本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体涉及一种高准确度的5‘-核苷酸酶测定试剂盒。
背景技术：
：5’-核苷酸酶(5'-nt)，全称5’-核糖核苷酸磷酸水解酶。5’-核苷酸酶是一种对底物特异性不高的水解酶，可作用于多种核苷酸。主要参与核酸的分解代谢，能特异性的催化核苷5’-核苷酸酶和次黄嘌呤核苷酸，5’-核苷酸酶在人体的运动，细胞生长发育，纤维蛋白合成，提高表皮或内皮屏蔽功能，神经传递淋巴细胞的再循环及黏附，免疫应答等方面均发挥重要的作用。5’-核苷酸酶广泛存在于肝脏和各种组织中，血清5’-核苷酸酶升高主要见于肝脏胰系统疾病及某些恶性肿瘤，因此具有比较特异的诊断价值。5’-核苷酸酶在细胞生长发育、运动、纤维蛋白合成、神经传递、提高表皮或内皮屏障功能及淋巴细胞的黏附、再循环、免疫应答等方面均发挥重要的作用。到目前为止，在哺乳动物中已发现多种5’-核苷酸酶，依据其细胞定位、作用底物和生化特征，可分为六种形式：(1)胞外-5’-核苷酸酶，即膜结合性5’-核苷酸酶，是通过糖基-磷脂酰肌醇锚定于质膜的一种糖蛋白；(2)胞浆-5’-核苷酸酶i型，与胞浆中amp亲和力高。多见于骨骼肌、心肌，参与肌肉收缩，也见于脑；(3)胞浆-5’-核苷酸酶ⅱ型，与胞浆中的imp、gmp亲和力高，广泛存在于机体内；(4)胞浆-5’(3')脱氧核糖核苷酸酶；(5)线粒体-5’(3')脱氧核糖核苷酸酶；(6)pn-1，一种新近发现的嘧啶核苷酸酶，仅存在于红细胞中，目前研究最广泛、最深入的是胞外5’-核苷酸酶。胞外5’-核苷酸酶是一种糖蛋白，通过糖基-磷脂酰肌醇锚定于细胞膜外表面，胞外5’-核苷酸酶广泛表达于人体组织细胞表面，包括肝细胞、成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞和神经胶质细胞，近端肾小管上皮细胞等。5’-核苷酸酶测定主要用于肝胆系统疾病的诊断和骨骼疾病的鉴别诊断，血清5’-核苷酸酶活性升高主要见于肝胆系统疾病，如阻塞性黄疸、肝癌、肝炎等，其活性增高可达2-6倍，且与病情严重程度呈正相关，在肝癌患者的多次生化检测中发现，在病变早期许多生化指标升高不显著时，5’-核苷酸酶的活性有所升高，这表明在诊断肝肿瘤时5’-核苷酸酶是一个灵敏指标，目前针对5’-核苷酸酶的检测多采用过氧化物酶法检测，但是现有的检测试剂中存在多种离子，由于粒子之间相互作用从而使检测结果不准确，影响检测的灵敏度。中国专利申请201210261802.9中公开了一种5'-核糖核苷酸水解酶的检测试剂盒。试剂盒盒体内包括：甘氨酸缓冲液、3-甲基-n，n-二丙磺酸钠苯胺配制的显色剂、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、5'-次黄嘌呤核苷酸、4-氨基安替比林溶液。通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列反应，再将反应物置于半/全自动生化分析仪下，检测主波长550nm处吸光度变化的速度，从而测算出5'-核糖核苷酸水解酶的浓度大小。该申请公开的试剂盒为单试剂试剂盒，因此试剂容易污染，不利于长时间存放。中国专利201410737995.x中公开了一种高灵敏度的检测5’-核苷酸酶的试剂盒，包括5’-核苷酸酶r1试剂、5’-核苷酸酶r2试剂和5’-核苷酸酶校准品；所述5’-核苷酸酶r1试剂由缓冲液、稳定剂、防腐剂、酶激活剂、4-aap(4-氨基安替吡啉)、18-冠醚-6、uao(尿酸酶)、pnp(嘌呤核苷磷酸化酶)、xod(黄嘌呤氧化酶)和pod(过氧化物酶)反应酶系统组成；所述5’-核苷酸酶r2试剂由缓冲液、稳定剂、防腐剂、po3-和trinder显色系统组成；所述5’-核苷酸酶校准品由缓冲液、稳定剂、防腐剂和5’-核苷酸酶组成，该发明所提供的检测试剂盒的测定灵敏度比“pnp-xod-pod”酶系统提高了40％，但是该申请中试剂种类比较多，各个试剂之间容易产生干扰，从而使检测准确度降低。由于对5’-核苷酸酶的检测具有重要的临床意义，因此，开发一种检测准确度高的5’-核苷酸酶的试剂盒十分必要。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中试剂不稳定、测定准确度低的缺陷，而提供一种5’-核苷酸酶测定试剂盒。