DNA的产生方法及DNA片段连接用试剂盒与流程

本发明涉及使两种以上的dna片段在碱基序列同源的区域彼此之间相互连接而得到直链状或环状的dna的方法、以及在该方法中使用的dna片段连接用试剂盒。

本申请基于在2017年7月5日于日本申请的日本特愿2017-132084号以及在2017年12月1日于日本申请的日本特愿2017-231732而主张优先权，并将其内容援引于此。

背景技术：

存在将多个直链状双链dna片段连接来产生直链状或环状的双链dna的方法。通过该方法，能够得到难以在化学合成中合成的长链的双链dna。作为连接直链状双链dna片段的方法，主要有infusion法(参照专利文献1。)和gibsonassembly法(参照专利文献2及专利文献3。)。

infusion法是使用具备对各双链dna片段的末端15个碱基的同源序列进行识别并使其融合的功能的infusion酶来进行连接反应的方法。具体而言，首先，利用pcr，在连接目标的双链dna片段的末端附加由同一的碱基序列构成的同源区域。通过将在两末端附加了15个碱基的同源区域后的两个双链dna片段彼此与infusion酶混合并进行温育而使其连接。

另一方面，在gibsonassembly法中，首先，用具有核酸外切酶活性的酶消化第一dna分子的远端区域和第二dna分子的近端区域，使各自的同源区域(为了相互特异性地进行杂交而具有充分长度的序列同一性的区域)为单链状态。接着，使两者特异性地退火而连接后，修复空隙、切口，由此得到完整的双链dna的连接体。例如，在专利文献2中记载了，将1.6kbp和1.4kbp的双链dna片段用具备核酸外切酶活性的t4dna聚合酶消化而成单链状态后，在reca的存在下进行连接，之后添加dntp和dna连接酶且利用该t4dna聚合酶的聚合酶活性来填补空隙并修复切口，得到3kbp的双链dna。

此外，作为利用reca来连接多个直链状双链dna片段的方法，在专利文献4中公开了如下方法：在reca家族重组酶或具有重组活性的蛋白质的存在下，通过对多个直链状双链dna片段和dna连接酶进行温育，制作由多个直链状双链dna片段排成一列地连接而成的直链状双链dna。该方法中，通过使用reca家族重组酶等，抑制了该直链状双链dna片段内的两末端的结合，且促进了直链状双链dna片段间的末端彼此的结合。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第7,575,860号说明书

专利文献2：美国专利第7,776,532号说明书

专利文献3：美国专利第8,968,999号说明书

专利文献4：日本特开2016-077180号公报

技术实现要素：

发明所要解决的问题

在infusion法、gibsonassembly法中，虽然能够没有问题地连接两个直链状dna片段，但是存在连接的片段数越多，连接效率越低，无法得到目标连接体的问题。

本发明的主要目的在于提供一种使两种以上的dna片段在碱基序列同源的区域彼此之间相互连接而得到直链状或环状的dna的方法、以及用于该方法的dna片段连接用试剂盒。

用于解决问题的手段

本发明人进行了潜心研究，其结果发现，通过使用reca家族重组酶和核酸外切酶，能够高效地连接两种以上的dna，从而完成了本发明。

即，本发明所涉及的dna的产生方法以及dna片段连接用试剂盒为下述[1]～[31]。

[1]一种dna的产生方法，其中，

制备包含两种以上的dna片段和具有reca家族重组酶活性的蛋白质的反应溶液，

在所述反应溶液中，使所述两种以上的dna片段在碱基序列同源的区域彼此之间或碱基序列互补的区域彼此之间相互连接而得到直链状或环状的dna。

[2]根据[1]所述的dna的产生方法，其中，所述反应溶液还包含核酸外切酶。

[3]根据[2]所述的dna的产生方法，其中，所述核酸外切酶为3’→5’核酸外切酶。

[4]根据[1]所述的dna的产生方法，其中，所述反应溶液还包含直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶。

[5]根据[1]所述的dna的产生方法，其中，所述反应溶液还包含直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶和单链dna特异性3’→5’核酸外切酶。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的dna的产生方法，其中，所述反应溶液包含核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸的再生酶及其底物。

[7]根据[6]所述的dna的产生方法，其中，

所述再生酶为肌酸激酶，所述底物为磷酸肌酸；或者

所述再生酶为丙酮酸激酶，所述底物为磷酸烯醇丙酮酸；或者

所述再生酶为乙酸激酶，所述底物为乙酰磷酸；或者

所述再生酶为聚磷酸激酶，所述底物为聚磷酸；或者

所述再生酶为核苷二磷酸激酶，所述底物为核苷三磷酸。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的dna的产生方法，其中，在使所述两种以上的dna片段连接的反应的开始时间点的所述反应溶液中，镁离子源浓度为0.5～15mm，核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸的浓度为1～1000μm。

[9]根据[1]～[8]中任一项所述的dna的产生方法，其中，在25～48℃的温度范围内进行使所述两种以上的dna片段连接的反应。

[10]根据[1]～[9]中任一项所述的dna的产生方法，其中，得到使7个以上的dna片段连接而成的直链状或环状的dna。

[11]根据[1]～[10]中任一项所述的dna的产生方法，其中，所述反应溶液包含选自由四甲基氯化胺以及二甲基亚砜构成的群组中的一种以上。

[12]根据[1]～[11]中任一项所述的dna的产生方法，其中，所述反应溶液包含选自由聚乙二醇、碱金属离子源以及二硫苏糖醇构成的群组中的一种以上。

[13]根据[1]～[12]中任一项所述的dna的产生方法，其中，所述具有reca家族重组酶活性的蛋白质是uvsx，所述反应溶液还包含uvsy。

[14]根据[1]～[13]中任一项所述的dna的产生方法，其中，所述碱基序列同源的区域或所述碱基序列互补的区域存在于所述dna片段的末端或其附近。

[15]根据[14]所述的dna的产生方法，其中，所述碱基序列同源的区域或所述碱基序列互补的区域为10bp以上且500bp以下的长度。

[16]根据[1]～[15]中任一项所述的dna的产生方法，其中，使所述两种以上的dna片段连接的反应的开始时间点的所述反应溶液含有摩尔浓度彼此相等的两种以上的dna片段。

[17]根据[1]～[16]中任一项所述的dna的产生方法，其中，利用空隙修复酶组对通过连接得到的直链状或环状的dna中的空隙以及切口进行修复。

[18]根据[17]所述的dna的产生方法，其中，将通过连接得到的直链状或环状的dna在50～70℃下进行热处理，接着急冷至10℃以下后，利用空隙修复酶组进行修复。

[19]根据[17]或18]所述的dna的产生方法，其中，使空隙以及切口被修复的直链状或环状的双链dna扩增。

[20]根据[1]～[16]中任一项所述的dna的产生方法，其中，

通过连接得到的dna为直链状，

将该直链状dna用作直接模板来进行pcr。

[21]根据[1]～[16]中任一项所述的dna的产生方法，其中，

通过连接得到的dna为包含能够与具有dnaa活性的酶结合的复制起始序列的环状dna，

形成包含该环状dna、催化环状dna的复制的第一酶组、催化冈崎片段连接反应而合成形成有连环体的两个姐妹环状dna的第二酶组、催化两个姐妹环状dna的分离反应的第三酶组以及dntp的反应混合物，对所形成的反应混合物在等温条件下进行温育，由此进行所述环状dna中的空隙以及切口的修复、以及扩增。

[22]根据[21]所述的dna的产生方法，其中，将通过连接得到的环状dna预先在50～70℃下进行热处理，接着急冷至10℃以下后，形成所述反应混合物。

[23]根据[1]～[16]中任一项所述的dna的产生方法，其中，将通过连接得到的直链状或环状的环状dna导入微生物，在该微生物内扩增所述环状dna中的空隙以及切口被修复的双链dna。

[24]一种dna片段连接用试剂盒，其是用于使两种以上的dna片段在碱基序列同源的区域彼此之间或碱基序列互补的区域彼此之间相互连接而得到直链状或环状的dna的试剂盒，其中，

所述试剂盒包含具有reca家族重组酶活性的蛋白质。

[25]根据[24]所述的dna片段连接用试剂盒，其中，所述试剂盒还包含核酸外切酶。

[26]根据[25]所述的dna片段连接用试剂盒，其中，所述核酸外切酶为3’→5’核酸外切酶。

[27]根据[24]所述的dna片段连接用试剂盒，其中，所述试剂盒还包含直链状双链dna特异性核酸外切酶。

[28]根据[24]所述的dna片段连接用试剂盒，其中，所述试剂盒还包含直链状双链dna特异性核酸外切酶和单链dna特异性3'→5'核酸外切酶。

[29]根据[24]～[28]中任一项所述的dna片段连接用试剂盒，其中，所述试剂盒还包含核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸的再生酶及其底物。

[30]根据[24]～[29]中任一项所述的dna片段连接用试剂盒，其中，所述试剂盒还包含选自由四甲基氯化胺以及二甲基亚砜构成的群组中的一种以上。

[31]根据[24]～[30]中任一项所述的dna片段连接用试剂盒，其中，所述试剂盒还包含选自由核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸、镁离子源、碱金属离子源、聚乙二醇、二硫苏糖醇以及缓冲液构成的群组中的一种以上。

发明效果

通过本发明所涉及的dna的产生方法，能够高效地连接多个dna片段而得到直链状或环状的dna。

通过本发明所涉及的dna片段连接用试剂盒，能够更简便地实施所述dna的产生方法，能够高效地使dna片段彼此连接。

附图说明

图1是示意性地表示本发明所涉及的dna的产生方法的原理中的、将直链状双链dna片段彼此连接的方式的图。

图2是在实施例1中对7片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图3是在实施例2中对5片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图4是在实施例3中对5片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图5是在实施例4中对7片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图6是在实施例5中对5片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图7是在实施例5中对7片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图8是在实施例6中对7片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图9是在实施例7中对7片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图10是在实施例8中对20～49片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图11是在实施例9中对25片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图12中的(a)是在实施例10中对21片段或26片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像，图12中的(b)是对之后进一步进行rcr扩增后的反应混合物进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图13中的(a)是在实施例11中对26片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像，图13中的(b)是对之后进一步进行rcr扩增后的反应混合物进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图14中的(a)是在实施例12中对26片段或36片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像，图14中的(b)是对之后进一步进行rcr扩增后的反应混合物进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图15中的(a)是在实施例13中对通过本发明所涉及的连接法(ra)和neb法进行了26片段的连接反应的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像，图15中的(b)是对之后进一步进行rcr扩增后的反应混合物进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图16是在实施例14中对使大肠杆菌基因组dna的xbai消化物与包含oric的连接用片段连接而环化后进行rcr扩增而得到的反应混合物进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图17是在实施例15中对在包含由肌酸激酶(ck)和磷酸肌酸(cp)构成的atp再生系统的反应溶液中的10片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图18是在实施例16中对在包含由肌酸激酶和磷酸肌酸构成的atp再生系统的反应溶液中的10片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图19是在实施例17中对在包含由丙酮酸激酶(pk)和磷酸烯醇丙酮酸(pep)构成的atp再生系统的反应溶液中的36片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图20是在实施例18中对在包含由聚磷酸激酶(ppk)和聚磷酸(pp)构成的atp再生系统的反应溶液中的10片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图21是在实施例19中对在包含核酸外切酶iii和核酸外切酶i这两者的反应溶液中的10片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图22中的(a)是在实施例20中对36片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像，图22中的(b)是对之后进一步进行rcr扩增后的反应混合物进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图23中的(a)是在实施例21中对50片段或36片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像，图23中的(b)是对之后进一步进行rcr扩增后的反应混合物进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图24是在实施例21中将在50片段的连接反应后进一步进行了rcr反应的反应溶液中的dna导入大肠杆菌并对从所得到的转化体中提取的dna进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图25是在实施例21中对使从所得到的转化体中提取的dna进行rcr扩增而得到的扩增产物的酶消化物进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图26是在实施例22中对2片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图27是在实施例23中对在包含核酸外切酶iii、核酸外切酶i和核酸外切酶t的反应溶液中的10片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图28是在实施例24中对在包含作为噬菌体reca同源物的uvsx的反应溶液中的10片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

图29是在实施例25中对在包含uvsx和uvsy的反应溶液中的10片段的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳而分离的条带的染色像。

具体实施方式

<dna的产生方法>

本发明所涉及的dna的产生方法是，通过使具有碱基序列互相同源的区域(以下，有时简称为“同源区域”。)或碱基序列互相互补的区域(以下，有时简称为“互补区域”。)的dna片段彼此在同源区域之间或互补区域之间相互连接来产生直链状或环状的dna的方法。本发明所涉及的dna的产生方法在reca家族重组酶蛋白质的存在下进行连接反应，因此连接效率非常优异。

在本发明以及本申请说明书中，“碱基序列同源”是指“碱基序列相同(同一)，“碱基序列互补”是指“碱基序列相互对应”。

具体而言，在本发明所涉及的dna的产生方法中，制备包含两种以上的dna片段和具有reca家族重组酶活性的蛋白质(以下，有时称为“reca家族重组酶蛋白质”。)的反应溶液，在所述反应溶液中，使所述两种以上的dna片段在碱基序列同源的区域之间或互补的区域之间相互连接。通过该方法，可得到直链状或环状的dna。以下，有时将由两个以上dna片段连接而成的直链状或环状的dna称为“连接体”。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，连接的dna片段可以是直链状双链dna片段，也可以是单链dna片段。即，可以将直链状双链dna片段彼此连接，可以将直链状双链dna片段与单链dna片段连接，也可以将单链dna片段彼此连接。还可以将一种以上的直链状双链dna片段和一种以上的单链dna片段连接。在使直链状双链dna片段彼此连接或者使直链状双链dna片段与单链dna片段连接的情况下，两者在同源区域中相互连接。在使单链dna片段彼此连接的情况下，两者在互补区域中相互连接。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，在连接的dna片段的至少一种为直链状双链dna片段的情况下，所述反应溶液还包含核酸外切酶。

