一种两段式低氮低磷胁迫微藻培养方法与流程

本发明属于微藻培养
技术领域：
，具体涉及一种两段式低氮低磷胁迫微藻细胞培养方法。
背景技术：
：微藻是藻类中小型藻类的总称，其作为地球上的先锋物种是能利用光能、二氧化碳和水在其细胞内合成各种有机物的自养生物，对环境的适应能力极强。这种极强的适应能力与藻类在长期进化过程中形成的高效代谢路径和大量产生并积累的各类损伤修复活性物质息息相关。已有大量的研究报道指出微藻在营养元素缺乏胁迫的条件下，细胞内会产生并积累各种损伤修复活性物质，其中很重要的一类为多不饱和脂肪酸(pufas)。pufas是一类双键数目大于等于两个的脂肪酸，其在机体各项生理功能调节中发挥着重要作用。同时pufas对人体也有重要的生理功能，其能调节人体的脂质代谢，促进生长发育，治疗和预防心脑血管疾病。此外其在免疫调节、抗癌、减肥、延缓衰老、美容等方面均具有重要的生理作用。许多富含pufas的食品资源开发正成为功能食品研究的热点领域，提取出的pufas已在保健食品和医学研究中得到应用。微藻细胞正常生长代谢需要各种无机营养元素，n、p在这些营养元素中尤为重要，其中n元素是构成蛋白质、核酸、氨基酸等各种生物大分子的组成元素，p元素则构成核酸、atp、nadph和生物膜系统。已有相当多的研究报告指出，微藻细胞培养基中n和p元素含量对微藻的生长速率和油脂含量影响巨大，在一定浓度范围内n和p元素提供越充足微藻生长速度越快；而当出现n和p元素缺乏时微藻细胞内油脂特别是由pufas构成的油脂的产生和积累量明显增加。这可能是因为蛋白质合成途径受到阻碍，光合作用获得的nadph更多的流向油脂合成途径，从而使微藻细胞中pufas构成的油脂含量提高。不同藻类在不同n、p营养元素含量环境中培养，其细胞内多不饱合脂肪酸产生和积累量明显不同，因此通过优化微藻细胞培养液的营养成分，探索控制n、p营养元素供给量，以实利用是微藻生产制造多不饱和脂肪酸和其它活性物质广阔的市场前景。当前并没有利用低n、p营养元素，对微藻进行胁迫培养，进而使其大量产生并积累损伤修复活性物质的方法公开。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是：一种两段式低氮低磷胁迫微藻细胞培养方法，通过此方法能够通过两段式培养，实现微藻细胞在最适培养条件下快速增值生长，在低氮低磷胁迫培养条件下大量产生并积累具有多种生理活性和重要市场应用价值的多不饱和脂肪酸(pufas)。是一种高效生产多不饱和脂肪酸(pufas)等损伤修复活性物质的好方法。为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种两段式低氮低磷胁迫微藻细胞培养方法。所述的方法如下，其特征在于包括如下步骤：(1)在最适培养条件下培养获得对数期微藻细胞预培养液；(2)离心对数期微藻细胞预培养液，收集得到薇藻细胞；(3)将收集得到的薇藻细胞重新放大培养于低氮、低磷胁迫培养基中；(4)25℃光照通气培养10-14天。即可获得多不饱和脂肪酸(pufas)积累量显著提高的微藻细胞。优选的，步骤(1)中最适培养条件为光照强度为100μmol/(m2·s)、温度为25℃，预培养获得的对数期微藻细胞培养液为使用衣藻、小球藻、三角褐指藻作为藻种进行起始接种后，培养养至藻细胞浓度为1.0x106个/l-1.2x106个/l范围内的微藻细胞培养液。优选的，步骤(2)中离心收集时离心机转速为2000-5000rpm，离心时间为3-5min。优选的，步骤(3)中用于放大培养的低氮低磷胁迫培养以tap和bg11培养基配方为基础优化，优化后的1x培养液中总氮(以n计)浓度小于0.200mg/l，总磷浓度小于0.010mg/l，其它成分不变。优选的，当使用衣藻、小球藻、三角褐指藻作为藻种进行放大培养时，所采用的培养基分别为优化后的低氮低磷tap培养基、低氮低磷bg11、低氮低磷bg11。优选的，步骤(4)中25℃光照通气培养的光照强度为100μmol/(m2·s)，通入的气体为无菌空气。