本发明涉及一种具有保肝作用的复合菌剂，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：酒精性肝损伤,是由于长期大量的摄入酒精及含有酒精的饮料而导致肝脏损伤的发生,中华医学会将酒精性肝损伤分为种,即轻型酒精性肝损伤、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化及酒精性肝硬化。社会的快速发展,生活水平的日益提高,工作压力的逐渐增大等等,使酒精用量不断攀升,且此现象呈全球发展趋势,酒精滥用、酗酒、酒精依赖等问题在当今社会也较为显著。在我国饮酒人数在快速增长,酒精给人体带来的危害也渐渐的凸显出来。酒精性肝病是由于长期大量的饮酒导致的化学性肝损伤,初期常表现为脂肪肝,进而发展为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化及酒精性肝硬化等肝脏疾病。目前酒精性肝损伤的发病机制尚未明确,有研究认为酒精在肝脏的代谢过程中主要扰乱营养物质代谢并通过氧化应激、炎症和免疫反应产生损伤等,同时伴有局部缺氧、营养不良和病毒的叠加作用等多种因素加重肝脏病理性损伤的进程。酒精摄入对肝脏损伤程度的大小,与肝内乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的多态性的变化有关。长期大量饮酒是导致酒精性肝病的发病基础。乙醇、乙醛等代谢物直接或间接的损伤肝脏细胞,至肝脏代谢失衡、肝功能异常,使其产生脂肪变性、炎症反应及纤维化等。不同阶段的酒精性肝损伤的病理变化及其发病机制各不相同,酒精性脂肪肝的发生主要与脂质代谢、载脂蛋白缺乏、脂肪酸氧化受阻等有关。酒精性肝炎的发生与单核细胞毒性作用、氧自由基增加、肝内谷肤甘肤缺少、细胞因子参与和炎症介质积聚有关。酒精性肝纤维化的发生与乙醛引起反复炎症,胶原合成增加及降解减少等有关。益生菌是一类对人体及嘴乳动物基本无毒副作用的微生物，当给予机体足够劍量后，它们能对机体产生有益的作用。益生菌对肠道菌群的调节作用、对肠道屏障的保护作用、及对肠道免疫功能的影响巳经被广泛报道。现有技术已经发现有某些特定株系的鼠李糖乳杆菌，植物乳杆菌可能是通过调节胆汁酸代谢，减轻肝脏的炎症反应，减少肝脏脂质沉积，起到非酒精性脂肪肝的作用，但是益生菌对酒精性肝损失的研究还是比较少。本发明旨在提供一种具有保肝作用的复合菌剂，其能够有效在体内解酒，并且显著减轻肝损伤，从而达到良好的保肝效果。技术实现要素：本发明的目的是提供一种具有保肝作用的复合菌剂，其能够有效在体内解酒，并且显著减轻肝损伤，从而达到良好的保肝效果。中国专利201310308577(申请人扬州大学)公开了发酵乳制备的嗜热链球菌grx11及应用，所述嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)grx11的保藏号为cgmccno：7697。该菌株具有优良的凝乳效果，可以制备风味优良的酸奶。中国专利2015106977109(申请人中国农业大学)公开了一种副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)h9。所述副干酪乳杆菌菌株为h9，分类命名为lactobacillusparacasei，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为cgmccno.4780。该副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)h9表现出良好的产黏多糖的能力，而黏多糖被认为具有抗癌功能，并增加酸奶的粘稠度；对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌能进行有效抑制；具有良好的热稳定性、降胆固醇活性、降血压活性和抗氧化活性。本申请人研究团队发现，单独使用嗜热链球菌grx11或者副干酪乳杆菌h9均无明显的减轻酒精肝损伤的效果，但是联合使用具有较为优异的减轻酒精肝损伤的效果。