图1示意性地表示本发明所涉及的dna的产生方法的原理中的、将直链状双链dna片段彼此连接的方式。首先，对具备同源区域h的直链状双链dna片段1a和直链状双链dna片段1b作用3’→5’核酸外切酶2，使同源区域h成为单链。通过在成为该单链的同源区域h上作用reca家族重组酶蛋白质3，使相互互补的同源区域h彼此结合，从而使直链状双链dna片段1a与直链状双链dna片段1b连接。如图1的右图所示，基于3’→5’核酸外切酶2的dna链的切入也可以仅对直链状双链dna片段1a和直链状双链dna片段1b中的任一者进行。例如，在reca家族重组酶蛋白质3的存在下，成为单链状态的直链状双链dna片段1a的同源区域h对双链状态的直链状双链dna片段1b的同源区域h进行作用，使两者连接。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，在使直链状双链dna片段彼此连接或者使直链状双链dna片段与单链dna片段连接的情况下，首先，通过核酸外切酶切割双链dna片段而使同源区域单链化，进而在reca家族重组酶蛋白质的存在下进行连接反应。因此，本发明所涉及的dna的产生方法的连接效率非常优异，能够通过一次反应将以往困难的多个直链状双链dna片段连接。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，在使单链dna片段彼此连接的情况下，通过reca家族重组酶蛋白质迅速地在各自的单链dna片段上形成纤丝，从而抑制核酸外切酶的消化。之后，通过该reca家族重组酶蛋白质的作用，相互互补的同源区域h彼此结合，由此使单链dna片段彼此连接。

作为用本发明所涉及的dna的产生方法连接的dna片段的数量，优选为5个(5片段)以上，更优选为7个(7片段)以上，进一步优选为10个(10片段)以上，也可以为20个(20片段)以上。用本发明所涉及的dna的产生方法连接的dna片段的数量的上限没有特别限定，例如能够连接100片段以下的数量。在本发明所涉及的dna的产生方法中，通过使反应条件等最优化，例如也能够使50片段左右的直链状双链dna片段连接。就本发明所涉及的dna的产生方法中连接的dna片段而言，能够使种类全部不同的dna片段彼此连接，也能够以包含2片段以上的同种dna片段的方式进行连接。

本发明中连接的两种以上的dna片段分别包含用于与其他dna片段中的至少一种进行连接的同源区域或互补区域。在本发明所涉及的dna的产生方法中，在使直链状双链dna片段彼此连接或者使直链状双链dna片段与单链dna片段连接的情况下，首先，通过核酸外切酶切割直链状双链dna片段中的单链而使同源区域成为单链状态。因此，同源区域优选存在于直链状双链dna片段的末端，但也可以存在于末端的附近。例如，同源区域的端部中的直链状双链dna片段的末端侧的碱基优选位于从该末端起300个碱基以内，更优选位于100个碱基以内，进一步优选位于30个碱基以内，更进一步优选位于10个碱基以内。另一方面，在使单链dna片段彼此连接的情况下，通过reca家族重组酶蛋白质的纤丝抑制了核酸外切酶的消化，因此互补区域可以存在于单链dna片段中的任一个。

就同源区域或互补区域的碱基序列而言，也可以在所连接的所有dna片段中设为同一的碱基序列，但为了以所期望的顺序连接，优选按所连接的dna片段的种类而分别设为不同的碱基序列。例如，为了依次连接双链dna片段a、双链dna片段b和双链dna片段c，预先在双链dna片段a的下游末端和双链dna片段b的上游末端设置同源区域a，在双链dna片段b的下游末端和双链dna片段c的上游末端设置同源区域b。由此，双链dna片段a和双链dna片段b以同源区域a连接，双链dna片段b和双链dna片段c以同源区域b连接，从而能够得到依次连接双链dna片段a、双链dna片段b和双链dna片段c而成的直链状的dna。在该情况下，进而通过预先在双链dna片段c的下游末端和双链dna片段a的上游末端设置同源区域c，使双链dna片段a与双链dna片段b以同源区域a连接，使双链dna片段b和双链dna片段c以同源区域b连接，使双链dna片段c和双链dna片段a以同源区域c连接，从而能够得到依次连接双链dna片段a、双链dna片段b和双链dna片段c而成的环状dna。

同源区域以及互补区域只要是在连接反应的反应溶液中能够使单链彼此特异性杂交的程度的碱基序列即可，碱基对(bp)长度、gc率等通常能够参考探针或引物的设计方法来适当决定。通常，为了抑制非特异性杂交并将目标直链状双链dna片段彼此准确地连接，同源区域的碱基对长度需要是一定程度的长度，但若同源区域的碱基对长度过长，则连接效率有可能降低。在本发明中，同源区域或互补区域的碱基对长度优选为10碱基对(bp)以上，更优选为15bp以上，进一步优选为20bp以上。另外，作为该同源区域或互补区域的碱基对长度，优选为500bp以下，更优选为300bp以下，进一步优选为200bp以下。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，相互连接的dna片段的长度没有特别限定，例如，在直链状双链dna片段的情况下，优选为50bp以上，更优选为100bp以上，进一步优选为200bp以上。在单链dna片段的情况下，优选为50碱基长度(base)以上，更优选为100碱基长度以上，进一步优选为200碱基长度以上。在本发明所涉及的dna的产生方法中，也能够使325kbp的双链dna片段连接。另外，连接的dna片段的长度可以按每个种类而不同。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，相互连接的直链状双链dna片段只要是同源区域的整个区域或其一部分区域为由两条单链dna杂交而成的双链结构即可。即，该直链状双链dna片段可以是无空隙、切口的完整的直链状双链dna片段，也可以是一处或多处为单链结构的直链状dna片段。例如，连接的直链状双链dna片段可以是平滑末端，也可以是粘着末端。通过本发明所涉及的dna的产生方法，也能够使平滑末端的直链状双链dna片段与粘着末端的直链状双链dna片段连接。

反应溶液内所包含的各dna片段的摩尔比优选与构成目标连接体的各dna片段的分子数的比一致。通过预先使连接反应开始时间点的反应体系内的dna片段的分子数一致，能够更高效地进行连接反应。例如，在使种类全部不同的dna片段彼此连接的情况下，优选反应溶液中所包含的各dna片段的摩尔浓度相互相等。

反应溶液内所包含的dna片段的总量没有特别限定。出于容易得到充分量的连接体这一点，连接反应的开始时间点的反应溶液内所包含的dna片段的总浓度优选为0.01nm以上，更优选为0.1nm以上，进一步优选为0.3nm以上。出于连接效率更高、适于多片段的连接这一点，连接反应的开始时间点的反应溶液内所包含的dna片段的总浓度优选为100nm以下，更优选为50nm以下，进一步优选为25nm以下，特别优选为20nm以下。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，作为通过连接反应得到的连接体的大小没有特别限定。作为所得到的连接体的大小，例如优选为1000碱基长度以上，更优选为5000碱基长度以上，进一步优选为10000碱基长度以上，更进一步优选为20000碱基长度以上。通过本发明所涉及的dna的产生方法，也能够得到300000碱基长度以上、优选500000碱基长度以上、更优选2000000碱基长度以上长度的连接体。

本发明中使用的核酸外切酶是从直链状dna的3’末端或5’末端逐次进行水解的酶。作为本发明中使用的核酸外切酶，只要是具有从直链状dna的3’末端或5’末端逐次进行水解的酶活性的酶即可，对其种类、生物学的来源没有特别限制。例如，作为从3’末端逐次进行水解的酶(3’→5’核酸外切酶)，可列举为核酸外切酶iii家族型的ap(apurinic/apyrimidinic)核酸内切酶等直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶、和dnaq超家族蛋白质等单链dna特异性3’→5’核酸外切酶。作为核酸外切酶iii家族型的ap核酸内切酶，例如可列举为核酸外切酶iii(来源于大肠杆菌)、exoa(核酸外切酶iii的枯草杆菌同源物)、mth212(核酸外切酶iii的古细菌同源物)、ap核酸内切酶i(核酸外切酶iii的人同源物)。作为dnaq超家族蛋白质，例如可举出核酸外切酶i(来源于大肠杆菌)、核酸外切酶t(exot)(也已知为rnaset)、核酸外切酶x、dna聚合酶iiiε亚单元(dnapolymeraseiiiepsilonsubunit)、dna聚合酶i、dna聚合酶ii、t7dna聚合酶、t4dna聚合酶、克列诺dna聚合酶5、phi29dna聚合酶、核糖核酸酶iii(rnased)、寡聚核糖核酸酶(orn)等。作为从5’末端逐次进行水解的酶(5’→3’核酸外切酶)，可以使用λ核酸外切酶、核酸外切酶viii、t5核酸外切酶、t7核酸外切酶以及recj核酸外切酶等。

作为本发明中使用的核酸外切酶，出于较好地平衡直链状双链dna片段的切入的持续性与reca家族重组酶蛋白质存在下的连接效率这一点，优选3’→5’核酸外切酶。其中，更优选直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶，进一步优选核酸外切酶iii家族型的ap核酸内切酶，特别优选核酸外切酶iii。

在本发明中，作为反应溶液内所包含的核酸外切酶，优选为直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶与单链dna特异性3’→5’核酸外切酶这两者。通过在直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶中组合单链dna特异性3’→5’核酸外切酶，与单独使用直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶的情况相比，能够进一步改善连接效率。通过并用两种3’→5’核酸外切酶能改善连接效率的理由尚不明确。推测是因为：直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶难以将3’突出末端作为目标的情况较多，该3’突出末端由单链dna特异性3’→5’核酸外切酶消化，其结果是，促进了基于直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶与reca的连接反应。另外，在连接的直链状dna片段为平滑末端、5’突出末端的情况下，通过单链dna特异性3’→5’核酸外切酶的并用，连接效率也得到改善。推测这是因为：在通过直链双链dna特异性3’→5’核酸外切酶和reca形成的连接体中附带形成的3’突端被单链dna特异性3’→5’核酸外切酶消化，其结果是，连接效率得到进一步改善。在本发明中，作为反应溶液内所包含的核酸外切酶，特别出于连接效率优异这一点，优选为核酸外切酶iii家族型的ap核酸内切酶与一种或两种以上的单链dna特异性3’→5’核酸外切酶的组合，更优选为核酸外切酶iii家族型的ap核酸内切酶与一种或两种以上的dnaq超家族蛋白质的组合，特别优选为核酸外切酶iii与核酸外切酶i的组合、或者核酸外切酶iii、核酸外切酶i与核酸外切酶t的组合。

在本发明中，作为进行连接反应的反应溶液中的核酸外切酶的浓度，在连接反应的开始时间点，例如优选为1～1000mu/μl，更优选为5～1000mu/μl，进一步优选为5～500mu/μl，更进一步优选为10～150mu/μl。特别是在核酸外切酶为直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶的情况下，连接反应的开始时间点的反应溶液中的直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶的浓度例如优选为5～500mu/μl，更优选为5～250mu/μl，进一步优选为5～150mu/μl，更进一步优选为10～150mu/μl。另外，在核酸外切酶为单链dna特异性3’→5’核酸外切酶的情况下，连接反应的开始时间点的反应溶液中的直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶的浓度优选为1～10000mu/μl，更优选为100～5000mu/μl，进一步优选为200～2000mu/μl。在并用直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶与单链dna特异性3’→5’核酸外切酶的情况下，连接反应的开始时间点的反应溶液中的各核酸外切酶的浓度可以分别设为上述各核酸外切酶的优选浓度。

在本发明以及本申请说明书中，reca家族重组酶蛋白质是指，在单链状态或双链状态的dna上聚合而形成纤丝，具有对atp(三磷酸腺苷)等核苷三磷酸的水解活性，且具有查找同源区域来进行同源重组的功能(reca家族重组酶活性)的蛋白质。作为reca家族重组酶蛋白质，可列举为原核生物reca同源物、噬菌体reca同源物、古细菌reca同源物、真核生物reca同源物等。作为原核生物reca同源物，可列举为大肠杆菌reca；来源于thermusthermophiles(嗜热栖热菌)、thermusaquaticus(水生栖热菌)等thermus属(栖热菌属)菌、thermococcus属(热球菌属)菌、pyrococcus属(火球菌属)菌、thermotoga属(热袍菌属)菌等高度嗜热菌的reca；来源于deinococcusradiodurans(耐辐射球菌)等耐辐射性菌的reca等。作为噬菌体reca同源物，可列举为t4噬菌体uvsx等，作为古细菌reca同源物，可列举为rada等，作为真核生物reca同源物，可列举为rad51及其旁系同源物、dcm1等。这些reca同源物的氨基酸序列能够从ncbi(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库得到。

作为本发明中使用的reca家族重组酶蛋白质，可以是野生型蛋白质，也可以是在野生型蛋白质中导入了缺失、附加或取代1～30个氨基酸的突变的保持reca家族重组酶活性的变异体。作为该变异体，可列举为导入了使查找野生型蛋白质中的同源区域的功能亢进的氨基酸取代突变而得到的变异体、在野生型蛋白质的n末端或c末端附加各种标签而得到的变异体、提高了耐热性的变异体(国际公开第2016/013592号)等。作为该标签，例如能够使用his标签、ha(hemagglutinin)标签、myc标签以及flag标签等在重组蛋白质的表达或纯化中通用的标签。野生型的reca家族重组酶蛋白质是指，由与从自然界分离的保持在生物中的reca家族重组酶蛋白质的氨基酸序列同一的氨基酸序列构成的蛋白质。

作为本发明中使用的reca家族重组酶蛋白质，优选保持reca家族重组酶活性的变异体。作为该变异体，例如可列举为将大肠杆菌reca的第203个氨基酸残基苯丙氨酸取代为色氨酸而得的f203w突变体、将各种reca同源物中的与大肠杆菌reca的第203号苯丙氨酸相当的苯丙氨酸取代为色氨酸而得到的突变体。

在本发明中，进行连接反应的反应溶液中的reca家族重组酶蛋白质的量没有特别限定。在本发明中，作为进行连接反应的反应溶液中的reca家族重组酶蛋白质的浓度，在连接反应的开始时间点，例如，优选为0.01～100μm，更优选为0.1～100μm，进一步优选为0.1～50μm，更进一步优选为0.5～10μm，特别优选为1.0～5.0μm。

