链霉菌菌株及其防治辣椒立枯病联合应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了链霉菌菌株及其防治辣椒立枯病联合应用，涉及微生物【技术领域】，本发明所述的放线菌是从浙江杭州西溪湿地采集的10~15cm深层土样中采用放线菌分离技术分离获得的，经微生物分类学鉴定，命名为白色链霉菌（ Streptomyces albus ）2013和弗氏链霉菌（ Streptomyces fradiae ）M931， S.albus 2013已于2013年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2013269； S.fradiae M931已于2013年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2013712。两菌株均能发酵产生对辣椒立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)具有较强拮抗作用的活性物质，可用于防治辣椒立枯病等植物病害。当两菌株的发酵产物按重量百分比为3:2混合制成混合制剂时，防治辣椒立枯病的效果较两种代谢产物分别作为单一制剂使用时更为显著。
CCTCC NO: M 2013269
2013.06.19
CCTCC NO: M 2013712
2013.12.25
【专利说明】链霉菌菌株及其防治辣椒立枯病联合应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，涉及两株生防放线菌一白色链霉菌2013和弗氏链 霉菌M931代谢产物在防治辣椒立枯病中的应用。 技术背景
[0002] 辣椒（Capsicum annuum L.)是人们喜爱的蔬菜和调味品之一，在蔬菜生产中占 有重要地位。由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani)引起的辣椒立枯病是辣椒育苗前期引起 死苗倒苗的重要病害，多在辣椒子叶期发生，引起幼苗靠地面处茎基腐烂缢缩、猝倒死亡， 苗床土壤湿度大时，病害发展迅速，可致大量幼苗死近年来辣椒立枯病的发生逐年加重，给 辣椒生产造成严重威胁。多年来，以化学防治为主的措施不但未能遏制病害上升的趋势，而 且还抑制了土壤中的有益微生物，导致病原菌产生抗药性和再猖獗，同时造成有害物质残 留。因此，寻找生防菌资源，探索控制辣椒病害的生物防治途径，对农业可持续发展具有重 大意义。
[0003] 因此，生物防治引起人们的重视。目前有研究表明植物提取物中的活性成分对有 一定的抑制作用，但植物有效成分提取操作步骤多，效率低；已报道采用哈茨木霉、沙雷氏 菌等。放线菌因其易产生抗病原菌成分等活性物质，已成为生物防治的主要资源和生物农 药开发的主要来源。土壤是放线菌栖居的重要场所，从土壤中获得具有高效抗菌活性的放 线菌是目前世界范围内研制开发新医药和新农药必不可少的基础工作。国内外在生物防治 辣椒立枯病方面已报道有抑制作用的大多为真菌和细菌，如哈茨木霉和沙雷氏菌，从土壤 中筛选拮抗放线菌对辣椒立枯病原真菌的生物防治报道还并不多见。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于通过筛选提供对辣椒立枯病 原菌具有较强拮抗作用的两株生防菌一白色链霉菌2013和弗氏链霉菌M931。
[0005] 本发明的第二个目的是通过不同的比例混合两株生防链霉菌的发酵产物，提供上 述白色链霉菌和弗氏链霉菌在辣椒立枯病防治中的联合应用。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术手段得以实现： 本发明首先以在浙江西溪湿地植物根际采集的土样为研究对象，经分离、发酵培养、 发酵液提取以及对植物病原真菌抑制活性检测等步骤获得两株对辣椒立枯病原菌具有较 强抑菌活性的链霉菌；其中一株经微生物分类学鉴定并命名为白色链霉菌 <^/?5)2013。该菌已于2013年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为： CCTCC NO: M 2013269;另一株经微生物分类学鉴定并命名为弗氏链霉菌(泣 /rat/ia￡〇M931，该菌已于2013年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO: M 2013712。中国典型培养物保藏中心地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072。
[0007] 本发明所述的白色链霉菌2013在PDA固体培养基上培养 时气丝白色，基丝地衣状，乳脂色。显微观察发现a/Zws 2013孢子丝螺旋形， 孢子球形至卵圆形，表面光滑。本发明所述的aWws 2013,发酵液经提取浓 缩后可对辣椒立枯病原菌具有较强的抑制作用。
[0008] 本发明所述的弗氏链霉菌/hat/iae) M931在PDA固体培养基上培 养时气丝白色，基丝浅黄色。显微观察发现/hat/iae M931孢子丝柔曲，孢 子椭圆形，表面光滑。本发明所述的/rat/iae M931，发酵液经提取浓缩后可 对辣椒立枯病原菌具有较强的抑制作用。
[0009] 所述的辣椒立枯病原菌拮抗放线菌的筛选和抑菌活性检测过程如下所述： (1) 从野外(浙江省西溪湿地植物根际）采集土样，并进行晾干处理； (2) 从土样中分离放线菌，并利用辣椒立枯病原菌作为指示菌筛选具有拮抗作用的放 线菌； (3) 将长出的放线菌分别点种于混有辣椒立枯病原菌孢子悬液（IXlO6 cfu ^mr1)的 PDA平板上，通过观察抑菌圈大小，挑选抑菌圈较明显的菌株进入复筛； (4) 将选取的菌株进行发酵培养，发酵结束后离心收集发酵液，用乙酸乙酯萃取，真空 减压浓缩后制备浸膏，用于辣椒立枯病的防效检测，由此筛选出防治效果较好的两株拮抗 微生物一白色链霉菌2013和弗氏链霉菌M931。