然而，在研究中发现，似乎只有在进行酒精肝损伤造模之前至少一周开始灌服，才能显示出明显的效果，在已经造模(酒精肝损伤发生)后，则无明显效果。海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等。是一种安全、可靠的天然糖类。海藻糖在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在，如人们日常生活中食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。它在临床上可有效的增加免疫系统活性。研发团队进一步研究，如果在复合菌剂中复配海藻糖，则使用时间不再局限于需要在酒精性肝损伤之前一段时间使用，造成肝损伤后使用同样具有很好的促进肝损伤修复的作用。而海藻糖本身还具有很好的保健作用，使得该整体配方不仅仅具有保肝作用，还具有增强免疫力，调节免疫等效果。本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。一种具有保肝作用的复合菌剂，其包括：嗜热链球菌grx11以及副干酪乳杆菌h9。所述嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)grx11的保藏号为cgmccno：7697。所述副干酪乳杆菌h的保藏号为cgmccno.4780。作为进一步优选，所述复合菌剂还包含海藻糖。所述复合菌剂可以做成压片糖果，粉状，胶囊等。所述复合菌剂还可以用于发酵食品做成保健食品。所述食品优选为水果和乳制品。本发明的优点：(1)嗜热链球菌grx11以及副干酪乳杆菌h9都是安全性很高的食品用菌，安全性有保障。(2)对于酒精性肝损伤具有显著的效果。(3)海藻糖有协同混合菌解酒，并且保护肝功能的作用，且其本身具有良好的保健活性。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明的具体实施例如以下说明。本发明用到的嗜热链球菌grx11以及副干酪乳杆菌h9均为获赠得到。实施例1体内抗酒精性肝损伤测定(预服嗜热链球菌试验组)1.将嗜热链球菌grx11菌液、副干酪乳杆菌h9菌液按照常规方法活化培养。培养基调整菌液浓度到107cfu/ml。再配一组混合组：将嗜热链球菌grx11菌液、副干酪乳杆菌h9活化后按照菌体数量1:1的浓度，混合调整菌液总浓度到107cfu/ml。2.选择健康的icr雄性小鼠50只，体重20-25g，饲养1周后开始正式实验，随机分为5组，每组10只，各组之间小鼠体重无统计学差异。将小鼠分为5组。各组别试验开始第1周每天灌胃嗜热链球菌grx11菌液(0.2ml/25g的剂量)，第2周各组开始灌胃，具体如下所示。各组别第一次灌胃使用纯净水或者菌液(0.2ml/25g的剂量)；半小时后再给与小鼠第二次灌胃，第1组使用纯净水，第2-5组均使用40％乙醇水溶液(0.2ml/25g的剂量)。第1组：纯净水+纯净水对照组(阴性对照组)；第2组：纯净水+40％乙醇浓度处理组(阳性对照组)；第3组：嗜热链球菌grx11菌液+40％乙醇浓度处理组；第4组：副干酪乳杆菌h9菌液+40％乙醇浓度处理组；第5组：混合菌液+40％乙醇浓度处理组。毎只小鼠在第二次灌胃(乙醇灌胃)30min和2h的时候毛细管眼内眦取血两次，取血后，血液室温放置120min，2500rpm离心15min，获得血清，采用气相色谱法测定其酒精浓度。具体结果如表1-a所示。表1-a乙醇灌胃后的血清酒精浓度(mg/dl)30min120min嗜热链球菌grx11菌液314.35±25.241133.65±13.531副干酪乳杆菌h9菌液324.51±43.531127.53±11.211混合菌液284.35±41.631117.84±9.721阴性对照00阳性对照315.31±59.96139.81±11.47注：t检验,l：p<0.05(与阴性对照组比较)；2：p<0.05(和阳性对照组比较)结果可见，当第1周仅仅预服嗜热链球菌grx11菌液时，各组相对于阳性对照组，血清酒精浓度无统计学差异。