为了使reca家族重组酶蛋白质发挥reca家族重组酶活性，需要核苷三磷酸或者脱氧核苷三磷酸。因此，在本发明中，进行连接反应的反应溶液包含核苷三磷酸以及脱氧核苷三磷酸中的至少一者。在本发明中，作为连接反应的反应溶液中所含有的核苷三磷酸，优选使用选自由atp、gtp(鸟苷三磷酸)、ctp(胞苷三磷酸)、utp(尿苷三磷酸)、m⁵utp(5-甲基尿苷三磷酸)构成的群组中的一种以上，特别优选使用atp。在本发明中，作为连接反应的反应溶液中所含有的脱氧核苷三磷酸，优选使用选自由datp(脱氧腺苷三磷酸)、dgtp(脱氧鸟苷三磷酸)、dctp(脱氧胞苷三磷酸)、以及dttp(脱氧胸苷三磷酸)构成的群组中的一种以上，特别优选使用datp。反应溶液中所包含的核苷三磷酸以及脱氧核苷三磷酸的总量只要是为了使reca家族重组酶蛋白质发挥reca家族重组酶活性而充分的量，则没有特别限定。在本发明中，作为进行连接反应的反应溶液中的核苷三磷酸浓度或脱氧核苷三磷酸浓度，在连接反应的开始时间点，例如，优选为1μm以上，更优选为10μm以上，进一步优选为30μm以上。另一方面，在反应溶液的核苷三磷酸浓度过高的情况下，多片段的连接效率反而有可能降低。因此，作为连接反应的开始时间点的反应溶液的核苷三磷酸浓度或核苷三磷酸浓度，优选为1000μm以下，更优选为500μm以下，进一步优选为300μm以下。

为了使reca家族重组酶蛋白质发挥reca家族重组酶活性、以及使核酸外切酶发挥核酸外切酶活性，需要镁离子(mg²⁺)。因此，在本发明中，进行连接反应的反应溶液含有镁离子源。镁离子源是向反应溶液中提供镁离子的物质。例如可列举为乙酸镁[mg(oac)2]、氯化镁[mgcl2]、硫酸镁[mgso4]等镁盐。优选的镁离子源为乙酸镁。

在本发明中，进行连接反应的反应溶液的镁离子源浓度只要为使reca家族重组酶蛋白质能够发挥reca家族重组酶活性、且使核酸外切酶能够发挥核酸外切酶活性的浓度即可，没有特别限定。作为连接反应的开始时间点的反应溶液的镁离子源浓度，例如，优选为0.5mm以上，更优选为1mm以上。另一方面，在反应溶液的镁离子浓度过高的情况下，核酸外切酶活性变得过强，多片段的连接效率反而有可能降低。因此，作为连接反应的开始时间点的反应溶液的镁离子源浓度，例如，优选为20mm以下，更优选为15mm以下，进一步优选为12mm以下，更进一步优选为10mm以下。

在本发明中，进行连接反应的反应溶液例如是通过在缓冲液中添加dna片段、reca家族重组酶蛋白质、核酸外切酶、在核苷三磷酸以及脱氧核苷三磷酸中的至少一者、镁离子源而制备的。作为该缓冲液，只要是适合于ph7～9、优选ph8中使用的缓冲液，就没有特别限制。例如，可举出tris-hcl、tris-oac、hepes-koh、磷酸缓冲液、mops-naoh、tricine-hcl等。优选的缓冲液是tris-hcl或tris-oac。缓冲液的浓度可以由本领域技术人员适当选择，没有特别限定，在tris-hcl或tris-oac的情况下，例如能够选择10mm～100mm、优选为10mm～50mm、更优选为20mm的浓度。

在本发明中，在使用uvsx作为reca家族重组酶蛋白质的情况下，优选使进行连接反应的反应溶液中还含有t4噬菌体uvsy。uvsy是t4噬菌体中的同源重组的调节子。在t4噬菌体中，首先，单链dna先与gp32(单链dna结合蛋白质)结合而形成单链dna-gp32复合物。接着，以该复合物中的gp32被uvsx取代的方式使单链dna与uvsx结合来进行同源重组。uvsy使单链dna-gp32的相互作用不稳定化而使单链dna-uvsx的相互作用稳定化，由此促进单链dna与uvsx的结合，进而促进同源重组反应(bleuitetal.,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，2001，vol.98(15)，p.8298-8305)。在本发明中，也通过在uvsx中并用uvsy而进一步促进连接效率。

在本发明中，优选为，在进行连接反应的反应溶液中，除了dna片段、reca家族重组酶蛋白质、核酸外切酶、在核苷三磷酸及脱氧核苷三磷酸中的至少一者、镁离子源之外，还包含核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸的再生酶及其底物。通过在反应溶液中能够再生核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸，能够更高效地连接多个dna片段。作为用于再生核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸的再生酶及其底物的组合，可列举为肌酸激酶和磷酸肌酸的组合、丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸的组合、乙酸激酶与乙酰磷酸的组合、聚磷酸激酶和聚磷酸的组合、核苷二磷酸激酶和核苷三磷酸的组合。作为核苷二磷酸激酶的底物(磷酸供给源)的核苷三磷酸可以是atp、gtp、ctp、utp中的任一者。此外，作为再生酶，可列举为肌激酶。

在本发明中，进行连接反应的反应溶液中的核苷三磷酸再生酶及其底物的浓度只要是能够在该反应溶液中实现连接反应时核苷三磷酸的再生的充分的浓度，就没有特别限定。例如，在使用肌酸激酶和磷酸肌酸的情况下，本发明中进行连接反应的反应溶液中含有的肌酸激酶的浓度可以优选为1～1000ng/μl、更优选为5～1000ng/μl、进一步优选为5～500ng/μl、更进一步优选为5～250ng/μl，磷酸肌酸的浓度可以优选为0.4～20mm、更优选为0.4～10mm、进一步优选为1～7mm。

在以目标的顺序连接多片段的情况下，同源区域或互补区域的碱基序列优选按连接的dna片段的每个组合而不同。但是，在同一温度条件下，g(鸟嘌呤碱基)和c(胞嘧啶碱基)的含有率高的同源区域容易在单链中形成二级结构。另一方面，在a(腺嘌呤碱基)和t(胸腺嘧啶碱基)的含有率高的同源区域中，杂交的效率变低。由于这些倾向，连接效率也有可能变低。通过抑制单链dna的二级结构形成而促进特异性杂交，能够促进dna片段的连接。

因此，在本发明中，在进行连接反应的反应溶液中优选添加抑制单链dna的二级结构形成而促进特异性杂交的物质。作为该物质，可列举为二甲基亚砜(dmso)、四甲基氯化胺(tmac)。dmso具有抑制富含gc的碱基对的二级结构形成的作用。tmac具有促进特异性杂交的作用。在本发明中，在进行连接反应的反应溶液中含有抑制单链dna的二级结构形成而促进特异性杂交的物质的情况下，该物质的浓度只要是能够得到该物质对dna片段的连接促进效果的浓度，就没有特别限定。例如，在使用dmso作为该物质的情况下，作为在本发明中进行连接反应的反应溶液所含有的dmso的浓度，优选为5～30体积％，更优选为8～25体积％，进一步优选为8～20体积％。在使用tmac作为该物质的情况下，作为在本发明中进行连接反应的反应溶液所含有的tmac的浓度，优选为60～300mm，更优选为100～250mm，进一步优选为100～200mm。

在本发明中，在进行连接反应的反应溶液中优选进一步添加具有高分子混合效果的物质。高分子混合效果能够增强dna分子彼此的相互作用，并促进dna片段的连接。作为该物质，可列举为聚乙二醇(peg)200～20000、聚乙烯醇(pva)200～20000、葡聚糖40～70、聚蔗糖70、牛血清白蛋白(bsa)。在本发明中，在进行连接反应的反应溶液中含有具有高分子混合效果的物质的情况下，该物质的浓度只要是能够得到基于该物质的dna片段的连接促进效果的浓度，就没有特别限定。例如，在使用peg8000作为该物质的情况下，作为本发明中进行连接反应的反应溶液中含有的peg8000的浓度，优选为2～20质量％，更优选为2～10质量％，进一步优选为4～6质量％。

在本发明中进行连接反应的反应溶液中还可以含有碱金属离子源。碱金属离子源是向反应溶液中提供碱金属离子的物质。在本发明中，作为进行连接反应的反应溶液中所含有的碱金属离子，优选钠离子(na⁺)或钾离子(k⁺)。作为碱金属离子源，例如可列举为谷氨酸钾[kglu]、天冬氨酸钾、氯化钾、乙酸钾[koac]、谷氨酸钠、天冬氨酸钠、氯化钠以及乙酸钠。作为本发明中进行连接反应的反应溶液中所含有的碱金属离子源，优选谷氨酸钾或乙酸钾，特别由于改善多片段的连接效率而优选谷氨酸钾。作为连接反应的开始时间点的反应溶液的碱金属离子源浓度，没有特别限定，例如，能够调整为以优选为10mm以上、更优选为30～300mm的范围内、进一步优选为50～150mm的范围内的方式将碱金属离子提供至反应溶液中的浓度。

在本发明中进行连接反应的反应溶液中还可以含有还原剂。作为还原剂，例如可列举为二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇(2-巯基乙醇)、三(2-羧乙基)膦(tcep)以及谷胱甘肽。优选的还原剂为dtt。在反应溶液中可以包含1.0～15.0mm还原剂，优选为2.0～10.0mm。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，使缓冲液中包含两种以上的dna片段、reca家族重组酶蛋白质、核苷三磷酸、镁离子源并根据需要包含选自由核酸外切酶、核苷三磷酸再生酶及其底物的套组、抑制单链dna的二级结构形成并促进特异性杂交的物质、具有高分子混合效果的物质、碱金属离子源以及还原剂所组成的群组中的一种以上来制备出反应溶液，在使该反应溶液中的reca家族重组酶蛋白质以及核酸外切酶能够发挥各自的酶活性的温度的等温条件下进行规定时间的温育，由此进行连接反应。作为连接反应的反应温度，优选为25～48℃的温度范围内，更优选为27～45℃的温度范围内。特别是在同源区域或互补区域的长度为50个碱基以上的情况下，连接反应的反应温度优选为30～45℃的温度范围内，更优选为37～45℃的温度范围内，进一步优选为40～43℃的温度范围内。另一方面，在同源区域或互补区域的长度为50个碱基以下的情况下，连接反应的反应温度优选为27～43℃的温度范围内，更优选为27～37℃的温度范围内，进一步优选为27～33℃的温度范围内。在本申请说明书中，“等温条件下”是指相对于反应中所设定的温度而保持在±3℃或±1℃的温度范围内。连接反应的反应时间没有特别限定，例如能够设为15分钟～6小时，优选设为15分钟～2小时。

如图1所示，由连接反应得到的连接体(直链状或环状的dna)中存在空隙、切口。空隙是在双链dna中缺失一个或多个连续的核苷酸的状态，切口是在双链dna中相邻的核苷酸间的磷酸二酯键被切断的状态。因此，在本发明所涉及的dna的产生方法中，优选在连接反应后，通过空隙修复酶组和dntp对所得到的连接体中的空隙以及切口进行修复。通过修复空隙以及切口，能够使连接体成为完整的双链dna。

具体而言，在连接反应后的反应溶液中，添加空隙修复酶组和dntp，在空隙修复酶组能够发挥酶活性的温度的等温条件下，进行规定时间的温育，从而能够修复连接体的空隙以及切口。构成空隙修复酶组的酶只要是能够修复双链dna的空隙以及切口的酶组，则对其种类、生物学的来源没有特别限制。作为空隙修复酶组，例如能够组合使用具有dna聚合酶活性的酶和具有dna连接酶活性的酶。在作为dna连接酶而使用来源于大肠杆菌的dna连接酶的情况下，在反应液中包含0.01～1.0mm的范围的作为其辅助因子的nad(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。基于空隙修复酶组的处理例如可以在25～40℃下进行5～120分钟、优选进行10～60分钟。

dntp是datp、dgtp、dctp以及dttp的总称。在修复反应的反应开始时间点，反应溶液中所包含的dntp的浓度例如可以为0.01～1mm的范围，优选为0.05～1mm的范围。

修复空隙以及切口后的连接体(直链状或环状的dna)也优选进一步扩增。作为对修复空隙以及切口后的连接体进行扩增的方法，没有特别限定，一般可以通过将直链状或环状的dna作为模板进行扩增的方法进行扩增。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，在通过在连接反应后进一步进行空隙以及切口的修复反应而得到的连接体为直链状的情况下，该连接体优选通过聚合酶链式反应(pcr)进行扩增。pcr可以通过常规方法进行。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，在通过在连接反应后进一步进行空隙以及切口的修复反应而得到的连接体为环状的情况下，该连接体优选通过滚环扩增法(rca)进行扩增。rca可以通过常规方法进行。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，在通过连接反应得到的连接体为环状且包含能够与具有dnaa活性的酶结合的复制起始序列(originofchromosome(oric))的情况下，该连接体优选通过复制周期反应(rcr)扩增法进行扩增。通过将由连接反应得到的连接体就此直接、即不进行空隙以及切口的修复反应而作为模板进行rcr扩增，作为扩增产物能够得到没有空隙以及切口的完整的双链dna的环状的连接体。

作为复制起始序列，例如存在于大肠杆菌、枯草杆菌等细菌中的公知的复制起始序列可以从ncbi等公共的数据库获得。另外，也能够通过对能够与具有dnaa活性的酶结合的dna片段进行克隆，并分析其碱基序列，得到复制起始序列。

具体而言，形成包含作为模板的由连接反应得到的环状的连接体、催化环状dna的复制的第一酶组、催化冈崎片段连接反应而合成形成有连环体的两个姐妹环状dna的第二酶组、催化两个姐妹环状dna的分离反应的第三酶组以及dntp的反应混合物，对所形成的反应混合物进行温育，由此进行rcr扩增法。形成有连环体的两个姐妹环状dna是指由dna复制反应合成的两个环状dna处于相连的状态的dna。

作为催化环状dna的复制的第一酶组，例如可以使用kagunijm&kornberga.cell.1984，38：183-90中记载的酶组。具体而言，作为第一酶组，可以示例为：选自由具有dnaa活性的酶、一种以上的拟核蛋白质、具有dna促旋酶活性的酶或酶组、单链dna结合蛋白质(single-strandbindingprotein(ssb)、具有dnab型解旋酶活性的酶、具有dna解旋酶装载器活性的酶、具有dna引发酶活性的酶、具有dna夹活性的酶、以及具有dna聚合酶iii活性的酶或酶组所构成的群组中的酶或酶组的一者以上、或者该酶或酶组的全部组合。

