一种烟草立枯病人工发病的快捷方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草立枯病人工发病的快捷方法，该方法的步骤如下：1.烟草幼苗培育准备；2.接种菌丝体的准备；3.烟草幼苗接种前处置；4.接种立枯病菌；5.接种后处置。本发明的优点是：1）接种技术体系微型化，使用微小的幼苗，在很小的空间内接种发病，耗用很短的试验周期。2）实施过程简单，操作方便效率高。3）全程在普通实验室内完成，发病局部条件容易控制，受干扰小，容易实现技术方法标准化。
【专利说明】一种烟草立枯病人工发病的快捷方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业技术和生物技术。具体是一种烟草立枯病人工发病的快捷方法。【背景技术】
[0002]由病原真菌Rhizoctonia solani侵染引起的烟草立枯病是烟草生产的重要病害之一，主要在苗期发病，引起死苗，严重时造成一些田块大量缺苗，近年在烟草成株期也常见发生，特别是一些高产栽培区，往往出现较高的发病率，由于在成株期该病害主要引起烟草植株的茎基部坏死，从而导致整株受害，造成较大的损失，这已成了生产上面临的重要问题，要解决这个问题，仍然有赖于加强烟草立枯病的基础研究，而人工发病又是该病害有关研究的基础手段之一。由于长期以来对该病害的研究薄弱，至今还未形成规范和成熟的人工发病方法。虽然该病害主要危害烟株茎基部，但发明人发现，立枯病菌也可以侵染烟草上部叶片引起清晰的坏死病斑，这个致病特性可在人工接种发病中加以利用，而至今未发现将烟草立枯病菌能侵染叶片致病的有利特性，在人工发病实践中加以应用并建立配套技术。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种烟草立枯病人工发病的快捷方法，在短期内完成人工发病工作。
[0004]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0005]一种烟草立枯病人工 发病的快捷方法是利用立枯病菌可侵染烟草叶片引起组织坏死的特性，在培养皿内接种幼小烟苗，导致烟苗叶片快速发病，表现清晰症状。人工发病方法的步骤如下:
[0006]1.烟草幼苗培育准备:
[0007]用普通的浅盘盛装肥力较好且疏松的土壤，用常规方法在室内培育烟苗，长至3~4片小叶片后备用。
[0008]2.接种菌丝体的准备:
[0009]将立枯病菌移植到PSA普通真菌培养基平板中心，PSA培养基成分为:马铃薯200克，蔗糖20克，琼脂18克，水1000mL,在28°C条件下培养至长出较大菌落，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作接种体。
[0010]3.烟草幼苗接种前处置:
[0011]取步骤I育好的适用幼苗，接种前先浇水湿润软化育苗土壤，以便于拔苗。取出干净的培养皿置于普通浅方盘内，并往培养皿内加入薄层清水；选取有3~4片小叶片的幼苗，用手轻轻拔起并转到其它容器盛装的清水中，轻轻晃动洗脱幼苗根系上的土壤，将幼苗转到上述备好的培养皿内，把小叶片架放于培养皿的皿缘上，根系靠在皿底上，使幼苗呈竖立状态，并且使清水浸没根系。
[0012]4.接种立枯病菌:[0013]挑取步骤2准备的菌丝块，轻轻贴放于步骤3处置完毕的幼苗的心叶上或心芽上。
[0014]5.接种后处置:
[0015]步骤4操作完备后，将盛装接种幼苗的培养皿放在浅方盘内，并将有机玻璃罩罩在浅方盘上,往浅方盘内注入薄层清水,使有机玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；然后将整套装置放于具备日常散射光的普通室内培养，培养温度维持在25~30°C。注意避开直射阳光照晒。
[0016]接种结果导致幼苗叶片出现水溃状坏死，最后整个幼苗全部坏死腐烂。通常情况下，接种I天后可见明显坏死表现，3~4天后全株腐烂。