检测肝功能：采用alt试剂盒和ast试剂盒(建成生物)测定血清中alt和ast活性。结果如表1-b所示。表1-b乙醇灌胃后的各组小鼠肝功能测定altalt嗜热链球菌grx11菌液43.52±8.111109.52±8.431副干酪乳杆菌h9菌液42.73±6.321106.25±11.371混合菌液40.69±3.541103.68±7.541阴性对照33.08±7.3553.18±7.99阳性对照45.12±9.51110.19±11.73注：t检验,l：p<0.05(与阴性对照组比较)；2：p<0.05(和阳性对照组比较)结果可见，当第1周仅仅预服嗜热链球菌grx11菌液时，各组相对于阳性对照组无统计学差异，不能够明显降低alt和ast，说明对肝功能无明显的保护作用。实施例2体内抗酒精性肝损伤测定(预服副干酪乳杆菌试验组)1.菌液配置方法同实施例1。2.选择健康的icr雄性小鼠50只，体重20-25g，饲养1周后开始正式实验，随机分为5组，每组10只，各组之间小鼠体重无统计学差异。将小鼠分为5组。各组别试验开始第1周每天灌副干酪乳杆菌h9菌液(0.2ml/25g的剂量)，第2周各组开始灌胃，具体如下所示。各组别第一次灌胃使用纯净水或者菌液(0.2ml/25g的剂量)；半小时后再给与小鼠第二次灌胃，第1组使用纯净水，第2-5组均使用40％乙醇水溶液(0.2ml/25g的剂量)。第1组：纯净水+纯净水对照组(阴性对照组)；第2组：纯净水+40％乙醇浓度处理组(阳性对照组)；第3组：嗜热链球菌grx11菌液+40％乙醇浓度处理组；第4组：副干酪乳杆菌h9菌液+40％乙醇浓度处理组；第5组：混合菌液+40％乙醇浓度处理组。毎只小鼠在第二次灌胃(乙醇灌胃)30min和2h的时候毛细管眼内眦取血两次，取血后，血液室温放置120min，2500rpm离心15min，获得血清，采用气相色谱法测定其酒精浓度。具体结果如表2-a所示。表2-a乙醇灌胃后的血清酒精浓度(mg/dl)30min120min嗜热链球菌grx11菌液310.53±36.541130.08±8.461副干酪乳杆菌h9菌液314.32±75.431131.21±11.271混合菌液310.87±60.951124.50±11.261阴性对照00阳性对照329.14±54.65134.84±22.33注：t检验,l：p<0.05(与阴性对照组比较)；2：p<0.05(和阳性对照组比较)结果可见，当第1周仅仅预服副干酪乳杆菌时，各组相对于阳性对照组，血清酒精浓度无统计学差异。检测肝功能：采用alt试剂盒和ast试剂盒(建成生物)测定血清中alt和ast活性。结果如表2-b所示。表2-b乙醇灌胃后的各组小鼠肝功能测定altalt嗜热链球菌grx11菌液45.53±6.721103.41±8.751副干酪乳杆菌h9菌液44.75±5.321102.30±7.051混合菌液45.66±7.39197.99±6.021阴性对照29.32±6.6450.19±9.53阳性对照46.55±8.45108.66±11.73注：t检验,l：p<0.05(与阴性对照组比较)；2：p<0.05(和阳性对照组比较)结果可见，当第1周仅仅预服副干酪乳杆菌菌液时，各组相对于阳性对照组无统计学差异，不能够明显降低alt和ast，说明对肝功能无明显的保护作用。实施例3体内抗酒精性肝损伤测定(预服混合菌液试验组)1.菌液配置方法同实施例1。2.选择健康的icr雄性小鼠50只，体重20-25g，饲养1周后开始正式实验，随机分为5组，每组10只，各组之间小鼠体重无统计学差异。将小鼠分为5组。各组别试验开始第1周每天灌混合菌液(0.2ml/25g的剂量)，第2周各组开始灌胃，具体如下所示。各组别第一次灌胃使用纯净水或者菌液(0.2ml/25g的剂量)；半小时后再给与小鼠第二次灌胃，第1组使用纯净水，第2-5组均使用40％乙醇水溶液(0.2ml/25g的剂量)。第1组：纯净水+纯净水对照组(阴性对照组)；第2组：纯净水+40％乙醇浓度处理组(阳性对照组)；第3组：嗜热链球菌grx11菌液+40％乙醇浓度处理组；第4组：副干酪乳杆菌h9菌液+40％乙醇浓度处理组；第5组：混合菌液+40％乙醇浓度处理组。