作为具有dnaa活性的酶，只要是具有与作为大肠杆菌的起始子蛋白质的dnaa同样的起始子活性的酶，则其生物学的来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的dnaa。来源于大肠杆菌的dnaa可以作为单体以1nm～10μm的范围包含在反应混合物中，优选以1nm～5μm、1nm～3μm、1nm～1.5μm、1nm～1.0μm、1～500nm、50～200nm、50～150nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

拟核蛋白质是指拟核中所包含的蛋白质。本发明中使用的一种以上的拟核蛋白质，只要是具有与大肠杆菌的拟核蛋白质同样的活性的酶，则其生物学来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的ihf、即ihfa和/或ihfb的复合物(异源二聚体或同源二聚体)、来源于大肠杆菌的hu、即hupa和hupb的复合物。来源于大肠杆菌的ihf可以作为异源二聚体/同源二聚体以5～400nm的范围包含在反应混合物中，优选以5～200nm、5～100nm、5～50nm、10～50nm、10～40nm、10～30nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。来源于大肠杆菌的hu可以以1～50nm的范围包含在反应混合物中，也可以优选以5～50nm、5～25nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为具有dna促旋酶活性的酶或酶组，只要是具有与大肠杆菌的dna促转酶同样的活性的酶，则其生物学来源没有特别限制，例如能够适当地使用由来源于大肠杆菌的gyra以及gyrb构成的复合物。由来源于大肠杆菌的gyra以及gyrb构成的复合物可以作为异源四聚体以20～500nm的范围包含在反应混合物中，优选以20～400nm、20～300nm、20～200nm、50～200nm、100～200nm的范围含包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为ssb，只要是具有与大肠杆菌的单链dna结合蛋白质同样的活性的酶，则其生物学的来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的ssb。来源于大肠杆菌的ssb可以作为同源四聚体以20～1000nm的范围包含在反应混合物中，优选以20～500nm、20～300nm、20～200nm、50～500nm、50～400nm、50～300nm、50～200nm、50～150nm、100～500nm、100～400nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为具有dnab型解旋酶活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的dnab同样的活性的酶，则其生物学的来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的dnab。来源于大肠杆菌的dnab可以作为同源六聚体以5～200nm的范围包含在反应混合物中，优选以5～100nm、5～50nm、5～30nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为具有dna解旋酶装载器活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的dnac同样的活性的酶，则其生物学来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的dnac。来源于大肠杆菌的dnac可以作为同源六聚体以5～200nm的范围包含在反应混合物中，优选以5～100nm、5～50nm、5～30nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为具有dna引发酶活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的dnag同样的活性的酶，则其生物学来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的dnag。来源于大肠杆菌的dnag可以作为单体以20～1000nm的范围包含在反应混合物中，优选以20～800nm、50～800nm、100～800nm、200～800nm、250～800nm、250～500nm、300～500nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为具有dna夹活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的dnan同样的活性的酶，则其生物学的来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的dnan。来源于大肠杆菌的dnan可以作为同源二聚体以10～1000nm的范围包含在反应混合物中，优选以10～800nm、10～500nm、20～500nm、20～200nm、30～200nm、30～100nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为具有dna聚合酶iii*活性的酶或酶组，只要是具有与大肠杆菌的dna聚合酶iii*复合物同样的活性的酶或酶组，则其生物学的来源没有特别限制。例如能够适当地使用包含来源于大肠杆菌的dnax、hola、holb、holc、hold、dnae、dnaq以及hole中的任一种的酶组，优选使用包含来源于大肠杆菌的dnax、hola、holb以及dnae复合物的酶组，进一步优选使用包含来源于大肠杆菌的dnax、hola、holb、holc、hold、dnae、dnaq以及hole复合物的酶组。来源于大肠杆菌的dna聚合酶iii*复合物可以作为异源多聚体以2～50nm的范围包含在反应混合物中，优选以2～40nm、2～30nm、2～20nm、5～40nm、5～30nm、5～20nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为对冈崎片段连接反应进行催化而合成形成有连环体的两个姐妹环状dna的第二酶组，可以示例为，例如选自由具有dna聚合酶i活性的酶、具有dna连接酶活性的酶、以及具有rnaseh活性的酶构成的群组中的一种以上的酶或该酶的组合。

作为具有dna聚合酶i活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的dna聚合酶i同样的活性的酶，则其生物学的来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的dna聚合酶i。来源于大肠杆菌的dna聚合酶i可以作为单体以10～200nm的范围包含在反应混合物中，优选以20～200nm、20～150nm、20～100nm、40～150nm、40～100nm、40～80nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为具有dna连接酶活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的dna连接酶同样的活性的酶，则其生物学的来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的dna连接酶或t4噬菌体的dna连接酶。来源于大肠杆菌的dna连接酶可以作为单体以10～200nm的范围包含在反应混合物中，优选以15～200nm、20～200nm、20～150nm、20～100nm、20～80nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为具有rnaseh活性的酶，只要具有对rna：dna杂交体的rna链进行分解的活性，则其生物学来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的rnaseh。来源于大肠杆菌的rnaseh可以作为单体以0.2～200nm的范围包含在反应混合物中，优选以0.2～200nm、0.2～100nm、0.2～50nm、1～200nm、1～100nm、1～50nm、10～50nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为对两个姐妹环状dna的分离反应进行催化的第三酶组，例如能够使用pengh&marianskj.pnas.1993，90：8571-8575中记载的酶组。具体而言，作为第三酶组，以下可以示例为：选自由具有拓扑异构酶iv活性的酶、具有拓扑异构酶iii活性的酶以及具有recq型解旋酶活性的酶构成的群组中的一种以上的酶或该酶的组合。

作为具有拓扑异构酶iii活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的拓扑异构酶iii同样的活性的酶，则其生物学的来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的拓扑异构酶iii。来源于大肠杆菌的拓扑异构酶iii可以作为单体以20～500nm的范围包含在反应混合物中，优选以20～400nm、20～300nm、20～200nm、20～100nm、30～80nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为具有recq型解旋酶活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的recq同样的活性的酶，则其生物学的来源没有特别限制，例如能够适当地使用来源于大肠杆菌的recq。来源于大肠杆菌的recq可以作为单体以20～500nm的范围包含在反应混合物中，优选以20～400nm、20～300nm、20～200nm、20～100nm、30～80nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

作为具有拓扑异构酶iv活性的酶，只要是具有与大肠杆菌的拓扑异构酶iv同样的活性的酶，则其生物学的来源没有特别限制。例如，可以适当地使用作为parc与pare的复合物的来源于大肠杆菌的拓扑异构酶iv。来源于大肠杆菌的拓扑异构酶iv可以作为异源四聚体以0.1～50nm的范围包含在反应混合物中，优选以0.1～40nm、0.1～30nm、0.1～20nm、1～40nm、1～30nm、1～20nm、1～10nm、1～5nm的范围包含在反应混合物中，但并不限定于此。

上述第一酶组、第二酶组以及第三酶组可以使用市售的酶组，也可以使用从微生物等中提取并根据需要进行纯化而得的酶组。可以使用本领域技术人员可利用的方法来适当实施从微生物的酶的提取以及纯化。

作为上述第一酶组、第二酶组以及第三酶组，在使用上述来源于大肠杆菌的酶以外的酶的情况下，能够相对于针对来源于上述大肠杆菌的酶所确定的浓度范围而在以酶活性单位计相当的浓度范围内使用。

在rcr扩增法中反应混合物所含有的dntp可以使用与作为本发明所涉及的dna的产生方法中使用的dntp而举出的例子同样的dntp。

在rcr扩增法中制备的反应混合物中，根据需要还含有镁离子源、碱金属离子源、atp。

在rcr扩增法中，反应开始时间点的反应混合物所包含的atp的浓度例如可以为0.1～3mm的范围，也可以优选为0.1～2mm、0.1～1.5mm、0.5～1.5mm的范围。

在rcr扩增法中反应混合物所含有的镁离子源可以使用与作为本发明所涉及的dna的产生方法中使用的镁离子源而举出的例子同样的镁离子源。在rcr扩增法中，反应开始时间点的反应混合物所包含的镁离子源的浓度例如可以是以5～50mm的范围提供镁离子的浓度。

在rcr扩增法中反应混合物所含有的碱金属离子源可以使用与作为本发明所涉及的dna的产生方法中使用的碱金属离子源而举出的例子同样的碱金属离子源。在rcr扩增法中，反应开始时间点的反应混合物所包含的碱金属离子源的浓度例如可以是以100mm以上、优选以100～300mm的范围提供碱金属离子的浓度，但并不限定于此。

在rcr扩增法中反应混合物所含有的连接体的量没有特别限制。例如，在反应开始时间点，可以使连接体以10ng/μl以下、5ng/μl以下、1ng/μl以下、0.8ng/μl以下、0.5ng/μl以下、0.3ng/μl以下的浓度存在于反应混合物中。

在规定的温度的等温条件下对所制备的反应混合物进行温育，由此仅扩增包含可与具有dnaa活性的酶结合的复制起始序列的环状dna。rcr扩增中的反应温度只要是能够进行dna复制反应的温度，则没有特别限制，例如可以为dna聚合酶的最适温度即20～80℃、25～50℃、或25～40℃的范围。rcr扩增中的反应时间可以根据作为目标的环状连接体的扩增产物的量而适当设定，例如可以设为30分钟～24小时。

也可以通过在重复30℃以上的温育以及27℃以下的温育的温度循环下对所制备的反应混合物进行温育来进行rcr扩增。30℃以上的温育只要是能够进行包含oric的环状dna的复制起始的温度范围，则没有特别限定，例如可以为30～80℃、30～50℃、30～40℃、37℃。30℃以上的温育没有特别限定，可以每个循环为10秒～10分钟。27℃以下的温育只要是抑制复制起始、推进dna的延伸反应的温度就没有特别限定，例如可以为10～27℃、16～25℃、24℃。27℃以下的温育没有特别限定，优选根据扩增的环状dna的长度进行设定，例如可以为在每个循环下每1000个碱基为1～10秒钟。温度循环的循环数没有特别限定，可以为10～50个循环、20～40个循环、25～35个循环、30个循环。

通过连接反应得到的连接体优选在作为供空隙以及切口的修复反应、rcr扩增的模板使用之前，进行在50～70℃下温育的热处理、以及之后的急冷。热处理的处理时间没有特别限定，例如可以设为1～15分钟、优选设为2～10分钟。急冷的温度没有特别限定，例如，冷却至10℃以下，优选冷却至4℃以下。作为急冷时的冷却速度，优选为50℃/min以上，更优选为70℃/min以上，进一步优选为85℃/min以上。例如，可以通过将装有热处理后的反应混合物的容器直接静置在冰上或直接与调节为4℃以下的金属块接触来进行急冷。

在刚结束了连接反应后的反应溶液中，包含有通过非特异性连接而得到的连接体。通过对该反应溶液进行热处理、急冷，能够消除非特异性连接。因此，通过将热处理、急冷后的连接体作为模板来进行空隙以及切口的修复反应、rcr扩增反应，能够抑制非特异性的产物产生，高效地得到目标连接体的完整的双链dna。

在本发明所涉及的dna的产生方法中，由连接反应得到的直链状或环状连接体的扩增能够通过将连接体导入微生物而在该微生物内利用该微生物所具有的酶等进行。导入微生物的连接体可以是进行空隙以及切口的修复反应前的连接体，也可以是修复反应后的连接体。即使在将具有空隙以及切口的连接体直接导入微生物的情况下，也能够得到没有空隙以及切口的完整的双链dna的状态的连接体作为扩增产物。作为供连接体导入的微生物，例如可列举为大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、古细菌、酵母、丝状菌等。能够通过电穿孔法等常规方法进行连接体向微生物的导入。扩增后的连接体从微生物的回收也能够通过常规方法进行。

<dna片段连接用试剂盒>

本发明所涉及的dna片段连接用试剂盒是用于使两种以上的dna片段在碱基序列同源的区域彼此之间相互连接而得到直链状或环状的dna的试剂盒，包含reca家族重组酶蛋白质。在用于连接直链状双链dna片段的情况下，该试剂盒优选还含有核酸外切酶。将该试剂盒所具备的reca家族重组酶蛋白质和核酸外切酶添加到包含连接目标的两种以上的dna片段的溶液中。由此，能够更简便地进行本发明所涉及的dna的产生方法，能够容易地得到目标的连接体。该试剂盒所包含的reca家族重组酶蛋白质以及核酸外切酶可以直接使用在本发明所涉及的dna的产生方法中使用的物质。作为该试剂盒所包含的核酸外切酶，优选3’→5’核酸外切酶，更优选至少包含直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶，进一步优选包含直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶和单链dna特异性3’→5’核酸外切酶这两者。

本发明所涉及的dna片段连接用试剂盒优选还包含核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸的再生酶及其底物。另外，本发明所涉及的dna片段连接用试剂盒还可以包含选自由核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸、镁离子源、碱金属离子源、二甲基亚砜、四甲基氯化胺、聚乙二醇、二硫苏糖醇以及缓冲液构成的群组中的一种以上。它们均可以直接使用在本发明所涉及的dna的产生方法中使用的物质。

本发明所涉及的dna片段连接用试剂盒也优选还包含记载有用于使用该试剂盒进行本发明所涉及的dna的产生方法的规程的书面说明。该规程也可以记载于容纳该试剂盒的容器的表面。

【实施例】

接着，通过实施例等来更详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些例子。

[实施例1]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，反应溶液中的镁离子源浓度和atp浓度的影响。

连接的直链状双链dna片段使用了591bp的直链状双链dna片段即dcw1～dcw7(序列号1～序列号7)。从各直链状双链dna片段的末端起到60个碱基为止的区域为同源区域。即，dcw1的第532个到第591个的60个碱基为用于与dcw2连接的同源区域，由与dcw2的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。dcw2的第532个到第591个的60个碱基为用于与dcw3连接的同源区域，由与dcw3的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。dcw3的第532个到第591个的60个碱基为用于与dcw4连接的同源区域，由与dcw4的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。dcw4的第532个到第591个的60个碱基为用于与dcw5连接的同源区域，由与dcw5的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。dcw6的第532个到第591个的60个碱基为用于与dcw7连接的同源区域，由与dcw7的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。