[0017]本发明的优点是:
[0018]I)接种技术体系微型化，主要表现在用微小的幼苗，在很小的空间内接种发病，耗用很短的试验周期。
[0019]2)实施过程简单，操作方便效率高。
[0020]3 )全程在普通实验室内完成，发病局部条件容易控制，受干扰小，容易实现技术方法标准化。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是本发明在普通实验室内培育的烟草幼苗示意图。
[0022]图中，A是用普通搪瓷方盘培育；B是用培养皿培育。
[0023]图2是本发明的架放在培养皿皿缘上的幼苗及其接种菌丝块后的示意图。
[0024]图3是本发明用有机玻璃罩将接种后的幼苗罩在浅方盘内的示意图。
[0025]图4是本发明接种2天后的发病表现。
[0026]图中，A~E是不同幼苗接种病菌的表现；F部是空白接种对照。
[0027]图5是本发明接种3天后的发病表现。
[0028]图中，A~E是接种病菌的发病表现，其中A示意多株幼苗的病情，B~E示意单株苗的表现；F是空白接种对照。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。
[0030]本发明的烟苗培育和接种发病全程均在普通实验室内实施，实验室只需要具备窗口向南，透光良好，并配备普通空调即行。按常规方法在室内近窗口旁培育烟苗，本发明设计主要是采用较大的育苗盘统一大量育苗，如图1的A所示，这可使得育苗护理(主要是浇水护理)相对简单；幼苗大小适合使用之后，将幼苗移转到另外的器具上实施接种操作；采用此方式育苗还有个好处，就是一般培育的烟苗生长通常是大小参差不齐，移苗到另处接种操作可以选择大小一致的幼苗进行试验；另外，移苗操作可以获得无土状态的幼苗，对于一些需要排除土壤干扰的试验有利。实际应用也可采用培养皿等器具育苗，如图1的B所示；
[0031]接种所采用的是生长至3~4片小叶片的微小烟苗，如图1的B部所示，通常只需要培育3~4周。接种操作是在普通培养皿内实施，在幼苗轮生状的小叶片中心接种病菌，如图2所示。[0032]烟草立枯病菌侵染烟草发病的关键条件是需要环境处于高湿状态，本发明采用自制玻璃罩罩住幼苗的方式，如图3所示，提供稳定的高湿条件，同时还便于发病过程观察。
[0033]发病通常在接种点开始，表现为水溃状坏死，如图4所示，随菌丝的蔓延，坏死斑快速向周围扩展，最后整个幼苗都坏死腐烂，如图5所示。通常情况下，接种I天后可见坏死斑出现，3~4天后全株坏死腐烂。
[0034]接种导致病情发展的快慢或轻重，与立枯病菌接种菌丝体菌龄状态有关，也与接种后的培养温度有关，病情轻重可以用坏死的最前沿点与接种点的距离、或坏死病斑面积、或株发病率等指标来衡量。
[0035]实施例1
[0036]一种烟草立枯病人工发病的快捷方法，在烟草品种云烟87微小幼苗上接种烟草立枯病菌菌株Rs-1，按如下步骤操作:
[0037]1.烟草幼苗培育准备:用普通的搪瓷方盘内盛装肥力较好且疏松的土壤，用常规方法在室内培育烟苗，长至如图1的B所示的3~4片小叶片后备用。
[0038]2.接种菌丝体的准备:将立枯病菌移植到PSA培养基平板中心，PSA培养基成分为:马铃薯200克，蔗糖20克，琼脂18克，水1000mL，28°C下培养48小时长出较大菌落，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作接种体。
[0039]3.烟草幼苗接种前处置:取步骤I育好的适用幼苗，接种前0.5~I小时先浇水湿润软化育苗土壤，以便于拔苗。取出干净的9cm培养皿置于普通浅方盘内，并往培养皿内加入20ml清水；选取有3~4片小叶片的幼苗，用手轻轻拔起并转到其它容器盛装的清水中，轻轻晃动洗脱幼苗根系上的土壤，将幼苗转到上述备好的9cm培养皿内，把小叶片架放于培养皿的皿缘上，根系靠在皿底上，使幼苗呈竖立状态，并且皿内清水浸没根系。