毎只小鼠在第二次灌胃(乙醇灌胃)30min和2h的时候毛细管眼内眦取血两次，取血后，血液室温放置120min，2500rpm离心15min，获得血清，采用气相色谱法测定其酒精浓度。具体结果如表3-a所示。表3-a乙醇灌胃后的血清酒精浓度(mg/dl)30min120min嗜热链球菌grx11菌液304.62±28.071118.43±14.691副干酪乳杆菌h9菌液298.80±21.491114.91±12.081混合菌液164.66±15.421251.50±6.3212阴性对照00阳性对照337.27±40.08127.86±14.15注：t检验,l：p<0.05(与阴性对照组比较)；2：p<0.05(和阳性对照组比较)结果可见，当第1周预服混合菌液后，仅仅单菌溶液组酒精浓度仍然非常高，而混合菌组相对于阳性对照组，血清酒精浓度有统计学差异(p<0.05)。说明有协同解酒的作用。检测肝功能：采用alt试剂盒和ast试剂盒(建成生物)测定血清中alt和ast活性。结果如表3-b所示。表3-b乙醇灌胃后的各组小鼠肝功能测定altalt嗜热链球菌grx11菌液41.33±7.17194.57±8.841副干酪乳杆菌h9菌液42.08±6.12193.54±7.651混合菌液32.07±6.231263.32±5.4612阴性对照31.86±7.4354.84±4.43阳性对照45.88±8.64108.43±9.29注：t检验,l：p<0.05(与阴性对照组比较)；2：p<0.05(和阳性对照组比较)结果可见，当第1周预服混合菌液后，仅仅单菌溶液和阳性组比较，轻微下降，但是不具有统计学差异。而混合菌液组和阳性组比较，能够明显降低alt和ast，具有统计学差异(p<0.05)，说明2种菌有协同保护作用，alt和ast下降更加明显。实施例4体内抗酒精性肝损伤测定(普通试验组，未提前预灌胃)1.将嗜热链球菌grx11菌液、副干酪乳杆菌h9菌液按照常规方法活化培养。培养基调整菌液浓度到107cfu/ml。再配一组混合组：将嗜热链球菌grx11菌液、副干酪乳杆菌h9活化后按照菌体数量1:1的浓度，混合调整菌液总浓度到107cfu/ml。2.选择健康的icr雄性小鼠50只，体重20-25g，饲养1周后开始正式实验，随机分为5组，每组10只，各组之间小鼠体重无统计学差异。将小鼠分为5组。各组别试验均未提前灌胃任何菌液，从实验第一天灌胃具体如下所示。各组别第一次灌胃使用纯净水或者菌液(0.2ml/25g的剂量)；半小时后再给与小鼠第二次灌胃，第1组使用纯净水，第2-5组均使用40％乙醇水溶液(0.2ml/25g的剂量)。第1组：纯净水+纯净水对照组(阴性对照组)；第2组：纯净水+40％乙醇浓度处理组(阳性对照组)；第3组：嗜热链球菌grx11菌液+40％乙醇浓度处理组；第4组：副干酪乳杆菌h9菌液+40％乙醇浓度处理组；第5组：混合菌液+40％乙醇浓度处理组。毎只小鼠在第二次灌胃(乙醇灌胃)30min和2h的时候毛细管眼内眦取血两次，取血后，血液室温放置120min，2500rpm离心15min，获得血清，采用气相色谱法测定其酒精浓度。具体结果如表4-a所示。表4-a乙醇灌胃后的血清酒精浓度(mg/dl)30min120min嗜热链球菌grx11菌液312.32±32.991128.33±12.691副干酪乳杆菌h9菌液318.83±52.341127.31±10.081混合菌液304.64±40.531112.64±7.921阴性对照00阳性对照330.22±38.94135.64±9.95注：t检验,l：p<0.05(与阴性对照组比较)；2：p<0.05(和阳性对照组比较)结果可见，当不提前给与混合菌液灌胃时，各组相对于阳性对照组，血清酒精浓度无统计学差异。检测肝功能：采用alt试剂盒和ast试剂盒(建成生物)测定血清中alt和ast活性。结果如表4-b所示。