作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的野生型(序列号61)，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw1～dcw7、1μm的reca、40mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm或10mm的乙酸镁、30μm、100μm、300μm或1000μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、50mm的谷氨酸钾、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育2小时而进行连接反应。对1μl的反应结束后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybr(注册商标)green染色。

将染色结果示于图2。图中，“500bp”表示从500bp到5kbp使由500bp间隔的条带(合计10条)构成的dna梯状标志进行泳动后的泳道，“input”表示使1μl的含有各1nm的dcw1～dcw7的溶液进行泳动后的泳道。另外，图中，“7frag”表示由dcw1～dcw7的7片段全部连接而得的连接体的条带。

就乙酸镁为1mm的反应溶液而言，在atp浓度为30μm的反应溶液中几乎未观察到连接体，但在atp浓度为100μm、300μm、1000μm的反应溶液中，观察到从2片段的连接体到7片段的连接体的共计6种连接体的条带。若对atp浓度为100μm、300μm、1000μm的反应溶液的结果进行比较，则atp浓度为100μm的反应溶液的由7片段全部连接而得的连接体的量最多，另外未检测到未连接的片段的条带。与此相对地，atp浓度为1000μm的反应溶液中，7片段的连接体的条带非常淡，未连接的片段也大量残存。另一方面，就乙酸镁为10mm的反应溶液而言，在atp浓度为30μm和100μm的反应溶液中，观察到从2片段的连接体到7片段的连接体的共计6种连接体的条带。另一方面，在atp浓度为300μm和1000μm的反应溶液中，尽管确认到从2片段的连接体到4片段的连接体的条带，但未能确认到5片段以上的连接体的条带，未连接的片段也大量残存。在全部样本中，7片段连接体的产生量最多的是乙酸镁为1mm、atp为100μm的反应溶液。由这些结果可知，为了连接多片段，反应溶液的镁离子浓度和atp浓度的平衡很重要，若atp浓度过高，则有时反而会阻碍连接反应。

[实施例2]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，反应溶液中的peg8000浓度和atp再生系统的影响。

连接的直链状双链dna片段使用了3100bp或2650bp的直链状双链dna片段即lter1～lter5(序列号54～序列号58)。从各直链状双链dna片段的末端起到60个碱基为止的区域为同源区域。即，lter1的第3041个到第3100个的60个碱基为用于与lter2连接的同源区域，由与lter2的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。lter2的第3041个到第3100个的60个碱基为用于与lter3连接的同源区域，由与lter3的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。lter3的第3041个到第3100个的60个碱基为用于与lter4连接的同源区域，由与lter4的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。lter4的第3041个到第3100个的60个碱基为用于与lter5连接的同源区域，由与lter5的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。

作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。分别使用肌酸激酶作为atp再生酶，使用磷酸肌酸作为其底物。

具体而言，首先，制备由各0.03nm的lter1～lter5、1μm的reca的f203w突变体、40mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、10mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、150mm的乙酸钾、0质量％、2质量％、5质量％或10质量％的peg8000所构成的反应溶液。另外，除了不含有磷酸肌酸和肌酸激酶以外，同样地制备反应溶液。接着，将这些反应溶液在30℃下温育30分钟而进行连接反应。对4μl的反应结束后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图3。图中，“5frag”表示由lter1～lter5的5片段全部连接而得到的连接体的条带。就不含有磷酸肌酸和肌酸激酶的反应溶液而言，在peg8000浓度为0质量％的反应溶液中，尽管确认到2片段连接体和3片段连接体的条带，但未能确认到4片段以上的连接体的条带。与此相对地，若提高peg8000浓度，则还能够确认到4片段和5片段的连接体的条带。另一方面，就含有磷酸肌酸和肌酸激酶的反应溶液而言，在peg8000浓度为0质量％的反应溶液中，尽管确认到2片段连接体、3片段连接体和4片段连接体的条带，但未能确认到5片段的连接体的条带。与此相对地，若提高peg浓度，则还能够确认到5片段的连接体的条带。根据对peg8000浓度为0质量％的反应溶液进行比较的结果可知，包含atp再生系统的反应溶液更容易得到多片段的连接体。另外，在不含有磷酸肌酸和肌酸激酶的反应溶液与含有两者的反应溶液中的任一者中，与未添加peg的反应溶液相比，添加了peg的反应溶液的5片段连接体的产生量变多。由此可知，通过peg可促进连接。在所有的样本中，未连接的片段少、且5片段连接体的量最多的是含有磷酸肌酸与肌酸激酶、且peg8000为5质量％的反应溶液。

[实施例3]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，反应溶液中的dmso浓度的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw5(序列号1～序列号5)。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw1～dcw5、1μm的reca的f203w突变体、40mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、10mm的乙酸镁、100μm的atp、150mm的乙酸钾、5质量％的peg8000、以及0体积％、1体积％、3体积％或10体积％的dmso所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在30℃下温育30分钟而进行连接反应。对2μl的反应结束后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图4中的(a)。图中，“mk3”表示使dna梯状标志进行泳动后的泳道，“input”表示使2μl的含有各1nm的dcw1～dcw5的溶液进行泳动后的泳道。其结果是，在进行了连接反应的所有样本中，确认到由5片段全部连接而得到的连接体的条带，但在dmso浓度为10体积％的反应溶液中，与其他反应溶液相比，5片段连接体的量明显较多。

接着，除了使dmso浓度为0体积％、10体积％、20体积％或40体积％以外，同样地制备反应溶液，将这些反应溶液在30℃下温育30分钟而进行连接反应。对2μl的反应结束后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图4中的(b)。图中，“500bpladder”表示使实施例1中使用的dna梯状标志进行泳动后的泳道，“input”与图4中的(a)相同。其结果是，在dmso浓度为10体积％或20体积％的反应溶液中，与未添加dmso的反应溶液相比，由5片段全部连接而得到的连接体的产生量明显增大，但在dmso浓度为40体积％的反应溶液中，未能确认到连接体的条带，连接受到了阻碍。由这些结果可知，通过含有5体积％以上的dmso，虽然促进了连接反应，但若dmso浓度过高，则反而会阻碍连接反应。

[实施例4]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，反应溶液中的tmac浓度的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw7(序列号1～序列号7)。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw1～dcw7、1μm的reca的f203w突变体、40mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、10mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、150mm的谷氨酸钾、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、以及0mm、15mm、30mm、60mm或100mm的tmac所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在37℃下温育2小时而进行连接反应。对1.5μl的反应结束后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图5中的(a)。图中，“500bpladder”表示使实施例1中使用的dna梯状标志进行泳动后的泳道，“input”表示使1μl的含有各1nm的dcw1～dcw7的溶液进行泳动后的泳道。其结果是，在进行了连接反应的所有样本中，确认到由7片段全部连接而得到的连接体的条带。特别是在tmac浓度为100mm的反应溶液中，与其他反应溶液相比，7片段连接体的量明显较多。

接着，除了将tmac的浓度设为60mm、100mm、150mm、200mm或250mm、且将谷氨酸钾的浓度设为50mm以外，同样地制备反应溶液，将这些反应溶液在42℃下温育2小时而进行连接反应。对1.9μl的反应结束后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图5中的(b)。其结果是，在tmac浓度为100mm～200mm的反应溶液中，与tmac浓度为60mm的反应溶液相比，7片段连接体的量明显较多，连接效率得到了改善。7片段连接体的量最多的是tmac浓度为150mm的反应溶液。另一方面，在tmac浓度为250mm的反应溶液中，7片段连接体的量比tmac浓度为60mm的反应溶液少，另外，未连接的片段的残留量较多。由这些结果可知，通过含有100～200mm的tmac，能够促进连接反应。

[实施例5]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，反应溶液中的碱金属离子源的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw7或dcw1～dcw5。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw1～dcw5、1μm的reca的f203w突变体、40mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、10mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、0mm、50mm、75mm、100mm、125mm或150mm的乙酸钾、5质量％的peg8000、以及10体积％的dmso所构成的反应溶液。另外，除了代替乙酸钾而含有150mm的谷氨酸钾以外，同样地制备反应溶液。接着，将这些反应溶液在30℃下温育2小时而进行连接反应。对2μl的反应结束后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图6。在不含有碱金属离子源的反应溶液中，未能确认到5片段齐全的连接体的条带，但在含有乙酸钾或谷氨酸钾的反应溶液中，全部能够确认到5片段齐全的连接体的条带。特别是，由于在含有谷氨酸钾的反应溶液中，与含有乙酸钾的反应溶液相比，未连接的片段的条带较淡，因此推测与乙酸钾相比，谷氨酸钾的改善连接效率的效果应该更高。

接着，作为连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw7，配合各1nm的dcw1～dcw7，作为碱金属离子源使用谷氨酸钾，使谷氨酸钾的浓度为50mm或150mm，除此以外同样地制备反应溶液。将这些反应溶液在37℃、42℃或45℃下温育1小时而进行连接反应。对1μl的反应结束后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图7。图中，“500bpladder”表示使实施例1中使用的dna梯状标志进行泳动后的泳道，“input”表示使1μl的含有各1nm的dcw1～dcw7的溶液进行泳动后的泳道。其结果是，在反应温度37℃和42℃的任一温度下，与谷氨酸钾浓度为150nm的反应溶液相比，谷氨酸钾浓度为50mm的反应溶液的连接效率较高，且能够确认到7片段齐全的连接体的条带。由这些结果可知，若谷氨酸钾浓度过高，则有时反而会阻碍连接反应。另外，在45℃下进行了温育的反应溶液中，即使谷氨酸钾浓度为50mm，也未能确认到7片段连接体的条带。7片段连接体的量最多的是谷氨酸钾浓度为50mm、在42℃下进行了温育的反应溶液。

[实施例6]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，反应溶液中的各直链状双链dna片段的摩尔比的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw7。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw1～dcw7、1μm的reca的f203w突变体、40mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、10mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、50mm的谷氨酸钾、5质量％的peg8000、以及10体积％的dmso所构成的反应溶液。另外，除了以仅使dcw3变为2nm的方式含有该dcw3以外，同样地制备反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育2小时而进行连接反应。对1μl的反应结束后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图8。图中，“500bpladder”表示使实施例1中使用的dna梯状标志进行泳动后的泳道，“input”表示使1μl的含有各1nm的dcw1～dcw7的溶液进行泳动后的泳道。另外，“等量(eaual)”表示使含有dcw1～dcw7均各1nm的反应溶液进行泳动后的泳道。“两倍过量的第三片段”表示使含有dcw1～dcw7中的仅dcw3为2nm而其他片段均各为1nm的反应溶液进行泳动后的泳道。其结果是，在任一反应溶液中均确认到7片段的连接体，但在含有仅dcw3为两倍量(摩尔)的反应溶液中，7片段的连接体的量减少，3片段的连接体和5片段的连接体的量增大。推测这是因为，由于过量的dcw3，由dcw1～dcw3连接而得到的连接体和由dcw3～dcw7连接而得到的连接体增加。由这些结果可知，通过以使连接的各片段的摩尔比成为等量的方式制备反应溶液，从而能够更加改善多片段的连接效率。

[实施例7]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，反应溶液中的3’→5’核酸外切酶的浓度和反应时间的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw7。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的野生型，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw1～dcw7、1μm的大肠杆菌reca的野生型、20mu/μl、40mu/μl、80mu/μl、120mu/μl或160mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、50mm的谷氨酸钾、150mm的tmac、5质量％的peg8000、以及10体积％的dmso所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育15分钟、30分钟或60分钟而进行连接反应。对1μl的反应结束后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图9。图中，“500bpladder”表示使实施例1中使用的dna梯状标志进行泳动后的泳道，“input”表示使1μl的含有各1nm的dcw1～dcw7的溶液进行泳动后的泳道。其结果是，在核酸外切酶iii浓度为20mu/μl的反应溶液中，即使温育时间为60分钟，也几乎没有形成连接体。与此相对地，在核酸外切酶iii浓度为40mu/μl的反应溶液中，在温育时间为30分钟时几乎没有形成连接体，但温育时间为60分钟时形成了7片段齐备的连接体。另外，在核酸外切酶iii浓度为80～160mu/μl的反应溶液中，即使温育时间为15分钟，也形成了7片段齐备的连接体。7片段连接体的量最多、多片段的连接效率最佳的是核酸外切酶iii浓度为80mu/μl、进行了30分钟温育的反应溶液。

[实施例8]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，反应溶液中的直链状双链dna片段的浓度的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw49(序列号1～序列号49)。与dcw1～dcw7同样地，从dcw8～dcw49各自的末端起到60个碱基为止的区域是同源区域。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的野生型，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各1nm或各0.5nm的直链状双链dna片段、1μm的大肠杆菌reca的野生型、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、50mm的谷氨酸钾、150mm的tmac、5质量％的peg8000、以及10体积％的dmso所构成的反应溶液。在含有各1nm的dcw1～dcw20的反应溶液中，直链状双链dna片段的总量为20nm(7.8ng/μl)。在含有各1nm的dcw1～dcw25的反应溶液中，直链状双链dna片段的总量为25nm(9.8ng/μl)。在含有各1nm的dcw1～dcw30的反应溶液中，直链状双链dna片段的总量为30nm(11.7ng/μl)。在含有各1nm的dcw1～dcw40的反应溶液中，直链状双链dna片段的总量为40nm(15.6ng/μl)。在含有各1nm的dcw1～dcw49的反应溶液中，直链状双链dna片段的总量为49nm(19.1ng/μl)。在含有各0.5nm的dcw1～dcw49的反应溶液中，直链状双链dna片段的总量为24.5nm(9.6ng/μl)。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应。对反应结束后的反应溶液取以下体积进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。使用了各1nm的dcw1～dcw20的反应溶液为1.25μl，使用了各1nm的dcw1～dcw25的反应溶液为1μl，使用了各1nm的dcw1～dcw30的反应溶液为0.83μl，使用了各1nm的dcw1～dcw40的反应溶液为0.63μl，使用了各1nm的dcw1～dcw49的反应溶液为0.51μl，使用了各0.5nm的dcw1～dcw49的反应溶液为1.02μl。

