本发明涉及微生物技术领域，具体为一种快速检测幽门螺杆菌生物被膜形成及特性的方法。
背景技术：
幽门螺杆菌是一种有丛鞭毛、主要定植于人类胃肠粘膜上皮细胞表面的革兰氏阴性微需氧杆菌，h.pylori感染主要和胃、十二指肠多种消化性疾病密切相关，包括慢性活动性胃炎、十二指肠球炎，萎缩性胃炎，胃、十二指肠球部溃疡，粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌等，h.pylori在胃肠粘膜定植方式有生物被膜和细胞内存活，定植部位在胃粘液底层和胃、十二指肠粘膜上皮细胞表面及胃、十二指肠粘膜腺体中长期定植，h.pylori生物被膜和其他有鞭毛细菌如铜绿假单胞菌生物被膜成分、细胞形态、群体感应系统、蛋白表达等有明显区别，目前认为h.pylori生物被膜这种定植方式有助于h.pylori在胃肠粘膜不利环境中的存活及抵抗宿主免疫系统攻击和抗生素的干预治疗，其结果可能导致h.pylori长期慢性感染、根除治疗失败，h.pylori生物被膜可以通过体外培养进行观察，体外培养h.pylori生物被膜通常配制高浊度菌液，使用电子扫描电镜或荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察；
这些方法观察h.pylori生物被膜有很多缺陷，依赖高精密仪器设备，培养时间长，需要摇动培养，细菌不是处于增殖状态等，不利于人们进行深入研究h.pylori生物被膜形成及特性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种快速检测幽门螺杆菌生物被膜形成及特性的方法，具备具有快速、简单、微量，不需要电子扫描电镜或荧光显微镜等设备，本发明h.pylori生物被膜是通过微需氧培养细菌增殖形成，更符合h.pylori生物被膜形成在人体内形成过程，并且可以肉眼观察h.pylori生物被膜特性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种快速检测幽门螺杆菌生物被膜形成及特性的方法，包括如下步骤：
步骤a、应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，获得幽门螺杆菌纯化菌落；
步骤b、应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，对得到的幽门螺杆菌纯化菌落调配一定浓度的菌液，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml；
步骤c、应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒将菌液适当稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml；
步骤d、将稀释菌液加到无菌细胞培养板的孔内；
步骤e、细胞培养板微孔菌液35-37℃微需氧，细胞培养板采用聚苯乙烯微孔板，微需氧的成分为3-8％的o2、5-10％的co2、5-10％的h2、76-86％的n2以及保持湿度l00％，然后培养18-24h；
步骤f、正常裸眼视力在自然光或日光灯下观察培养板微孔，在微孔底部肉眼可见聚集生长的生物被膜形成及特性，生物被膜形成特性包括形成形态和形成密度，形成形态分为圆点状、颗粒状和圆环状，形成密度分为弱(+)、强(++)。
优选的，所述步骤a中不能使用经过抗菌药物治疗过的患者分离幽门螺杆菌菌株，否则生物被膜形成变慢，需要延长培养时间和多次传代培养，生物被膜形成密度也会减少。
优选的，所述步骤b中无菌操作，使用透明无菌管，将幽门螺杆菌对数生长期菌落应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒谷氏幽门螺杆菌药敏培养基调配一定浊度的菌液，摇均后，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml，用比浊仪测定浊度，麦氏浊度0.5-2，不能少于0.5。
优选的，所述步骤b中使用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒微需氧培养18-24h，生长良好的菌落，传代纯化培养菌株株培养不能超过24h，保证菌株在对数生长期。
优选的，所述步骤c中使用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒谷氏药敏培养基稀释菌液进行2倍以上稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml，0.5麦氏浊度菌液稀释不能超过5倍，1.0麦氏浊度菌液稀释不能超过10倍，2.0麦氏浊度菌液稀释不能超过20倍，以此类推。
优选的，所述步骤d中取100-200μl稀释菌液加入无菌细胞培养板微孔内。
优选的，所述步骤e中聚苯乙烯微孔板，配套带有凸棱盖子，孔径6-8mm，每孔体积不超过300μl。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
通过采用本发明能够快速检测幽门螺杆菌生物被膜形成及特性是通过微需氧培养细菌增殖形成，更符合h.pylori生物被膜形成在人体内形成过程，具有快速、简单、微量，不需要电子扫描电镜或荧光显微镜等设备，并且可以肉眼观察h.pylori生物被膜特性，有利于人们深入研究h.pylori生物被膜。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：
