静息细胞法制备高纯度龙胆苦苷的制作方法
【专利摘要】本发明公开了静息细胞法制备高纯度龙胆苦苷的工艺。具体的本发明公开了一种高纯度的龙胆苦苷及其制备方法，该方法包括步骤：首先将蓝色梨头霉(Absidia coerulea)接种于培养基中进行液态发酵，发酵完成后过滤获得菌丝体，将菌丝体分散于水中制得静息细胞；然后混合龙胆苦苷提取液和静息细胞，搅拌处理2-8h，过滤取滤液；将滤液上大孔吸附树脂柱，水洗脱，分步收集，合并液相纯度大于99％的洗脱液，浓缩干燥得高纯度龙胆苦苷成品。本发明的方法，极大的减少了有机溶剂的用量，甚至可以完全不使用有机溶剂，具有收率高，工艺安全可靠，环境污染少，操作简单方便等优点，适合进行大规模的工业化生产。
【专利说明】静息细胞法制备高纯度龙胆苦苷
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地涉及一种静息细胞法制备高纯度龙胆苦苷。
【背景技术】
[0002] 龙胆苦苷是传统中药秦艽中的主要活性成分，可以从秦艽等药材提取得到，国内 外有关龙胆苦苷药效学方面研究较多，主要为保肝利胆方面报道，药理毒理及临床试验研 究表明龙胆苦苷安全有效。龙胆苦苷能增加胆汁中胆固醇和胆红素的排泄量，能提高Na+、 K+-ATP酶的活性。能明显降低ALT、AST和LDH，对肝组织病理损伤有一定改善作用。龙胆 苦苷还可抑制血清中TNF的产生，表明龙胆苦苷通过抑制TNF，而抑制肝炎。主要研究成果 简列如下：1、龙胆苦苷对化学和免疫致小鼠肝损伤的抑制作用，龙胆苦苷对CCl 4和脂多糖 /芽孢杆菌致小鼠鼠肝炎的影响。小鼠每天一次腹腔注射龙胆苦苷（30?60mg/Kg ·(!)，能 抑制口服CCl4及静脉注射芽孢杆菌引起的转氨酶的升高。2、龙胆苦苷对大鼠肝细胞实验 性保护作用的病理观察，龙胆苦苷在浓度为I. 4 X KT1?I. 4 X l(T2mg/ml时，能抗CCl4致肝 损伤，即保肝作用，并呈良好的量效关系。3、增加大鼠胆汁分泌，促进胆囊收缩。4龙胆苦苷 对化学和免疫性诱导的肝损伤的抑制作用，采用两种药理模型，即CCl 4和BCG/LPS诱导的 肝炎。在造模型之前，连续5天给予小鼠龙胆苦苷（30?60mg/kg. d)，明显抑制出CCl4和 诱导的血清中转氨酶的升高。在另一组实验中，小鼠在灌注BCG7天给予LPS，血清中谷草转 氨酶和谷丙转氨酶活力增强，在LPS给药前，腹腔注射龙胆苦苷（60mg/kg. d)连续5天，血 清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平在4?心期间明显降低，给予龙胆苦苷后，明显抑制血 清中TNF的产生，表明龙胆苦苷通过抑制TNF，而抑制肝炎。5龙胆苦苷保肝作用，动物试验 研究表明龙胆苦苷能明显促进豚鼠肝组织的修复，对豚鼠同种免疫性肝损伤具有明显的保 护作用。龙胆苦苷给药后，胆红素分泌量显著增高，表明具有明显利胆作用。龙胆苦苷能明 显降低模型小鼠的ALT、AST，且呈良好的量效关系，还能增加肝组织GSH-Px的活力；大鼠口 服龙胆苦苷后龙胆苦苷能增加胆汁中总胆红素、游离胆红素的浓度。
[0003] 秦艽药材中的龙胆苦苷具有保肝利胆抗炎的作用，几乎无毒，具有非常巨大的药 用潜力。但是目前仍然缺乏适合产业化生产的高纯度龙胆苦苷的提取制备工艺。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种高纯度的龙胆苦苷及其制备方法。
[0005] 本发明的第一方面，提供了一种高纯度龙胆苦苷，所述龙胆苦苷的纯度在99%以 上，所述龙胆苦苷的结构如下式I所示：
[0006]
【权利要求】
1. 一种高纯度龙胆苦苷，其特征在于，所述龙胆苦苷的纯度在99 %以上，所述龙胆苦 苷的结构如下式I所示：
2. -种制备高纯度龙胆苦苷的方法，其特征在于，包括步骤： (1) 制备静息细胞 将蓝色梨头霉（Absidiacoerulea)接种于培养基中进行液态发酵，发酵完成后过滤获 得菌丝体，将菌丝体分散于水中制得静息细胞； (2) 制备龙胆苦苷浸提液 将秦艽粉碎后，加入药材重量3-10倍的提取剂进行提取，得龙胆苦苷提取液，减压浓 缩龙胆苦苷提取液至原体积的20% -30% ; (3) 静息细胞处理 混合龙胆苦苷提取液和静息细胞，搅拌处理2-8h，过滤取滤液； (4) 分离纯化 将步骤（3)所得滤液上大孔吸附树脂柱，水洗脱，分步收集，合并液相纯度大于99%的 洗脱液，浓缩干燥得高纯度龙胆苦苷成品。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤⑴中的蓝色梨头霉为CGMCC3. 3389菌 株。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1)中的液态发酵过程中培养基中碳源 和氮源分别为蔗糖和棉籽粉，蔗糖含量为2-3% (w/v)，棉籽粉含量为1.5-2. 5% (w/v)。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1)中菌丝体和水的重量比为1 : 3-5。
6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤⑶中提取液和静息细胞的体积比为 1-2:1。
7. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3)中搅拌处理过程中维持 35°C-45°C。
8. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，调节提取液和静息细胞混合液 的pH为 7. 5-8. 5。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，调节提取液和静息细胞混合液 的pH为8.0。
10. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，大孔吸附树脂为V493或V503 树脂。
【文档编号】C12P19/60GK104402948SQ201410509263
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】杨钟华 申请人:瑞安市普罗生物科技有限公司