培养时间依据微藻藻种不同而不同。采用衣藻、小球藻、三角褐指藻作藻种时，培养时间分别为10天、12天和14天。有益效果1、本方法所采用的两段式培养即：在预培养阶段以最适条件(25℃，100μmol/(m2·s))培养薇藻细胞从起始接种量到对数期(培养液中微藻细胞浓度范围在1.0x106个/l—1.2x106个/l)，然后再将离心收集后的薇藻细胞重新放大培养于低氮、低磷胁迫培养基中用于生产积累多不饱和脂肪(pufas)。这种两段式培养操作，能大大缩短培养周期，降低细胞死亡率，提高损伤修复活性物质生产效率。2、本发明中所使用的低氮、低磷胁迫培养基配方，是发明人进行多次反复试验、调整得到，具有诱导微藻细胞高效产生并大量积累多不饱和脂酸(pufas)等损伤修复活性物质的作用，同时对微藻细胞其它生理活性影响较小、引起死亡率较低的一种培养基配方。总之，本发明：一种两段式低氮低磷胁迫微藻细胞培养方法，能够通过两段式培养，实现微藻细胞在最适培养条件下快速增值生长，并在低氮低磷胁迫培养条件下大量产生并积累具有多种生理活性和重要市场应用价值的多不饱和脂肪酸(pufas)。是一种高效生产多不饱和脂肪酸(pufas)等损伤修复活性物质的好方法。附图说明图1培养装置(三角瓶)示意图具体实施方式下面结合说明书附图介绍本发明的较佳实施例，举例证明本发明可以实施，通过向本领域中的技术人员完整介绍本发明，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，其保护范围并非仅限于文中提到的实施例，本文的附图和说明本质上是举例说明而不是限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或已公开。实施例1：采用衣藻(sp.cw15，购于美国杜克大学藻种库)细胞作为藻种进行一种两段式低氮低磷胁迫微藻细胞培养方法，具体步骤如下：1.培养获得对数期微藻细胞预培养液。配制tap培养基6l，具体配方如下表1所示，灭菌后向其中接入衣藻细胞，将接种后的培养液置于25℃，日光灯光照强度为100μmol/(m2·s)，转速为20rpm的摇床光照培养箱中，培养7天，即可获得处于对数期的衣藻细胞预培养液。表1tap培养基配方2.检测对数期预培养液中衣藻细胞浓度。摇匀衣藻细胞预培养液后利用血球计数板在显微镜下进行计数。计算对数期预培养液中衣藻细胞浓度为1.14x106个/l。3.均分离心。将6l预培养衣藻细胞液摇匀后，分别均分加入到1l的离心管中，设置离心转速为2000rpm，离心5分钟。弃去上清后收集衣藻细胞待用。4.分组放大培养。分别配制tap培养液(配方见表1)和低氮低磷胁迫tap培养液3l，低氮低磷胁迫tap培养基具体配方如下表2所示。分别使用上述配置灭菌后的培养液，将步骤3离心收集的微藻细胞对应重悬后，扩大培养于编号为甲、乙的两组共计6个灭菌三角瓶中(每组三瓶，各瓶如附图1所示进行连接)，其中甲组为正常tap培养液，乙组为低氮低磷胁迫tap培养液。甲、乙组各三角瓶都通过1口通入无菌空气，封口后将甲、乙组各瓶都置于25℃，光照强度为100μmol/(m2·s)的关照培养箱中培养10天。表2低氮低磷胁迫tap培养配方化合物终浓度cacl2·2h2o84.6mg/lmgso4·7h2o204.2mg/lkcl324.1mg/l冰醋酸1mlnaedta·2h2o45.05mg/lznso4·7h2o39.03mg/lh3bo311.41mg/lmncl2·4h2o7916.40mg/lfeso4·7h2o9146.20mg/lcocl2·6h2o2926.54mg/lcuso4·6h2o1720mg/lna7mo7o241129mg/l5.油脂和多不饱和脂肪酸(pufas)含量检测。10天后分别离心收集甲、乙组各三角瓶中的衣藻细胞，测定收集细胞油脂和多不饱和脂肪酸含量。