本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种5’-核苷酸酶测定试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，其的成分及相应含量为：试剂r1：试剂r2：优选地，所述的5’-核苷酸酶测定试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，其的成分及相应含量为：试剂r1：试剂r2：再优选地，所述的5’-核苷酸酶测定试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，其的成分及相应含量为：试剂r1：试剂r2：进一步优选地，所述的5’-核苷酸酶测定试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，其的成分及相应含量为：试剂r1：试剂r2：本发明使用n-乙酰哌嗪-n-2-乙磺酸(hepes)作为试剂盒中的缓冲溶液，该缓冲溶液不会对试剂盒中的其他组分产生影响，能够有效避免试剂盒中各组分之间相互作用，从而提高试剂盒的稳定性，进而提高了测试结果的准确性。本发明在实施过程中意外地发现控制试剂盒中个别组分的质量比可以提高试剂盒的稳定性同时提高了检测准确度和精密度。其中，所述的嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)、黄嘌呤氧化酶(xod)和过氧化物酶(pod)的浓度比为1：1.25-3：4.2-8.75；优选地，所述的嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)、黄嘌呤氧化酶(xod)和过氧化物酶(pod)的浓度比为1：1.8-2.1：5.5-6.3；再优选地，所述的嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)、黄嘌呤氧化酶(xod)和过氧化物酶(pod)的浓度比为1：2：6。本发明在实施过程中控制三种酶的浓度比，不仅在一定程度上提高了试剂的稳定性，还提高了检测的灵敏度。本发明在实施过程中还控制了4-氨基安替比林与n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺的浓度比为0.5-3：1；优选地，所述的4-氨基安替比林与n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺的浓度比为0.8-1.2：1；再优选地，4-氨基安替比林与n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺的浓度比为0.9：1。本发明控制4-氨基安替比林与n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺的浓度比可以有效提高显色效率，提高检测的准确度、灵敏度和精密度。本发明在实施过程中意外地发现在试剂r2中加入脯氨酸和络氨酸中的一种或两种，可以明显提高试剂盒的灵敏度和精密度。优选地，试剂r2中加入脯氨酸和络氨酸的浓度比为1：1-2。所述的脯氨酸的浓度为10-50mmol/l，优选为20-40mmol/l；再优选为30-40mmol/l。所述的络氨酸的浓度为10-100mmol/l，优选为20-80mmol/l，再优选为50-60mmol/l。本发明提供的试剂盒按照本领域常规方法制备。本发明还提供了5’-核苷酸酶测定试剂盒在测定血清5’-核苷酸酶含量中的应用。与现有试剂盒相比，本发明的有益效果在于：(1)本发明公开的试剂盒采用过氧化物酶法检测样品中5’-核苷酸酶的含量，适用于全自动生化分析仪，操作简单，自动化程度高，适合再临床上广泛应用；(2)本发明在实施过程中控制试剂盒中三种酶，即嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)、黄嘌呤氧化酶(xod)和过氧化物酶(pod)的浓度比为1：1.25-3：4.2-8.75有效提高了检测的准确性，提高了检测的灵敏度；(3)本发明在实施过程中控制4-氨基安替比林与n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺的浓度比为0.5-3：1，可以有效提高显色效率，提高检测的准确度、灵敏度和精密度，为临床检测5’-核苷酸酶创造有利条件。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种高准确度5’-核苷酸酶测定试剂盒包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，其的成分及相应含量为：试剂r1：试剂r2：实施例2一种高准确度5’-核苷酸酶测定试剂盒包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，其的成分及相应含量为：试剂r1：试剂r2：实施例3一种高准确度5’-核苷酸酶测定试剂盒包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，其的成分及相应含量为：试剂r1：试剂r2：实施例4一种高准确度5’-核苷酸酶测定试剂盒包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，其的成分及相应含量为：试剂r1：试剂r2：实施例5一种高准确度5’-核苷酸酶测定试剂盒包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，其的成分及相应含量为：试剂r1：试剂r2：对比例1与实施例5的区别在于所用的缓冲溶液为tris-hcl缓冲液，其他操作与步骤与实施例5相同。