[0010] 本发明的有益效果： 本发明从土壤中分离筛选出对辣椒立枯病原菌具有较强抑制作用的两株拮抗链霉菌 a/tos 2013 和/hat/iae M931，两株菌株的发酵产物按重量百 分比为3:2制成的混合制剂可用于辣椒立枯病病害的防治，为生物农药的开发提供了新的 途径。
【具体实施方式】
[0011] 实施例 I : a/tos 2013 和 /hat/iae M931 的分离与 筛选） 按以下步骤进行： (1) 材料及培养基：用于分离白色链霉菌2013和弗氏链霉菌M931的材料为采自浙江 西溪湿地植物根际的土样，用于放线菌分离所用的培养基为含重铬酸钾的PDA培养基(配 方为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加蒸馏水IL煮沸半小时，纱布过滤，再加20g葡 糖糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121°C，高压灭菌 20min;使用时添加重铬酸钾20iig ? ml/1;以下试验中放线菌常规培养所用培养基均以蒸 馏水配置）； (2) 分离纯化：将上述新鲜采集的土样装于采样袋中，带回实验室后分装晾干一周左 右；瞭干后的土样每份称取5g，分别加入含有45ml无菌水的锥形瓶中，锥形瓶中加入3-5 粒无菌的玻璃珠，28°C摇床培养2h，使土样中的微生物充分进入水中；吸取培养后的样品 以10倍梯度稀释，分别取10' 10' KT4浓度稀释液200 ii L，涂布于含20 ii g ? ml/1重铬酸 钾的PDA固体平板上，28°C培养72h ;将平板上长出的放线菌分别挑取单菌落，接种于含重 铬酸钾的新鲜PDA平板上，28°C ± 1°C条件下纯化培养72h，获得纯化后的放线菌； (3) 初筛和复筛：将分离得到的放线菌分别点种于混有辣椒立枯病原菌孢子悬液 (I X IO6Cfu ^171)的PDA固体平板上，通过观察抑菌圈大小，挑选抑菌圈较明显的菌株进行 复筛； 复筛采用平板对峙法对初筛的放线菌进行抑菌活性测定，具体方法为：在PDA固体平 板上分别对称放置一个直径4mm的放线菌菌饼和一个辣椒立枯病原菌菌饼，置培养箱中 28°C ±1°C条件下培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直 径。抑菌率通过以下公式计算： 抑菌率（%) = (1-处理菌落生长半径/对照菌落生长半径）X 100 根据结果获得抑菌活性较好的两株放线菌，对辣椒立枯病原菌的抑菌率均在70%以 上。综合16S rDNA序列的比对结果、形态特征、培养特征和生理生化特性，其中一株菌株鉴 定为白色链霉菌，命名为白色链霉菌2013 (泣WZw1S 2013);另一株菌株鉴定 为弗氏链霉菌，命名为弗氏链霉菌M931 (泣/rat/iae M931);保存。
[0012] (4) 2013 和 /hat/iae M931 抑菌活性测定： 将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的a/tos 2013和Stre/? (OffiiFce1S /rat/iae M931按5% (v/v)分别接入发酵培养基中，28°C ±1°C条件下，180 r/min，摇床培 养120h后，7800 r/min离心7 min,用滤纸过滤得发酵滤液。取经0. 22 iim膜过滤的发酵 上清液ImL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养 基平面中央分别放1个直径为4mm的辣椒立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kuhn)菌饼， 置培养箱中28°C培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；待对照菌落直径长至平板直 径的2/3左右时统计结果，采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率： 菌丝生长抑制率（％)=[(对照菌落直径-处理菌落直径）/(对照菌落直径-4)] X 100 测定结果表明 a/tos 2013 和 /hat/iae M931 代谢产物 对辣椒立枯病菌生长抑制率分别为72. 9%和70. 5%。
[0013] 实施例 2 : 2013 和 /hat/iae M931 发酵代谢 产物的制备方法） 按以下步骤进行： (1) 菌种的活化培养：将保存的 a/tos 2013 和 /hat/iae 1931孢子悬液（1父108(^11，111171)接入马铃薯葡萄糖液体培养基，在281：±11：条件下培 养4?供发酵使用； (2) 发酵培养：发酵培养基每I L中含有黄豆饼粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g， 葡萄糖5g，蛋白胨5g，CoCl2 0. 02g，牛肉膏5g，CaCO3 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶装 发酵培养液50mL ;配制后121°C灭菌20min，将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的 a/tos 2013 和 /hat/iae M931 按 5% (v/v)分别接入发酵培养 基中，在28°C ±1°C条件下，摇床转速180 r/min，发酵培养84 h; (3) 发酵物提取：发酵完毕，离心，弃菌体，收集发酵液于分液漏斗中，将加入等体积的 乙酸乙酯萃取，充分混匀，待分层后，取上层液相至圆底烧瓶，利用旋转蒸发仪浓缩后获得 萃取物浸膏，用于测定抑菌活性。