将染色结果示于图10。在含有各1nm的各个直链状双链dna片段的反应溶液中，所含有的片段数越多、即反应溶液中的直链状双链dna片段的总量越多，则越难以形成多片段的连接体。另外，对含有dcw1～dcw49的反应溶液彼此进行了比较，与含有各1nm的反应溶液相比，含有各0.5nm的反应溶液更能得到多片段的连接体。由这些结果启示了，若反应溶液中的直链状双链dna片段的总量过多，则有可能阻碍连接效率。

[实施例9]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，reca家族重组酶蛋白质的种类的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw25(序列号1～序列号25)。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的野生型或f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw1～dcw25、0.5μm、0.75μm、1μm，1.25μm或1.5μm的大肠杆菌reca的野生型或f203w突变体、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、50mm的谷氨酸钾、150mm的tmac、5质量％的peg8000、以及10体积％的dmso所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育20分钟。对1.5μl的在65℃下的温育结束后在冰上进行了急冷的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图11。图中，“500bpladder”表示使实施例1中使用的dna梯状标志进行泳动后的泳道，“input”表示使1.5μl的含有各1nm的dcw1～dcw25的溶液进行泳动后的泳道。其结果是，无论是野生型和f203w突变体中的哪一者，多片段的连接体的产生量都依赖于reca的含量而增多。另外，与含有野生型reca的反应溶液相比，含有f203w突变体的反应溶液的多片段的连接体的产生量较多，连接效率较高。

[实施例10]

使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接而形成环状的连接体，对其进行rcr扩增。

作为连接的直链状双链dna片段，首先，使用dcw1～dcw20(序列号1～序列号20)与cm-oric(dcw20)(序列号50)的套组，所述cm-oric包含oric以及相对于oric分别向外插入的一对ter序列。ter序列是供具有方向特异性地使复制停止的功能的蛋白质tus结合的序列。就ter序列而言，“相对于oric向外插入”是指按照如下方向插入ter序列：利用具有与ter序列结合而阻碍复制的活性的蛋白质的组合的作用，针对朝向比oric靠外侧的方向上的复制而允许复制，另一方面，针对朝向oric进入方向上的复制而不允许复制并使其停止。cm-oric(dcw20)是1298bp的直链状双链dna片段，第1个到第60个的60个碱基是用于与dcw20的连接的同源区域，由与dcw20的第532个到第591个的60个碱基同一的碱基序列构成。另外，cm-oric(dcw20)的第1239个到第1298个的60个碱基为用于与dcw1的连接的同源区域，由与dcw1的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。即，若dcw1～dcw20以及cm-oric(dcw20)的21片段全部连接，则能得到环状dna。

作为连接的直链状双链dna片段，除此以外，使用dcw1～dcw25(序列号1～序列号25)与包含oric的cm-oric(dcw25)(序列号51)的套组。cm-oric(dcw25)是1298bp的直链状双链dna片段，第1个到第60个的60个碱基是用于与dcw25连接的同源区域，由与dcw25的第532个到第591个的60个碱基同一的碱基序列构成。另外，cm-oric(dcw25)的第1239个到第1298个的60个碱基为用于与dcw1的连接的同源区域，由与dcw1的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。即，若dcw1～dcw25以及cm-oric(dcw25)的26片段全部连接，则能得到环状dna。

作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。进而，作为rcr扩增反应液，使用在表1所示的组成的反应用混合物中包含60nm的tus的混合液。tus是从tus的大肠杆菌表达菌株中通过包含亲和柱层析以及凝胶过滤柱层析的工序进行纯化、制备的。

【表1】

表1中，ssb表示来源于大肠杆菌的ssb，ihf表示来源于大肠杆菌的ihfa以及ihfb的复合物，dnag表示来源于大肠杆菌的dnag，dnan表示来源于大肠杆菌的dnan，poliii*表示由来源于大肠杆菌的dnax、hola、holb、holc、hold、dnae、dnaq以及hole构成的复合物、即dna聚合酶iii*复合物，dnab表示来源于大肠杆菌的dnab，dnac表示来源于大肠杆菌的dnac，dnaa表示来源于大肠杆菌的dnaa，rnaseh表示来源于大肠杆菌的rnaseh，ligase表示来源于大肠杆菌的dna连接酶，poli表示来源于大肠杆菌的dna聚合酶i，gyra表示来源于大肠杆菌的gyra，gyrb表示来源于大肠杆菌的gyrb，topoiv表示来源于大肠杆菌的parc以及pare的复合物，topoiii表示来源于大肠杆菌的拓扑异构酶iii，recq表示来源于大肠杆菌的recq。

ssb是从ssb的大肠杆菌表达菌株中通过包含硫酸铵沉淀和离子交换柱层析的工序进行纯化、制备的。

ihf是从ihfa以及ihfb的大肠杆菌共表达菌株中通过包含硫酸铵沉淀以及亲和柱层析的工序进行纯化、制备的。

dnag是从dnag的大肠杆菌表达菌株中通过包含硫酸铵沉淀、阴离子交换柱层析以及凝胶过滤柱层析的工序进行纯化、制备的。

dnan是从dnan的大肠杆菌表达菌株中通过包含硫酸铵沉淀以及阴离子交换柱层析的工序进行纯化、制备的。

poliii*是从dnax、hola、holb、holc、hold、dnae、dnaq以及hole的大肠杆菌共表达菌株中通过包含硫酸铵沉淀、亲和柱层析以及凝胶过滤柱层析的工序进行纯化、制备的。

dnab以及dnac是从dnab以及dnac的大肠杆菌共表达菌株中通过包含硫酸铵沉淀、亲和柱层析以及凝胶过滤柱层析的工序进行纯化、制备的。

dnaa是从dnaa的大肠杆菌表达菌株中通过包含硫酸铵沉淀、透析沉淀以及凝胶过滤柱层析的工序进行纯化、制备的。

gyra以及gyrb是从gyra的大肠杆菌表达菌株和gyrb的大肠杆菌表达菌株的混合物中通过包含硫酸铵沉淀、亲和柱层析以及凝胶过滤柱层析的工序进行纯化、制备的。

topoiv是从parc的大肠杆菌表达菌株和pare的大肠杆菌表达菌株的混合物中通过包含硫酸铵沉淀、亲和柱层析以及凝胶过滤柱层析的工序进行纯化、制备的。

topoiii是从topoiii的大肠杆菌表达菌株中通过包含硫酸铵沉淀以及亲和柱层析的工序进行纯化、制备的。

recq是从recq的大肠杆菌表达菌株中通过包含硫酸铵沉淀、亲和柱层析以及凝胶过滤柱层析的工序进行纯化、制备的。

rnaseh、ligase、poli使用市售的来源于大肠杆菌的酶(宝生物工程公司制)。

具体而言，首先，制备由2.5nm或5nm的直链状双链dna片段套组、1μm的reca的f203w突变体、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、50mm的谷氨酸钾、5质量％的peg8000、以及10体积％的dmso所构成的反应溶液。作为直链状双链dna片段套组，使用全部等摩尔的含有上述dcw1～dcw20以及cm-oric(dcw20)的套组、或者全部等摩尔的含有dcw1～dcw25以及cm-oric(dcw25)的套组。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育20分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。关于热处理、急冷后的反应溶液，对1μl的包含2.5nm的直链状双链dna片段套组进而经热处理、急冷后的反应溶液、0.5μl的包含5nm的直链状双链dna片段套组进而经热处理、急冷后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图12中的(a)。图中，“1-20”表示使包括全部等摩尔的含有dcw1～dcw20以及cm-oric(dcw20)的直链状双链dna片段套组的反应溶液进行泳动后的泳道。“1-25”表示使包括全部等摩尔的含有dcw1～dcw25以及cm-oric(dcw25)的直链状双链dna片段套组的反应溶液进行泳动后的泳道。其结果能够确认，在任一反应溶液中均含有各种大小的连接体。

接着，将0.5μl的热处理、急冷后的反应溶液添加到4.5μl的rcr扩增反应液中来制备反应混合物。将该反应混合物在30℃下温育13小时，由此进行rcr扩增反应。对1μl的反应结束后的反应混合物进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图12中的(b)。图中，“1-20”和“1-25”与图12中的(a)同源。其结果是，在使dcw1～dcw20和cm-oric(dcw20)的套组连接后的反应溶液的rcr扩增物的泳道中，观察到21片段的环状连接体的超螺旋的条带(图中，“21片段超螺旋”)。在使dcw1～dcw25和cm-oric(dcw25)套组连接后的反应溶液的rcr扩增物的泳道中，观察到26片段的环状连接体的超螺旋的条带(图中，“26片段超螺旋”)。另外，与在连接反应后的反应溶液(图12中的(a))中检测到大量的条带相对地，在rcr扩增后的反应混合物(图12中的(b))中仅检测到几条条带，因此能够确认只有环状的连接体通过rcr扩增而被扩增。

[实施例11]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接而形成环状的连接体并对其进行rcr扩增的方法中，rcr扩增前的热处理、急冷的影响。

作为连接的直链状双链dna片段，使用实施例10中所使用的“全部等摩尔的含有dcw1～dcw25以及cm-oric(dcw25)的直链状双链dna片段套组”(20nm的直链状双链dna片段套组)。作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。进而，作为rcr扩增反应液，使用在表1所示的组成的反应用混合物中包含60nm的tus的混合液。

具体而言，首先，制备由20nm的直链状双链dna片段套组、1.5μm的reca的f203w突变体、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、50mm的谷氨酸钾、150mm的tmac、5质量％的peg8000、以及10体积％的dmso所构成的反应溶液。接着，将该反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在50℃或65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对1.5μl的急冷后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图13中的(a)。图中，“500bpladder”表示使实施例1中使用的dna梯状标志进行泳动后的泳道，“input”表示使1.5μl的含有20nm的直链状双链dna片段套组的溶液进行泳动后的泳道。另外，“-”表示使未进行连接反应后的热处理的反应溶液进行泳动后的泳道。“50℃”表示使在50℃下温育2分钟而进行了热处理的反应溶液进行泳动后的泳道。“65℃”表示使在65℃下温育2分钟而进行了热处理的反应溶液进行泳动后的泳道。如图13中的(a)所示，在未进行热处理的反应溶液中，未进行泳动而形成模糊的条带，与此相对地，在热处理后的反应溶液中，大部分模糊的条带被消除。

接着，将0.5μl的热处理、急冷后的反应溶液添加到4.5μl的rcr扩增反应液中来制备反应混合物。通过将该反应混合物在30℃下温育13小时来进行rcr扩增反应。作为对照，将0.5μl的65℃的热处理、急冷后的反应溶液添加到4.5μl的由10mm的tris-hcl(ph8.0)、1mm的edta构成的te溶液中来制成扩增前溶液。对1μl的扩增前溶液以及反应结束后的反应混合物进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图13中的(b)。图中，“mk3”表示使dna梯状标志进行泳动后的泳道。其结果是，在对由连接反应形成了环状连接体的反应溶液进行了rcr扩增的反应混合物中，观察到26片段的环状连接体的超螺旋的条带(图中，“25片段scdna”)(图13中的(b)中，“-”、“50℃”、“65℃”)。在扩增前溶液(图13中的(b)中，“input”)中未观察到条带。在未进行热处理的反应混合物(“-”)中，在与26片段的环状连接体的超螺旋的条带相比泳动距离较长的部位观察到两条宽幅的条带，但在50℃下进行了热处理的反应混合物(“50℃”)中，这些条带变淡，在65℃下进行了热处理的反应混合物(“65℃”)中，未检测到这些条带。由这些结果可知，与26片段的环状连接体的超螺旋的条带相比泳动距离长的条带是由非特异性连接而产生的环状连接体的扩增产物，而通过在rcr扩增前进行热处理、急冷，能够抑制这样的非特异性扩增产物。

[实施例12]

使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将26种或36种直链状双链dna片段连接而形成环状的连接体，对其进行rcr扩增。

作为连接的直链状双链dna片段，使用dcw1～dcw25(序列号1～序列号25)与包含oric的km-oric(dcw25)(序列号52)的套组。km-oric(dcw25)为1509bp的直链状双链dna片段，第1个到第60个的60个碱基为用于与dcw25连接的同源区域，且由与dcw25的第532个到第591个的60个碱基同一的碱基序列构成。另外，km-oric(dcw25)的第1450个到第1509个的60个碱基为用于与dcw1的连接的同源区域，由与dcw1的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。即，若dcw1～dcw25以及km-oric(dcw25)的26片段全部连接，则能得到环状dna。

作为连接的直链状双链dna片段，除此之外，使用dcw1～dcw35(序列号1～序列号35)与km-oric(dcw35)(序列号53)的套组，所述km-oric包含oric以及相对于oric分别向外插入的一对ter序列。km-oric(dcw35)为1509bp的直链状双链dna片段，第1个到第60个的60个碱基为用于与dcw35连接的同源区域，且由与dcw35的第532个到第591个的60个碱基同一的碱基序列构成。另外，km-oric(dcw35)的第1450个到第1509个的60个碱基为用于与dcw1的连接的同源区域，由与dcw1的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。即，若dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)的36片段全部连接，则能得到环状dna。

作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。进而，作为rcr扩增反应液，使用在表1所示的组成的反应用混合物中包含60nm的tus的混合液。

具体而言，首先，制备由20nm的直链状双链dna片段套组、1.5μm的reca的f203w突变体、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、50mm的谷氨酸钾、150mm的tmac、5质量％的peg8000、以及10体积％的dmso所构成的反应溶液。作为直链状双链dna片段套组，使用全部等摩尔的含有上述dcw1～dcw25以及km-oric(dcw25)的套组、或者全部等摩尔的含有dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)的套组。接着，将该反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育5分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对1.5μl的急冷后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图14中的(a)。图中，“input”表示使1.5μl的含有20nm的直链状双链dna片段套组的溶液进行泳动后的泳道。另外，“dcw1-25km-oric”表示使包括全部等摩尔的含有上述dcw1～dcw25以及km-oric(dcw25)的套组进行泳动后的泳道。“dcw1-35km-oric”表示使包括全部等摩尔的含有上述dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)的套组进行泳动后的泳道。如图14中的(a)所示，在使用任一直链状双链dna片段套组的情况下，都通过连接反应得到了多片段的连接体。