表4-b乙醇灌胃后的各组小鼠肝功能测定altalt嗜热链球菌grx11菌液46.54±5.921102.32±8.691副干酪乳杆菌h9菌液45.64±6.621104.40±11.751混合菌液45.31±7.39199.87±8.781阴性对照31.21±6.7353.46±8.18阳性对照47.33±6.22109.755±9.34注：t检验,l：p<0.05(与阴性对照组比较)；2：p<0.05(和阳性对照组比较)结果可见，当不提前给与混合菌液灌胃时，各组相对于阳性对照组没有统计学意义，不能够明显降低alt和ast。实施例5体内抗酒精性肝损伤测定(普通海藻糖试验组)1.将嗜热链球菌grx11菌液、副干酪乳杆菌h9菌液按照常规方法活化培养。培养基调整菌液浓度到107cfu/ml。再配一组混合组：将嗜热链球菌grx11菌液、副干酪乳杆菌h9活化后按照菌体数量1:1的浓度，混合调整菌液总浓度到107cfu/ml。2.配置海藻糖溶液：0.5mol/l。3.选择健康的icr雄性小鼠60只，体重20-25g，饲养1周后开始正式实验，随机分为6组，每组10只，各组之间小鼠体重无统计学差异。将小鼠分为6组。各组别试验均未提前灌胃任何菌液，从实验第一天灌胃具体如下所示。各组别第一次灌胃使用纯净水或者菌液(0.2ml/25g的剂量)；半小时后再给与小鼠第二次灌胃，第1组使用纯净水，第2组使用40％乙醇水溶液(0.2ml/25g的剂量)，第3-6组使用40％乙醇水溶液(0.2ml/25g的剂量)和海藻糖溶液。第1组：纯净水+纯净水对照组(阴性对照组)；第2组：纯净水+40％乙醇浓度处理组(阳性对照组)；第3组：嗜热链球菌grx11菌液+40％乙醇浓度处理组+0.05ml海藻糖溶液；第4组：副干酪乳杆菌h9菌液+40％乙醇浓度处理组+0.05ml海藻糖溶液；第5组：混合菌液+40％乙醇浓度处理组+0.05ml海藻糖溶液。第6组：纯净水+40％乙醇浓度处理组+0.05ml海藻糖溶液(海藻糖对照组)。毎只小鼠在第二次灌胃(乙醇灌胃)30min和2h的时候毛细管眼内眦取血两次，取血后，血液室温放置120min，2500rpm离心15min，获得血清，采用气相色谱法测定其酒精浓度。具体结果如表5-a所示。表5-a乙醇灌胃后的血清酒精浓度(mg/dl)注：t检验,l：p<0.05(与阴性对照组比较)；2：p<0.05(和阳性对照组比较)结果可见，虽然未提前给与混合菌液灌胃，但是混合菌液组同时给与海藻糖溶液相对于阳性对照组，血清酒精浓度有统计学差异(p<0.05)。说明海藻糖有协同混合菌解酒的作用，而单独使用海藻糖并无解酒能力。检测肝功能：采用alt试剂盒和ast试剂盒(建成生物)测定血清中alt和ast活性。结果如表5-b所示。表5-b乙醇灌胃后的各组小鼠肝功能测定altalt嗜热链球菌grx11菌液43.41±3.621101.22±8.791副干酪乳杆菌h9菌液45.54±5.921105.45±7.331混合菌液34.63±4.491269.32±4.5912阴性对照31.23±3.4256.39±8.84阳性对照47.53±5.32108.65±11.41海藻糖对照46.79±6.11107.87±13.20注：t检验,l：p<0.05(与阴性对照组比较)；2：p<0.05(和阳性对照组比较)结果可见，虽然未提前给与混合菌液灌胃，但是混合菌液组同时给与海藻糖溶液相对于阳性对照组(p<0.05)，能够明显降低alt和ast，说明对肝功能有明显的保护作用，海藻糖有协同混合菌保护肝功能的作用，但是海藻糖单独使用并无明显护肝作用。综上所述，本发明团队在研究和实践过程中，本申请人研究团队发现，单独使用嗜热链球菌grx11或者副干酪乳杆菌h9均无明显的减轻酒精肝损伤的效果，但是联合使用具有较为优异的减轻酒精肝损伤的效果。然而，在研究中发现，似乎只有在进行酒精肝损伤造模之前至少一周开始灌服，才能显示出明显的效果，考虑和混合菌调动体内体外解酒能力有关。如果在复合菌剂中复配海藻糖，则使用时间不再局限于需要在酒精性肝损伤之前一段时间使用，造成肝损伤后使用同样具有很好的促进肝损伤修复的作用。说明海藻糖有协同混合菌保护肝功能的作用。术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页12