入三角瓶中。封口膜封装后放入灭菌锅中，121℃，高压蒸汽灭菌30分钟。灭菌后，待培养基温度在60-80℃时，摇匀，在无菌操作台中倒成平板。2.将实施例1中分离的病原菌保存备用，使用时将纯化好的菌株用5mm圆形打孔器打孔，制成菌饼，在倒好的pda培养基中间放一菌饼，之后放在恒温28℃的培养箱中暗培养5d，直至菌丝接近长满整个培养皿。3.将培养5d的pda培养基用0.3mm×0.5mm的打孔器打孔，制作成接种用的白绢病菌菌条待用。(2)辣椒幼苗准备与接种1.鉴定材料育苗：待鉴定辣椒种子用84消毒液浸种6-10min，灭菌水冲洗后28℃温箱催芽，后播种于育苗钵内。育苗基质经高温蒸汽灭菌(121℃，30min)。人工智能温室育苗，温度22-28℃，所有幼苗生长整齐一致。2.试验设计：设茄门甜椒为感病品种，鉴定材料顺利排列，每份材料重复3次，每次6株苗。3.接种时期：6-8片真叶完全展平期，大约为播种后40d。4.菌条包埋接种法：将菌条置于距辣椒茎基部1cm处，覆盖0.2-0.5mm育苗基质，接种后用喷壶均匀浇水，直至育苗基质湿度饱和。5.管理：接种后放在人工智能温室，先暗培养12h，后16h/8h白天黑夜交替，温度白天28℃±2℃，黑夜22℃±2℃，接种期间保持育苗基质水分含量接近饱和。(3)抗病性等级的划分与群体抗性指标的评价1.调查病情：于接种后第6天调查病情。2.病情级别划分：调查时病情级别的划分按如下表格进行。表1辣椒白绢病病情级别划分病情级别症状特征0全株无症状1茎基部轻微变色，部分叶片萎蔫3茎基部超过二分之一变褐色，半数叶片萎蔫5茎基部形成褐色圈，全株叶片萎蔫7整株萎蔫枯死3.调查方法对接种植株逐一调查发病情况，记载单株病情级别，根据病害症状分级标准逐份登记，及时每份材料的病情指数(di)：病情指数计算公式为：di—病情指数；s—各病情级别的代表数值；n—各病情级别的植株数；n—调查总植株数；s—最高病情级别的代表数值；4.抗病性群体评价划分根据鉴定材料3次重复的病情指数(di)平均值确定其抗性水平，划分标准见下表。表2辣椒白绢病抗性评价标准病情指数(di)抗性评价di＝0免疫(i)0＜di≤10高抗(hr)10＜di≤30抗病(r)30＜di≤50中抗(mr)50＜di≤70感病(s)di＞70高感(hs)5.鉴定结果有效性判断调查完毕后，只有当感病对照材料达到其相应感病程度(di＞50)时，该批次的抗白绢病鉴定认定为有效。实验例以实施例2的鉴定方法对25份育种材料、10个辣椒品种进行了抗病性室内接种鉴定。鉴定结果如下表所示，结果表明，鉴定的35个材料(品种)中，尚未发现免疫材料，1份高抗材料，13份抗病材料，15份中抗材料，4份感病材料，2份高感材料。本实验例鉴定的材料(品种)与种植在病圃和以及大田中的发病率较为一致，表明此种鉴定方法在可控环境下、接种效率高，鉴定结果准确可靠，可用于辣椒抗白绢病的抗病育种。当前第1页12