一种快速检测幽门螺杆菌生物被膜形成及特性的方法，包括如下步骤：
步骤a、应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，获得幽门螺杆菌纯化菌落；
步骤b、应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，对得到的幽门螺杆菌纯化菌落调配一定浓度的菌液，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml；
步骤c、应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒将菌液适当稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml；
步骤d、将稀释菌液加到无菌细胞培养板的孔内；
步骤e、细胞培养板微孔菌液35-37℃微需氧，细胞培养板采用聚苯乙烯微孔板，微需氧的成分为3-8％的o2、5-10％的co2、5-10％的h2、76-86％的n2以及保持湿度l00％，然后培养18-24h；
步骤f、正常裸眼视力在自然光或日光灯下观察培养板微孔，在微孔底部肉眼可见聚集生长的生物被膜形成及特性，生物被膜形成特性包括形成形态和形成密度，形成形态分为圆点状、颗粒状和圆环状，形成密度分为弱(+)、强(++)。
实施例一：
首先应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，获得幽门螺杆菌纯化菌落，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，对得到的幽门螺杆菌纯化菌落调配一定浓度的菌液，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒将菌液适当稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml，然后将稀释菌液加到无菌细胞培养板的孔内，然后将细胞培养板微孔菌液35-37℃微需氧，细胞培养板采用聚苯乙烯微孔板，微需氧的成分为3-8％的o2、5-10％的co2、5-10％的h2、76-86％的n2以及保持湿度l00％，然后培养18-24h，最后正常裸眼视力在自然光或日光灯下观察培养板微孔，在微孔底部肉眼可见聚集生长的生物被膜形成及特性，生物被膜形成特性包括形成形态和形成密度，形成形态分为圆点状、颗粒状和圆环状，形成密度分为弱(+)、强(++)。
实施例二：
在实施例一中，再加上下述工序：
步骤a中不能使用经过抗菌药物治疗过的患者分离幽门螺杆菌菌株，否则生物被膜形成变慢，需要延长培养时间和多次传代培养，生物被膜形成密度也会减少。
首先应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，获得幽门螺杆菌纯化菌落，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，对得到的幽门螺杆菌纯化菌落调配一定浓度的菌液，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒将菌液适当稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml，然后将稀释菌液加到无菌细胞培养板的孔内，然后将细胞培养板微孔菌液35-37℃微需氧，细胞培养板采用聚苯乙烯微孔板，微需氧的成分为3-8％的o2、5-10％的co2、5-10％的h2、76-86％的n2以及保持湿度l00％，然后培养18-24h，最后正常裸眼视力在自然光或日光灯下观察培养板微孔，在微孔底部肉眼可见聚集生长的生物被膜形成及特性，生物被膜形成特性包括形成形态和形成密度，形成形态分为圆点状、颗粒状和圆环状，形成密度分为弱(+)、强(++)。
实施例三：
在实施例一中，再加上下述工序：
步骤b中无菌操作，使用透明无菌管，将幽门螺杆菌对数生长期菌落应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒谷氏幽门螺杆菌药敏培养基调配一定浊度的菌液，摇均后，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml，用比浊仪测定浊度，麦氏浊度0.5-2，不能少于0.5。
首先应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，获得幽门螺杆菌纯化菌落，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，对得到的幽门螺杆菌纯化菌落调配一定浓度的菌液，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒将菌液适当稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml，然后将稀释菌液加到无菌细胞培养板的孔内，然后将细胞培养板微孔菌液35-37℃微需氧，细胞培养板采用聚苯乙烯微孔板，微需氧的成分为3-8％的o2、5-10％的co2、5-10％的h2、76-86％的n2以及保持湿度l00％，然后培养18-24h，最后正常裸眼视力在自然光或日光灯下观察培养板微孔，在微孔底部肉眼可见聚集生长的生物被膜形成及特性，生物被膜形成特性包括形成形态和形成密度，形成形态分为圆点状、颗粒状和圆环状，形成密度分为弱(+)、强(++)。
实施例四：
在实施例三中，再加上下述工序：
