单管扩增同时检测a和e地中海贫血基因试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种单管扩增同时检测《和e地中海贫血基因的试剂盒，包括：（i)一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQIDNo:l-37和SEQIDNo:1-37互补的序列；（2)—组用于多重PCR的引物，为SEDIDNo.38-46?本发明所述地贫基因检测试剂盒在同一个反应管中同时实现地贫基因扩增和P-地贫基因扩增，可同时检测3种缺失型a-地贫（--SEA、-a3_7和-a4_2)、3种突变型<1-地贫（08、08、《8)以及19种突变型13-地贫。在同一个反应管中同时扩增地贫基因和13-地贫基因，可大大提局诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短检测时间，对开展地贫人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。
【专利说明】单管扩增同时检测（！和P地中海贫血基因试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因领域，具体是一种单管扩增同时检测a和0地中海贫血基因试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 地中海贫血(简称地贫）是由于人体基因突变或者缺失而导致a，￠-珠蛋白肽链 合成速率的不平衡，从而引起的溶血性贫血。地贫为全世界的高发病率遗传病之一，广泛分 布于地中海国家及其他疟疾曾经高发地区。我国以长江以南各省发病率高，除广东、广西、 海南省等发病率最高外，贵州、云南、四川等也是高发区。地贫常见的两种类型是a-地贫 和@ _地贫。
[0003] a-地贫是由于常染色体遗传性缺陷，使a珠蛋白基因缺失或功能障碍导致a 珠蛋白肽链合成减少或不合成引起的慢性溶血病。a珠蛋白基因位于第16号染色体短臂 末端的a珠蛋白基因簇中，该基因包括二个重复的a基因（〇2和aj、一个胚胎期类a 基因（42)、三个假基因（W 4 i、W 〇2和W Ci1)和一个功能未知的基因（0 1)，其排列顺序 为：5，-C2-WC1-Wa2 ，全长约30Kb。就一个单倍体而言：地贫 可分为三类缺陷：地贫1，缺失两个基因（一/);地贫2,缺失一个基因（_ a/);非缺失性a 基因发生点突变或少数几个碱基的缺失（aTa或a aT)。目前已鉴定的a地贫缺失类型 至少36种，东南亚缺失型（一SEA)、右侧缺失（-a 3_7)和左侧缺失（-a 4_2)是中国人最常见 的3种缺失型。非缺失型a地贫点突变类型有30多种，在中国人群中最常见的Constant Spring(CS)、Quong Sze(QS)和 Westmead (WS)。
[0004] P _地贫是由于血红蛋白的P珠蛋白基因突变导致P珠蛋白肽链缺如° ) 或合成不足（￠+)，从而引起的遗传性溶血性贫血病。P珠蛋白基因位于11号染色体短臂 (llpl5)，基因排列顺序为5' -e-GY-AY-WP-S-p-3'，长度约60Kb。绝大多数@地 贫是由于点突变所致，少数为基因缺失所致。0°珠蛋白生成障碍性贫血，突变导致P链的 合成完全受抑制，无P链生成；￠+珠蛋白生成障碍性贫血，突变导致P链的合成部分受抑 制，有少量P链合成；非典型P珠蛋白生成障碍性贫血，分子缺陷位于P珠蛋白基因启动 区或位点控制区（LCR)，导致P珠蛋白表达受影响。全世界已报道170种左右P珠蛋白基 因的突变型，导致中国人群P地贫发生的突变基因有23种。最主要的6种⑶41-42(-4bp)， IVS-II-654(C-T)，CD17(A-T)，CD71-72(+A)，-28(A-G)以及 CD26(G-A)，占中国人 P 地贫 突变基因总数的80%以上，而且这些不同的P地贫基因在不同地区的发生率也有所不同。
[0005] 该病在我国的患者及基因携带者大约有3000万，对我国的人口素质及国民健康 造成了极大威胁。据前些年调研，仅在广西a-地贫基因携带率高达15%，￠-地贫基因携 带率也达到5%，全广西地中海贫血基因携带者约900多万，广东地中海贫血基因携带者也 是近千万。按照该病的遗传规律，如果夫妻二人均为相同类型地中海基因携带者，则有25% 的几率生出重型或中间型地中海贫血患儿，也就是说，每年全国有成千上万的重型或中间 型地中海贫血患儿出生。
[0006] 地中海贫血症的临床表型多样，可以从正常到需要反复输血，甚至危及生命，导致 患者在未成年前夭折甚至死胎。该病在我国南方的高发病率，对社会和家庭产生巨大的精 神和经济压力。然而目前该病尚缺乏理想的治疗方法，筛查是降低致病基因在人群中传递 及降低患病率最有效的方法。研究和检测地中海贫血是一项很有意义的工作，它对开展地 贫人群筛查，遗传咨询和产前诊断有重要的知道意义。对提高人口素质和促进整个社会的 经济发展有重要的意义。