[0040]4.接种立枯病菌:挑取步骤2准备的菌丝块，轻轻贴放于步骤3处置完毕的幼苗的心叶上或心芽上，完备后如图2所示。
[0041]5.接种后处置:步骤4操作完备后，取自制有机玻璃罩将盛装接种幼苗的培养皿罩在浅方盘上，往浅方盘内注入薄层清水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态，如图3所示；然后将整套装置放于具备日常散射光的普通室内培养，培养温度维持在25~27V。注意避开直射阳光照晒。
[0042]结果表现出如图3和图4 一样清晰的叶片坏死症状；接种48小时后坏死的最前沿点与接种点的距离2.1cm0
[0043]实施例2
[0044]—种烟草立枯病人工发病的快捷方法，在烟草品种云烟87微小幼苗上接种烟草立枯病菌菌株Rs-Ι，按实施例1的步骤I至步骤5操作实施。其中在步骤5的操作的与实施例I步骤5的操作有变化，实施例1的步骤5)接种后培养温度维持在25~27°C，而本实施例的步骤5)接种后培养温度维持在19~20°C。结果也表现出如图3和图4 一样清晰的叶片坏死症状；接种48小时后坏死的最前沿点与接种点的距离0.6cm。
[0045]实施例3
[0046]—种烟草立枯病人工发病的快捷方法，在烟草品种云烟87微小幼苗上接种烟草立枯病菌菌株Rs-Ι，按实施例1的步骤I至步骤5操作实施。其中在步骤2)的操作的与实施例I步骤2)的操作有变化，实施例1的步骤2)接种体菌丝的培养时长为48小时，本实施例的步骤2)接种体菌丝的培养时长为96小时。结果同样表现出如图3~图5 —样清晰的叶片坏死症状，但病斑扩大速 度比实施例1的速度慢，接种48小时后坏死的最前沿点与接种点的距离0.8cm。
【权利要求】
1.一种烟草立枯病人工发病的快捷方法，其特征在于，利用立枯病菌可侵染烟草叶片引起组织坏死的特性，在培养皿内接种幼小烟苗，导致烟苗叶片快速发病，表现清晰症状； 方法的步骤如下: 1)烟草幼苗培育准备: 用普通的浅盘盛装肥力较好且疏松的土壤，用常规方法在室内培育烟苗，长至3~4片小叶片后备用； 2)接种菌丝体的准备: 将立枯病菌移植到PSA普通真菌培养基平板中心，PSA培养基成分为:马铃薯200克，蔗糖20克，琼脂18克，水1000mL,在28°C条件下培养至长出较大菌落，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作接种体； 3)烟草幼苗接种前处置: 取步骤I)育好的适用幼苗，接种前先浇水湿润软化育苗土壤，以便于拔苗，取出干净的培养皿置于普通浅方盘内，并往培养皿内加入薄层清水；选取有3~4片小叶片的幼苗，用手轻轻拔起并转到其它容器盛装的清水中，轻轻晃动洗脱幼苗根系上的土壤，将幼苗转到上述备好的培养皿内，把小叶片架放于培养皿的皿缘上，根系靠在皿底上，使幼苗呈竖立状态，并且使清水浸没根系； 4)接种立枯病菌: 挑取步骤2)准备的菌丝块，轻轻贴放于步骤3)处置完毕的幼苗的心叶上或心芽上； 5)接种后处置: 步骤4)操作完备后，将盛装接种幼苗的培养皿放在浅方盘内，并将有机玻璃罩罩在浅方盘上,往浅方盘内注入薄层清水,使有机玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；然后将整套装置放于具备日常散射光的普通室内培养，培养温度维持在25~30°C，注意避开直射阳光照晒； 接种结果导致幼苗叶片出现水溃状坏死，最后整个幼苗全部坏死腐烂。通常情况下，接种I天后可见明显坏死表现，3~4天后全株腐烂。
【文档编号】A01G7/06GK103782816SQ201410006422
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】张君成, 熊英, 黄柳, 谭金乐, 陈江凝 申请人:广西大学