油脂含量测定采用尼罗红-荧光光谱法，用体积分数4％的二甲基亚砜(dmso)水溶液重悬离心后的部分藻细胞，至od750＝0.3，尼罗红质量浓度0.8μg/ml，避光40℃水浴恒温10min，激发波长520nm测定荧光值后与标准曲线对比计算油脂含量。多不饱和脂肪酸含量测定方法参照《动植物油脂具有顺,顺1,4-二烯结构的多不饱和脂肪酸的测定》(测定方法参见国标gb/t21495-2008/iso7847:1987)。6.实验结果。衣藻细胞损伤修复活性物质含量检测结果见表3。实验结果显示乙组衣藻细胞中多不饱和脂肪酸(pufas)含量都显著性高于甲组。表3油脂和多不饱和脂肪酸(pufas)含量检测结果实施例2：采用小球藻(sp.dh8248，实验室保存，采集于武汉东湖)细胞作为一种两段式低氮低磷胁迫微藻细胞培养方法，具体步骤如下：1.培养获得对数期微藻细胞预培养液。配制tap培养基6l，具体配方如下表1所示，灭菌后向其中接入小球细胞，将接种后的培养液置于25℃，日光灯光照强度为100μmol/(m2·s)，转速为20rpm的摇床光照培养箱中，培养7天，即可获得处于对数期的小球细胞预培养液。表4bg11培养基配方化合物终浓度nano31.5g/lk2hpo40.04g/lmgso4·7h2o0.075g/lcacl2·2h2o0.036g/lna2co30.02g/l柠檬酸0.006g/l柠檬酸铁铵0.006g/ledtana20.001g/lh3bo42.86mg/lmncl2·4h2o1.81mg/lznso4·4h2o0.222mg/lna2moo4·2h2o0.39mg/lcuso4·5h2o0.079mg/lco(no3)2·6h2o0.049mg/l2.检测对数期预培养液中小球藻细胞浓度。摇匀小球藻细胞预培养液后利用血球计数板在显微镜下进行计数。计算对数期预培养液中小球藻细胞浓度为1.01x106个/l。3.均分离心。将6l预培养小球藻细胞液摇匀后，分别均分加入到1l的离心管中，设置离心转速为2000rpm，离心5分钟。弃去上清后收集小球藻细胞待用。4.分组放大培养。分别配制bg11培养液(配方见表4)和低氮低磷胁迫bg11培养液3l，低氮低磷胁迫bg11培养基具体配方如下表5所示。分别使用配置灭菌后的培养液，将步骤3离心收集的微藻细胞对应重悬后，扩大培养于编号为甲、乙的两组共计6个灭菌三角瓶中(每组三瓶，各瓶如附图1所示进行连接)，其中甲组为正常bg11培养液，乙组为低氮低磷胁迫bg11培养液。甲、乙组各三角瓶都通过1口通入无菌空气，封口后将甲、乙组各瓶都置于25℃，光照强度为100μmol/(m2·s)的光照培养箱中培养12天。表5低氮低磷胁迫优化bg11培养配方化合物终浓度kcl0.034g/lmgso4.7h2o0.075g/lcacl2.2h2o0.036g/lna2co30.02g/l柠檬酸0.006g/l柠檬酸铁铵0.006g/ledtana20.001g/lh3bo42.86mg/lmncl2.4h2o1.81mg/lznso4.4h2o0.222mg/lna2moo4.2h2o0.39mg/lcuso4.5h2o0.079mg/lcocl20.022mg/l5.油脂和多不饱和脂肪酸(pufas)含量检测。12天后分别离心收集甲、乙组三角瓶中的小球藻细胞，测定收集细胞油脂和多不饱和脂肪酸含量。油脂含量测定采用尼罗红-荧光光谱法，用体积分数4％的二甲基亚砜(dmso)水溶液重悬离心后的部分藻细胞，至od750＝0.3，尼罗红质量浓度0.8μg/ml，避光40℃水浴恒温10min，激发波长520nm测定荧光值后与标准曲线对比计算油脂含量。多不饱和脂肪酸含量测定方法参照《动植物油脂具有顺,顺1,4-二烯结构的多不饱和脂肪酸的测定》((测定方法参见国标gb/t21495-2008/iso7847:1987))。6.实验结果。小球藻细胞油脂和多不饱和脂肪酸(pufas)检测结果见表6，实验结果显示乙组小球藻细胞中多不饱和脂肪酸(pufas)含量都显著性高于甲组。表6油脂和多不饱和脂肪酸(pufas)含量检测结果当前第1页12