[0007] a -地贫传统的临床血液学检测方法如常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、 血红蛋白稳定性试验等特异性不高，较易产生假阴性；而肽链分析、HPLC、ELISA等检测方 法由于检测单一、操作繁琐等原因正被技术日益成熟的基因检测所替代。传统基因诊断技 术主要采用Southern印迹杂交方法，灵敏度高、准确率高，但操作时间长、要求DNA量多、需 要同位素等原因使其只用于研究，不能进行大规模筛查。而普通PCR电泳技术，其方法与 传统的Southern分子杂交相比操作简易、快速、准确、经济且易推广，为a -地贫基因诊断 提供了较为有效的方法，但特异性较低，无法检测出常见的CS、QS、WS点突变，而且易出现 假阴性或假阳性。￠-地贫常用诊断技术有=RFLP (限制性片段长度多态性）连锁分析，寡 核苷酸探针技术，等位基因特异性核苷酸（ASO)探针杂交技术，等位基因特异性扩增技术 (ASPCR或ARMS)，反向杂交技术（RDB)，PCR斑点杂交法以及基因芯片等技术。
[0008] 由于杂交分析检测技术特异性高，因而被广为推崇。DNA杂交是高密度基因芯片 之核心分析方法，能在同一芯片上同时分析千万个不同的基因片段，大大加速了研究的速 度。而在临床的应用上，低密度芯片更能达到灵敏度、特异性双高的严格要求，该方法已用 于遗传病的基因分析许多年，其特异性在分辨单一碱基（SNP)多态性中已达到100%的准 确，故特别适用于基因分型。鉴于a-地贫主要以缺失类型为主，￠-地贫的突变类型较 多，因此采用先PCR扩增，再进行杂交是最简便快捷的筛查地中海贫血基因的方法，同时避 免Gap-PCR体系设计以及单碱基突变的捕获的困难。杂交技术和PCR扩增技术结合，具有 技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低的特点。 [0009] 如申请号为201110117563. 5的中国发明专利" a，￠-地中海贫血的突变基因联 合检测试剂盒"，该基因检测试剂盒通过PCR扩增技术结合杂交技术首次实现a，￠-地贫 同步联合检测，检出率高、灵敏度高、特异度好、假阳性率和假阴性率低，在临床诊断中得到 了一定的推广。但是该产品需要将a-地贫和￠-地贫分别在两个不同的PCR反应液中进 行扩增，两种不同的扩增程序需要用两台PCR仪。申请号为201210494748. 2的中国发明专 利" a和0地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒"虽然是用同一个扩增程序进行PCR 扩增，在样本量少时一台PCR仪可以完成，但是该产品需要两种反应液(反应液I和反应液 II)，两次加样，两管扩增才能完成。这些产品对操作要求条件高、步骤繁琐、耗时长，尚不能 满足临床诊断简便快速的要求。
[0010] 至今为止，临床上用于检测地贫的产品，尚未出现在同一反应管中同时进行 a-地贫和￠-地贫基因扩增的产品。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种可在同一反应管中同时扩增a-珠 蛋白基因缺失及基因突变区域和￠-珠蛋白基因突变区域，同时检测3种缺失型a-地贫 (」EA、_。_7和-a4_2)、3种突变型a-地贫（cs、 QS、WS)及19种突变型￠-地贫的单管 扩增同时检测a和0地中海贫血基因的试剂盒，包括： (1) 一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQ ID No: 1-37和SEQ ID No: 1-37互补的 序列； (2) -组用于多重PCR的引物，为SED ID No. 38-46。
[0012] 本发明的探针序列如下：
【权利要求】
1. 单管扩增同时检测a和0地中海贫血基因的试剂盒，包括： (1) 一个基因芯片，其上带有探针，探针为SEQ ID No: 1-37和SEQ ID No: 1-37互补的 序列； (2) -组用于多重PCR的引物，为SED ID No. 38-46。
2. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包括用于多重PCR的反应液，反应液按 每人份含量由以下组份组成： 10. PCR Buffer 5. 00 u 1 ； 5. PCR Enhancer 7. 00 u I ； 25 mM MgCl2 3. 00 u I ； 25 mM dNTPs 0. 80 u I ； IOOii M 引物 I 0.15 ill; IOOiiM 引物 2 0. 15u 1 ； IOOiiM 引物 3 0. 15u 1 ； IOOiiM 引物 4 0. IOu 1 ； IOOiiM 引物 5 0. IOu 1 ； IOOiiM 引物 6 0. 15u 1 ； IOOiiM 引物 7 0. 15u 1 ； IOOiiM 引物 8 0. 15u 1 ； IOOiiM 引物 9 0. 15u 1 ； H2O 27. 45 u 1 ； DNA 聚合酶 5U/ ii 1 0. 50 Ul0
3. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5'端标记有生物素。
4. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置 记。
5. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
【文档编号】C12Q1/68GK104212910SQ201410509044
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】苏彬峰, 李烈军 申请人:广东凯普生物科技股份有限公司