[0014] 以下实施例 3 和试验例中所述的 Stre/? (OffiiFce1S a/tos 2013 和 Stre/? (OffiiFce1S /rat/iae M931代谢产物均为实施例2所制产品；所述产品的百分含量均为质量/体积百分 比。
[0015] 实施例 3 : 2013 和 /hat/iae M931 代谢产物 对辣椒立枯病菌的抑制作用） (1)分别准确称取Str印a/tos 2013 和/hat/iae M931 代谢产 物0. lg，并加入IOmL体积的无菌水，超声波震荡充分溶解，分别配置终浓度为10 g/L的母 液； (2)抑菌活性测定：取上述母液分别稀释成浓度为lg/L和0. 5g/L的溶液，取各浓度溶 液ImL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅速混勻a/Zws 2013和泣re/7te聊cm /rat/iae M931代谢产物终浓度分别均为0. lg/L和0. 05g/L)，冷却后 在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的辣椒立枯病菌菌饼，菌饼接于培养皿中央（培 养皿直径为9cm)，置培养箱中28°C培养36h，以常规化学药剂和无菌水处理作为对照，重复 3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率： 菌丝生长抑制率（％)=[(对照菌落直径-处理菌落直径）/(对照菌落直径-4)] XlOO 试验例：(本发明产品与常规农药防治效果对比试验） 试验结果见表 1。从表 1 看出，Str印a/tos 2013 和 Stre/?/hat/iae M931代谢产物抑制辣椒立枯病菌效果较常规化学药剂相差无几，当两菌株的发酵产物按重 量百分比为3:2混合制成混合制剂使用时，防治辣椒立枯病的效果较两种代谢产物分别作 为单一制剂使用时更为显著。
[0016]表 I a/tos 2013 和 /hat/iae M931 代谢产物对供试 的辣椒立枯病原菌的抑制效果及比较
【权利要求】
1. 一种链霉菌菌株，其特征在于：菌株2013分类命名为白色链霉菌(5?/·--/7?ο?_7----5· W/ws) 2013,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日：2013年6月19日，保藏登记号 为CCTCC NO: Μ 2013269;另一种链霉菌菌株M931，其特征在于：菌株M931分类命名为弗氏 链霉菌(泣?ο聊cm /rat/iae ) Μ931，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日：2013 年12月25日，保藏登记号为CCTCC NO: Μ 2013712。
2. -种如权利要求1所述的链霉菌菌株的应用，其特征在于：所述的白色链霉菌2013 和弗氏链霉菌Μ931均能发酵产生对辣椒立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kuhn)具有较 强拮抗作用的活性物质，可防治辣椒立枯病病害，龟裂链霉菌2013和M931两者的代谢产物 重量百分比为3:2时，效果显著。
3. 权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的白色链霉菌2013和弗氏链霉菌M931 代谢产物的制备方法如下： (1) 将分离得到的白色链霉菌2013和弗氏链霉菌M931涂布于甘露醇黄豆饼粉制成的 MS平板上，收集孢子接种于发酵培养基； (2) 发酵培养基为每1 L中含有黄豆饼粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g，葡萄糖5g，蛋 白胨5g，C〇Cl2 0· 02g，牛肉膏5g，CaC03 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶装发酵培养液50mL ; 配制后121°C灭菌20min，将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的a/Zws 2013和5^/'<9/7(〇?/^<951/>，<3￡// <3(9]\1931分别按5%(>八)接入发酵培养基中，在28°〇±1°(1|条 件下，摇床转速180 r/min，发酵培养84 h ; (3) 发酵结束后离心收集发酵液，加入等体积的乙酸乙酯，充分震荡混匀，取上层，在真 空条件下浓缩至浸膏； (4) 混合制剂配制：将5^/'<9/7(〇?/^<915<3从^/512013和5^/'(9/7(〇?/^(9 >5/>'<3￡//<3(9]\1931代谢 产物用水溶解，混合，配成终浓度为〇. 〇6g/L aWws 2013代谢产物和0. 04g/ L 5?/·<9/7?ο?_7--(95· /rat/iae M931 代谢产物混合配方制剂。
【文档编号】C12R1/54GK104293710SQ201410509421
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】马正, 俞晓平, 罗帅, 路丹丹, 边亚琳, 许益鹏, 王正亮, 申屠旭萍 申请人:中国计量学院