对比例2与实施例5的区别在于：嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)、黄嘌呤氧化酶(xod)和过氧化物酶(pod)的浓度比为1：5：10，即嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)100u/l、黄嘌呤氧化酶(xod)500u/l和过氧化物酶(pod)1000u/l；其他操作与步骤与实施例5相同。对比例3与实施例5的区别在于：嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)、黄嘌呤氧化酶(xod)和过氧化物酶(pod)的浓度比为1：0.5：2，即嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)100u/l、黄嘌呤氧化酶(xod)50u/l和过氧化物酶(pod)200u/l；其他操作与步骤与实施例5相同。对比例4与实施例5的区别在于：4-氨基安替比林与n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺的浓度比为5：1，即4-氨基安替比林1.8mmol/l，n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺0.36mmol/l；其他操作与步骤与实施例5相同。对比例5与实施例5的区别在于：4-氨基安替比林与n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺的浓度比为0.2：1，即4-氨基安替比林1.8mmol/l，n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺9mmol/l；其他操作与步骤与实施例5相同。试验例1准确度试验将实施例1-5以及对比例1-5所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒分别对质控品进行测定的结果，其中质控品中的5’-核苷酸酶的浓度为20u/l，测定结果见表1：表1由上表1的检测结果可以看出本发明实施例1-5制备的试剂盒的检测结果偏差较小，实施例5制备的试剂盒r2试剂中加入了浓度比为1:2的脯氨酸和络氨酸使检测结果偏差最小,而对比例1改变缓冲溶液的种类对检测结果的准确性具有一定程度的影响，使检测偏差增大，而对比例2-5改变试剂盒中某组分的质量比不在本发明公开的范围内时，其检测结果偏差明显增大，即检测的准确性明显降低。试验例2精密度检测将实施例1-5以及对比例1-5所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行sd和cv的计算，结果如下表2：表2根据上表2的检测结果可以看出本发明实施例1-5制备的试剂盒的精密度较好，实施例5制备的试剂盒的精密度最好,而对比例1改变缓冲溶液的种类对检测结果的精密度具有一定程度的影响，使精密度降低，而对比例2-5改变试剂盒中某组分的质量比不在本发明公开的范围内时，其精密度明显降低。试验例3稳定性试验将实施例3-5和对比例1-5制备的试剂盒中的试剂进行反应并分别在2-8℃检测酶活性，具体检测结果见表3。表3时间(h)实施例3实施例4实施例5对比例1对比例2对比例3对比例4对比例5110010010098979897986991001009695979495129998999595969095249898989492938892369797989090918688489797988887858584729696978683808078969495978076757674根据上表3的检测结果可以明显看出本发明实施例3-5制备的试剂盒的稳定性明显高于对比例1-5制备的试剂盒的稳定性，且实施例5制备的试剂盒的稳定性最高，96小时酶活性仅下降3％左右，能够长期保持稳定。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12