接着，将0.5μl的热处理、急冷后的反应溶液添加到4.5μl的rcr扩增反应液中来制备反应混合物。通过将该反应混合物在30℃下温育16小时来进行rcr扩增反应。接着，将0.5μl的各rcr扩增反应物分别在4.5μl的从表1所示的反应用混合物中仅除去酶组而得的混合物中(反应缓冲液)进行稀释后，在30℃下进行30分钟再温育。稀释后的再温育处理具有促进产物中的扩增中间体的复制延伸、分离反应而提高作为最终产物的超螺旋dna的产生量的效果。作为对照，将0.5μl的使用dcw1～dcw25进行了连接反应以及热处理、急冷后的反应溶液添加到4.5μl的由10mm的tris-hcl(ph8.0)、1mm的edta构成的te溶液中来制备扩增前溶液。对2.5μl的扩增前溶液以及再温育结束后的反应混合物进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图14中的(b)。其结果是，在将26片段的直链状双链dna片段套组连接后进行rcr扩增的反应混合物中，观察到26片段的环状连接体的超螺旋的条带(图中，“26片段scdna”)(图13中的(b)中，“dcw1-25km-oric”)。在将36片段的直链状双链dna片段套组连接后进行rcr扩增的反应混合物中，观察到36片段的环状连接体的超螺旋的条带(图中，“36片段scdna”)(图13中的(b)中，“dcw1-35km-oric”)。在扩增前溶液(图14中的(b)中，“input”)中未观察到条带。由这些结果能够确认，根据本发明，能够得到36片段这样的多片段的环状连接体，该环状连接体能够通过rcr扩增而进行扩增。其中，与26片段的连接反应物相比，36片段的连接反应物的基于rcr扩增的非特异性扩增产物较多。

[实施例13]

市售有在利用gibsonassembly法(专利文献3)连接多个双链dna片段的方法中所使用的试剂盒“nebuilderhifidnaassembly”(neb公司制)。在该试剂盒中，将在末端具有15～20个碱基的同源区域的两种以上的直链状双链dna片段添加到包含5’→3’核酸外切酶、dna聚合酶以及dna连接酶的该试剂盒所附带的混合溶液(mastermix)中，并通过在50℃下进行15～60分钟温育的方法(neb法)进行连接。

对使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶进行连接反应的本发明所涉及的dna的产生方法与neb法的连接效率进行比较。

作为连接的直链状双链dna片段，使用实施例12中所使用的全部等摩尔的含有dcw1～dcw25以及km-oric(dcw25)的套组。作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。进而，作为rcr扩增反应液，使用在表1所示的组成的反应用混合物中包含60nm的tus的混合液。

具体而言，首先，作为本发明所涉及的方法(ra法)，制备由20nm或60nm的直链状双链dna片段套组、1.5μm的reca的f203w突变体、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、100μm的atp、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、50mm的谷氨酸钾、150mm的tmac、5质量％的peg8000、以及10体积％的dmso所构成的反应溶液。接着，将该反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育5分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对1.5μl的急冷后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

另外，作为neb法，制备在将上述试剂盒所附带的2×mastermix稀释2倍后的溶液中混合20nm或60nm的直链状双链dna片段套组而得的反应溶液，将该反应溶液在50℃下温育60分钟而进行连接反应。对1.5μl的连接反应后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图15中的(a)。图中，“input”表示使1.5μl的含有20nm的直链状双链dna片段套组的溶液进行泳动后的泳道。另外，“ra”表示使由本发明所涉及的方法(ra法)制备的反应溶液进行泳动后的泳道，“neb”表示使由neb法制备的反应溶液进行泳动后的泳道。如图15中的(a)所示，在直链状双链dna片段套组的含量为20nm和60nm中的任一者的情况下，在由ra法进行了连接反应的反应溶液中，都得到了由片段数较多的片段连接而成的连接体。与此相对，在利用neb法进行了连接反应的反应溶液中，只能得到2～3片段的连接体。

接着，将0.5μl的各反应溶液添加到4.5μl的rcr扩增反应液中来制备反应混合物。将该反应混合物在30℃下温育16小时，由此进行rcr扩增反应。接着，将0.5μl的各rcr扩增反应物分别在4.5μl的从表1所示的反应用混合物中仅除去酶组而得的混合物(反应缓冲液)中进行稀释后，在30℃下进行30分钟再温育。对2.5μl的再温育结束后的反应混合物进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图15中的(b)。其结果是，在对由本发明所涉及的方法(ra法)进行了连接反应的反应溶液进行rcr扩增后的反应混合物(图中，“ra”)中，检测到由26片段全部连接而得到的环状连接体的扩增产物的条带(图中，“25片段超螺旋”)。另一方面，在对由neb法进行了连接反应的反应溶液进行rcr扩增后的反应混合物(图中，“neb”)中，未检测到26片段的环状连接体的扩增产物的条带，通过neb法未能使26片段连接。另外，在任一反应混合物中，均在琼脂糖凝胶电泳的分离边界的位置(图中，“多聚体”)上检测到通过非特异性的滚环式复制的进行而成为串联体的产物、在复制后未分离而就此残留的环状dna多聚体产物(连环体，catenane)。

[实施例14]

将长链基因组的片段彼此连接，形成环状连接体，然后通过rcr扩增使其扩增。

作为长链基因组的片段，使用大肠杆菌菌株(dgf-298wδ100：：revδ234：：sc)的基因组dna的xbai消化物(15片段，dgf-298/xbai)，其中，使325kbp的基因组片段(325k基因组片段)和220kbp的基因组片段(220k基因组片段)分别与包含oric的连接用片段(cm-oric片段)连接而形成环状。作为使325k基因组片段环化的连接用片段，使用包含oric且在上游末端具有与325k基因组片段的下游末端同源的同源区域(即，上游末端的60个碱基由与325k基因组片段的下游末端的60个碱基同一的碱基序列构成)、在下游末端具有与325k基因组片段的上游末端同源的同源区域(即，下游末端的60个碱基由与325k基因组片段的上游末端的60个碱基同一的碱基序列构成)的1298bp的直链状双链dna片段(cm-oric/325k片段、序列号59)。作为使220k基因组片段环化的连接用片段，使用包含oric且在上游末端具有与220k基因组片段的下游末端同源的同源区域(即，上游末端的60个碱基由与220k基因组片段的下游末端的60个碱基同一的碱基序列构成)、在下游末端具有与220k基因组片段的上游末端同源的同源区域(即，下游末端的60个碱基由与220k基因组片段的上游末端的60个碱基同一的碱基序列构成)的1298bp的直链状双链dna片段(cm-oric/220k片段、序列号60)。进而，作为rcr扩增反应液，使用表1所示的组成的反应用混合物。

具体而言，将大肠杆菌基因组dna的xbai消化物(dgf-298/xbai，4.8ng/μl)和具有与作为连接对象基因组片段的325k基因组片段同源的同源区域的cm-oric/325k片段(240pm)加入ra反应液[20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、150mm的koac，10mm的mg(oac)2、100μm的atp、5质量％的peg8000、40mu/μl的核酸外切酶iii、1μm的大肠杆菌reca的f203w突变体](5μl)，在30℃下温育60分钟而进行连接反应。将0.5μl得到的ra产物加入rcr扩增反应液(4.5μl)中，进行使用了温度循环(以37℃下1分钟、接着24℃下30分钟作为一个循环，将其重复40个循环)的扩增反应。将连接对象基因组片段设为220kbp，并使用cm-oric/220k片段代替cm-oric/325k片段来同样地进行连接反应后，进行rcr扩增。作为对照，针对200kbp的环状oric质粒同样地进行rcr扩增。在325k基因组片段连接产物的rcr扩增反应液中，为了长链dna稳定化而添加50μm的二亚乙基三胺五乙酸。

对1μl的反应结束后的反应混合物进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。将染色结果示于图16。图中，“220kb”表示使在将连接对象基因组片段设为220kbp的反应中得到的扩增产物进行泳动后的泳道。“325kb”表示使在将连接对象基因组片段设为325kbp的反应中得到的扩增产物进行泳动后的泳道。“200kb(rcr对照)”表示使对200kbp的环状oric质粒直接扩增而得到的产物进行泳动后的泳道。其结果是，分别在将连接对象基因组片段设为220kbp的反应中检测到220kbp的环状连接体的超螺旋，在将连接对象基因组片段设为325kbp的反应中，检测到325kbp的环状连接体的超螺旋。由这些结果可以确认，通过本发明所涉及的dna的产生方法，能够将325kbp的长链的双链dna片段环化。

[实施例15]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，包含由肌酸激酶和磷酸肌酸构成的atp再生路径的反应溶液中的磷酸肌酸浓度的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw10(序列号1～序列号10)。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各2nm的dcw1～dcw10、1.5μm的reca的f203w突变体、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、20ng/μl的肌酸激酶、以及0mm(无添加)、0.1mm、0.4mm、1mm、4mm或10mm的磷酸肌酸所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图17。图中，“input”表示使2μl的含有各2nm的dcw1～dcw10的溶液进行泳动后的泳道。其结果是，在进行了连接反应的样本中的磷酸肌酸浓度为0.4～10mm的样本中，确认到了由10片段全部连接而得的连接体的条带。特别是在磷酸肌酸浓度为1mm或4mm的样本中，10片段的连接体的量较多，其中，4mm的样本的2～9片段的连接体的量也较多，可知连接效率优异。

[实施例16]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，包含由肌酸激酶和磷酸肌酸构成的atp再生路径的反应溶液中的肌酸激酶浓度的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw10(序列号1～序列号10)。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各2nm的dcw1～dcw10、1.5μm的reca的f203w突变体、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、4mm的磷酸肌酸、以及0ng/μl(无添加)、5ng/μl、20ng/μl、50ng/μl或200ng/μl的肌酸激酶所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图18。图中，“input”表示使2μl的含有各2nm的dcw1～dcw10的溶液进行泳动后的泳道，“缓冲液”表示使肌酸激酶为无添加(0ng/μl)的样本进行泳动后的泳道。其结果是，在进行了连接反应的样本中的添加了肌酸激酶的全部样本中，确认到由10片段全部连接而得到的连接体的条带。

[实施例17]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，由丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸构成的atp再生系统的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw35(序列号1～序列号35)与km-oric(dcw35)(序列号53)的套组，所述km-oric包含oric以及相对于oric分别向外插入的一对ter序列。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各0.6nm的dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)、1.5μm的reca的f203w突变体、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、2mm的磷酸烯醇丙酮酸、以及10ng/μl、32ng/μl或100ng/μl的丙酮酸激酶所构成的反应溶液。另外，作为比较对象还得到了除了代替2mm的磷酸烯醇丙酮酸而混合了2mm的磷酸肌酸且代替丙酮酸激酶而混合了20ng/μl的肌酸激酶以外同样地制备的反应溶液、与除了不含有磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶以外同样地制备的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图19。图中，“input”表示使2μl的含有各0.6nm的dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)的溶液进行泳动后的泳道。“-atp再生”表示使不含有磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶的样本进行泳动后的泳道。“cp2mm、ck20ng/μl”表示使含有磷酸肌酸和肌酸激酶的样本进行泳动后的泳道。“pep2mm”表示使含有磷酸烯醇丙酮酸和各浓度的丙酮酸激酶的样本进行泳动后的泳道。其结果是，在包含由2mm的磷酸烯醇丙酮酸和100ng/μl的丙酮酸激酶构成的atp再生系统的样本中，与包含由磷酸肌酸和肌酸激酶构成的atp再生系统的样本同样地确认到了由多片段连接而得到的连接体的条带。

[实施例18]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，由聚磷酸激酶和聚磷酸构成的atp再生系统的影响。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw10(序列号1～序列号10)。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii。

具体而言，首先，制备由各2nm的dcw1～dcw10、1μm的reca的野生型、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、以及20ng/μl的聚磷酸激酶、1mm、4mm或10mm的聚磷酸、20ng/μl、60ng/μl、或150ng/μl的聚磷酸激酶所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图20。图中，“input”表示使2μl的含有各2nm的dcw1～dcw10的溶液进行泳动后的泳道。其结果是，在进行了连接反应的样本中的添加了60ng/μl的聚磷酸激酶和1mm的聚磷酸的样本中，确认到由10片段全部连接而得的连接体的条带。

[实施例19]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，并用直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶和单链dna特异性3’→5’核酸外切酶的效果。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw10(序列号1～序列号10)。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的野生型，作为直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii，作为单链dna特异性3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶i。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw1～dcw10、1μm的reca的野生型、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、20ng/μl的肌酸激酶、4mm的磷酸肌酸、以及0u/μl(无添加)、0.1u/μl、0.3u/μl或1u/μl的核酸外切酶i所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图21。图中，“input”表示使2μl的含有各1nm的dcw1～dcw10的溶液进行泳动后的泳道。其结果是，在进行了连接反应的所有样本中确认到由10片段全部连接而得的连接体的条带。另外，由10片段全部连接而得的连接体的量依赖于核酸外切酶i的添加量而增多。由这些结果明确了，通过核酸外切酶i的添加，促进了基于核酸外切酶iii和reca的连接反应。

[实施例20]

使用reca家族重组酶蛋白质、直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶、单链dna特异性3’→5’核酸外切酶将36种直链状双链dna片段连接而形成环状的连接体，对其进行rcr扩增。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw35(序列号1～序列号35)与km-oric(dcw35)(序列号53)的套组，所述km-oric包含oric以及相对于oric分别向外插入的一对ter序列。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的野生型，作为直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii，作为单链dna特异性3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶i。进而，作为rcr扩增反应液，使用在表1所示的组成的反应用混合物中包含60nm的tus的混合液。

具体而言，首先，制备由各0.6nm的dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)、1μm的reca的野生型、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、20ng/μl的肌酸激酶、4mm的磷酸肌酸、以及0u/μl(无添加)、0.3u/μl或1u/μl的核酸外切酶i所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图22中的(a)。图中，“input”表示使2μl的含有各0.6nm的dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)的溶液进行泳动后的泳道。如图22中的(a)所示，在任一样本中都确认到了多片段的连接体。另外，核酸外切酶i的添加量越多的样本，片段数较多的片段的连接体的量越多。