步骤b中使用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒微需氧培养18-24h，生长良好的菌落，传代纯化培养菌株株培养不能超过24h，保证菌株在对数生长期。
首先应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，获得幽门螺杆菌纯化菌落，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，对得到的幽门螺杆菌纯化菌落调配一定浓度的菌液，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒将菌液适当稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml，然后将稀释菌液加到无菌细胞培养板的孔内，然后将细胞培养板微孔菌液35-37℃微需氧，细胞培养板采用聚苯乙烯微孔板，微需氧的成分为3-8％的o2、5-10％的co2、5-10％的h2、76-86％的n2以及保持湿度l00％，然后培养18-24h，最后正常裸眼视力在自然光或日光灯下观察培养板微孔，在微孔底部肉眼可见聚集生长的生物被膜形成及特性，生物被膜形成特性包括形成形态和形成密度，形成形态分为圆点状、颗粒状和圆环状，形成密度分为弱(+)、强(++)。
实施例五：
在实施例四中，再加上下述工序：
步骤c中使用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒谷氏药敏培养基稀释菌液进行2倍以上稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml，0.5麦氏浊度菌液稀释不能超过5倍，1.0麦氏浊度菌液稀释不能超过10倍，2.0麦氏浊度菌液稀释不能超过20倍，以此类推。
首先应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，获得幽门螺杆菌纯化菌落，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，对得到的幽门螺杆菌纯化菌落调配一定浓度的菌液，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒将菌液适当稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml，然后将稀释菌液加到无菌细胞培养板的孔内，然后将细胞培养板微孔菌液35-37℃微需氧，细胞培养板采用聚苯乙烯微孔板，微需氧的成分为3-8％的o2、5-10％的co2、5-10％的h2、76-86％的n2以及保持湿度l00％，然后培养18-24h，最后正常裸眼视力在自然光或日光灯下观察培养板微孔，在微孔底部肉眼可见聚集生长的生物被膜形成及特性，生物被膜形成特性包括形成形态和形成密度，形成形态分为圆点状、颗粒状和圆环状，形成密度分为弱(+)、强(++)。
实施例六：
在实施例五中，再加上下述工序：
步骤d中取100-200μl稀释菌液加入无菌细胞培养板微孔内。
首先应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，获得幽门螺杆菌纯化菌落，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，对得到的幽门螺杆菌纯化菌落调配一定浓度的菌液，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒将菌液适当稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml，然后将稀释菌液加到无菌细胞培养板的孔内，然后将细胞培养板微孔菌液35-37℃微需氧，细胞培养板采用聚苯乙烯微孔板，微需氧的成分为3-8％的o2、5-10％的co2、5-10％的h2、76-86％的n2以及保持湿度l00％，然后培养18-24h，最后正常裸眼视力在自然光或日光灯下观察培养板微孔，在微孔底部肉眼可见聚集生长的生物被膜形成及特性，生物被膜形成特性包括形成形态和形成密度，形成形态分为圆点状、颗粒状和圆环状，形成密度分为弱(+)、强(++)。
实施例七：
在实施例六中，再加上下述工序：
步骤e中聚苯乙烯微孔板，配套带有凸棱盖子，孔径6-8mm，每孔体积不超过300μl。
首先应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，获得幽门螺杆菌纯化菌落，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒，对得到的幽门螺杆菌纯化菌落调配一定浓度的菌液，使其细胞浓度为1.5×108～6×108cfu/ml，然后应用谷氏幽门螺杆菌快速分离培养、鉴定、药敏试剂盒将菌液适当稀释，细胞浓度不能少于3×107cfu/ml，然后将稀释菌液加到无菌细胞培养板的孔内，然后将细胞培养板微孔菌液35-37℃微需氧，细胞培养板采用聚苯乙烯微孔板，微需氧的成分为3-8％的o2、5-10％的co2、5-10％的h2、76-86％的n2以及保持湿度l00％，然后培养18-24h，最后正常裸眼视力在自然光或日光灯下观察培养板微孔，在微孔底部肉眼可见聚集生长的生物被膜形成及特性，生物被膜形成特性包括形成形态和形成密度，形成形态分为圆点状、颗粒状和圆环状，形成密度分为弱(+)、强(++)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。