接着，将0.5μl的热处理、急冷后的反应溶液添加到4.5μl的rcr扩增反应液中来制备反应混合物。通过将该反应混合物在30℃下温育16小时来进行rcr扩增反应。接着，将1μl的各rcr扩增反应物分别在4μl的从表1所示的反应用混合物中仅除去酶组而得到的混合物(反应缓冲液)中进行稀释后，在30℃下进行30分钟再温育。对2.5μl的再温育结束后的反应混合物进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图22中的(b)。其结果是，在添加了核酸外切酶i的样本中，观察到36片段的环状连接体的超螺旋的条带(图中，“36片段scdna”)(图13中的(b)中，“36片段超螺旋”)。另一方面，在未添加核酸外切酶i的样本中，未观察到该条带。由该结果可知，基于reca和核酸外切酶iii的连接反应通过核酸外切酶i的添加而促进了连接效率，其结果是，得到由36片段全部连接而成的环状连接体。

[实施例21]

使用reca家族重组酶蛋白质、直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶、单链dna特异性3’→5’核酸外切酶将50种直链状双链dna片段连接而形成环状的连接体，对其进行rcr扩增。

连接的直链状双链dna片段使用dcw1～dcw49(序列号1～序列号49)与km-oric(dcw49)(序列号62)的套组，所述km-oric包含oric以及相对于oric分别向外插入的一对ter序列。km-oric(dcw49)是1509bp的直链状双链dna片段，第1个到第60个的60个碱基是用于与dcw49的连接的同源区域，由与dcw49的第532个到第591个的60个碱基同一的碱基序列构成。另外，km-oric(dcw49)的第1450个到第1509个的60个碱基为用于与dcw1的连接的同源区域，由与dcw1的第1个到第60个的60个碱基同一的碱基序列构成。即，若dcw1～dcw49以及km-oric(dcw49)的50片段全部连接，则能得到环状dna。

另外，作为阳性对照，还使用dcw1～dcw35(序列号1～序列号35)与km-oric(dcw35)的套组，所述km-oric包含oric以及相对于oric分别向外插入的一对ter序列。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的野生型，作为直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii，作为单链dna特异性3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶i。进而，作为rcr扩增反应液，使用在表1所示的组成的反应用混合物中包含60nm的tus的混合液。

具体而言，首先，制备由各0.6nm的dcw1～dcw49以及km-oric(dcw49)、1μm的reca的野生型、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、20ng/μl的肌酸激酶、4mm的磷酸肌酸、以及0.3u/μl的核酸外切酶i所构成的反应溶液。另外，还准备除了代替各0.6nm的dcw1～dcw49以及km-oric(dcw49)而混合各0.6nm的dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)以外同样地进行制备而得到的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图23中的(a)。图中，在“dcw1-35km-oric20nm(8.8ng/ml)”中，“input”表示使1.5μl的含有各0.6nm的dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)的溶液进行泳动后的泳道，“ra”表示使含有各0.6nm的dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)的反应溶液进行泳动后的泳道。“dcw1-49km-oric30nm(12.1ng/ml)”中，“input”表示使1.5μl的含有各0.6nm的dcw1～dcw49以及km-oric(dcw49)的溶液进行泳动后的泳道，“ra”表示使含有各0.6nm的dcw1～dcw49以及km-oric(dcw49)的反应溶液进行泳动后的泳道。其结果是，使用dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)的样本和使用dcw1～dcw49以及km-oric(dcw49)的样本双方都确认到了多片段的连接体。

接着，将0.5μl的热处理、急冷后的反应溶液添加到4.5μl的rcr扩增反应液中来制备反应混合物。通过将该反应混合物在30℃下温育16小时来进行rcr扩增反应。接着，将1μl的各rcr扩增反应物分别在4μl的从表1所示的反应用混合物中仅除去酶组而得的混合物(反应缓冲液)中进行稀释后，在30℃下进行30分钟再温育。对2.5μl的再温育结束后的反应混合物进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图23中的(b)。图中，“mk3”表示使dna梯状标志进行泳动后的泳道。其结果是，如实施例20中确认的那样，在使用dcw1～dcw35以及km-oric(dcw35)的样本中，能得到由36片段连接而成的环状连接体，并确认到了其扩增产物。另一方面，在使用dcw1～dcw49以及km-oric(dcw49)的样本中，在由50片段连接而得到的环状连接体的条带的预期位置确认到了较淡的条带。

接着，将包含dcw1～dcw49以及km-oric(dcw49)的反应溶液的经连接反应以及之后的rcr扩增反应后的反应溶液中所包含的dna(由50片段连接而成的环状连接体的扩增产物)分离，考查该dna的碱基序列结构。

具体而言，在1μl的rcr反应后的溶液中添加9μl的te缓冲液(包含10mm的tris-hcl(ph8.0)、1mm的edta的溶液)，将1μl的得到的稀释液混合到50μl的包含大肠杆菌感受态细胞(e.colihst08premiumelectro-cells，宝生物工程公司制)的溶液中，对得到的混合液实施电穿孔法，进行转化。将12个得到的转化体的菌落在包含50μg/ml卡那霉素的20ml的lb液体培养基中培养一夜，提取在各个培养液中增殖的大肠杆菌的细胞内所保持的质粒dna。测定所得到的dna提取液的260nm波长的吸光度，算出dna浓度，基于算出的dna浓度，使用由0.5质量％的琼脂糖构成的凝胶对15ng量的提取dna进行电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

其结果是，在12个菌落中的3个(no.6、8、10)中，检测到50片段的连接体的扩增产物(无空隙、切口的双链环状dna)的条带。接着，针对该3个菌落和未能确认到50片段的连接体的扩增产物的条带的菌落(no.12)，使用由1质量％的琼脂糖构成的凝胶对15ng量的提取dna进行电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。将染色结果示于图24。图中，“mk3”表示使dna梯状标志进行泳动后的泳道，“rcr”表示使rcr反应后的溶液进行泳动后的泳道。另外，“基因组”是指大肠杆菌的基因组dna的条带，“*”是指50片段的连接体的扩增产物的条带。如图24所示，在构成no.6、8、10的菌落的转化体中，仅检测到大肠杆菌的基因组dna和50片段的连接体的扩增产物的条带。

接着，对从no.6、8、10的菌落的转化体得到的、假定为由50片段连接而成的环状连接体的靶dna的序列结构进行了考查。针对该50片段的环状连接体，若用限制酶pcii进行消化则从其碱基序列能得到10849bp、8121bp、4771bp以及3694bp的共4片段，若用限制酶ncoi消化时，则从其碱基序列能得到11308bp、7741bp、4407bp、2599bp、1123bp以及257bp的共6片段。因此，用pcii或ncoi对从各转化体得到的假定为环状连接体的靶dna进行消化，考查其条带类型。

具体而言，将0.5μl的0.03ng/μl的提取dna添加到4.5μl的rcr扩增反应液中来制备反应溶液。将该反应溶液在30℃下温育16小时，由此进行rcr扩增反应。接着，将5μl的各rcr扩增反应物分别在20μl的rcr反应缓冲液(表1的反应缓冲液)中进行稀释后，在30℃下进行30分钟再温育。将25μl的再温育结束后的反应混合物加入到25μl的包含50mm的tris-hcl(ph8.0)、50mm的edta、0.2质量％的十二烷基硫酸钠、100μg/ml的链霉蛋白酶k、10质量％的甘油、0.2质量％的溴酚蓝的溶液中，在37℃下温育30分钟，分解rcr反应蛋白质组。在温育后的溶液中加入等量的pci溶液(te饱和苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)，使用涡旋混合器剧烈混合后，以12000rpm进行1分钟离心分离。将分离后的水层用mf(商标)-膜过滤器(过滤器型号：0.05μmvmwp，默克公司制)，以te缓冲液进行透析。基于该dna溶液的260nm波长的吸光度算出透析后的dna溶液的dna浓度。制备4.5μl的包含40ng的透析后dna、1×nebuffer3、以及0.1质量％bsa的溶液，在该溶液中加入10u/μl的限制酶pcii(宝生物工程公司制)、10u/μl的限制酶ncoi(新英格兰生物实验室公司制)或0.5μl的水，在37℃下温育30分钟。对2.5μl的温育后的反应溶液进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图25。图中，“mk3”以及“mk2”分别表示使dna梯状标志进行泳动后的泳道，“rcr产物”表示使rcr反应后的溶液进行泳动后的泳道。“6”、“8”、“10”分别表示使no.6、no.8、no.10的菌落的转化体的提取dna的rcr扩增反应物进行泳动后的泳道。“-”表示使未进行酶处理的样本进行泳动后的泳道。其结果是，根据pcii和ncoi的消化物的条带图案确认了no.6、no.8、no.10的转化体中所包含的环状dna为将目标的50片段连接而得到的环状连接体。

[实施例22]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将同源区域包含3’突出末端或存在于其附近的dna片段的直链状双链dna片段连接的反应中，并用直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶与单链dna特异性3’→5’核酸外切酶的效果。

连接的直链状双链dna片段使用将puc4kscei以限制酶pi-scei消化而得到的末端为3’突出末端的直链状双链dna片段(puc4kscei片段)、和以与该直链状双链dna片段连接而构成环状的连接体的方式设计而成的直链状双链dna片段(km-oricpi-scei)。puc4kscei是以puc4k质粒为模板并将使用引物对(ctatgcggcatcagagcag(序列号63)以及gttaagccagccccgacac(序列号64))进行pcr扩增而得到的4kbp的片段和500bp的pi-scei片段(序列号65)通过ra连接环状化而制备得到的质粒。另外，km-oricpi-scei是以km-oric(dcw35)片段为模板并使用引物对(tgcgtaagcggggcacatttcattacctctttctccgcacgctctgccagtgttacaacc(序列号66)以及taatgtatactatacgaagttattatctatgtcgggtgctaacgcggtatgaaaatggat(序列号67))进行扩增得到的pcr片段。

另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的f203w突变体，作为直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii，作为单链dna特异性3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶i。

具体而言，首先，制备由各1.28nm的puc4kscei片段以及km-oricpi-scei、1.5μm的reca的f203w突变体、80mu/μl的核酸外切酶iii、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、4mm的磷酸肌酸、20ng/μl的肌酸激酶、以及0u/μl(无添加)、0.3u/μl、0.6u/μl或1u/μl的核酸外切酶i所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育60分钟而进行连接反应后，在65℃下温育5分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图26。图中，“input”表示使2μl的含有各1.28nm的puc4kscei片段以及km-oricpi-scei的溶液进行泳动后的泳道。图中，“puc4kscei”是puc4kscei片段的条带，“km-oric”是km-oricpi-scei的条带，“组装产物”是由puc4kscei片段与km-oricpi-scei连接而成的连接体的条带。其结果是，核酸外切酶i的添加量越多的样本，越能得到更大量的连接体。可以认为，这是因为虽然核酸外切酶iii难以将3’突出末端作为目标，但核酸外切酶i将3’突出末端消化而成为核酸外切酶iii容易作为目标的5’突出末端，因此连接效率提高。

[实施例23]

考查了在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，并用直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶和两种单链dna特异性3’→5’核酸外切酶的效果。

连接的直链状双链dna片段使用dcw34～dcw43(序列号34～序列号43)。另外，作为reca家族重组酶蛋白质而使用大肠杆菌reca的野生型，作为直链状双链dna特异性3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶iii，作为单链dna特异性3’→5’核酸外切酶而使用核酸外切酶i以及核酸外切酶t。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw34～dcw43、1μm的reca的野生型、80mu/μl的核酸外切酶iii、1u/μl的核酸外切酶i、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、20ng/μl的肌酸激酶、4mm的磷酸肌酸、以及0u/μl(无添加)、0.05u/μl、0.15u/μl或0.5u/μl的核酸外切酶t所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图27。其结果是，在进行了连接反应的所有样本中确认到了由10片段全部连接而得到的连接体的条带。另外，由2～9片段连接而得到的连接体的量依赖于核酸外切酶t的添加量而减少。由这些结果明确了，通过核酸外切酶i以及核酸外切酶t的添加，可促进片段数较多的连接片段的连接反应。

[实施例24]

在使用reca家族重组酶蛋白质和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，作为reca家族重组酶蛋白质而使用了作为噬菌体reca同源物的t4噬菌体uvsx。连接的直链状双链dna片段使用dcw34～dcw43(序列号34～序列号43)。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw34～dcw43、8mu/μl、30mu/μl或80mu/μl的核酸外切酶iii、1u/μl的核酸外切酶i、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、20ng/μl的肌酸激酶、4mm的磷酸肌酸、以及0μm(无添加)、1μm或3μm的uvsx或者1μm的reca的野生型(对照)所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图28。图中，“input”表示使2μl的含有各1nm的dcw34～dcw43的溶液进行泳动后的泳道。其结果是，在1μm或3μm的uvsx和80mu/μl的核酸外切酶iii的存在下进行了连接反应的样本中，与在1μm的reca的野生型和80mu/μl的核酸外切酶iii的存在下进行了连接反应的样本同样地，确认到了由10片段全部连接而得到的连接体的条带。由这些结果能够确认，在使用了作为噬菌体reca同源物的uvsx的情况下，也能够与使用了reca的情况同样地以较高的连接效率进行连接反应。

[实施例25]

考察了在使用uvsx和3’→5’核酸外切酶将两种以上的直链状双链dna片段连接的反应中，并用t4噬菌体uvsy的效果。连接的直链状双链dna片段使用dcw34～dcw43(序列号34～序列号43)。

具体而言，首先，制备由各1nm的dcw34～dcw43、3μm的uvsx、60mu/μl的核酸外切酶iii、1u/μl的核酸外切酶i、20mm的tris-hcl(ph8.0)、4mm的dtt、1mm的乙酸镁、50mm的谷氨酸钾、100μm的atp、150mm的tmac、5质量％的peg8000、10体积％的dmso、20ng/μl的肌酸激酶、4mm的磷酸肌酸、以及0μm(无添加)、0.1μm、0.3μm或1μm的uvsy所构成的反应溶液。接着，将这些反应溶液在42℃下温育30分钟而进行连接反应后，在65℃下温育2分钟进行热处理，进而之后在冰上急冷。对热处理、急冷后的反应溶液中的1.5μl进行琼脂糖电泳，并对分离的条带进行sybrgreen染色。

将染色结果示于图29。其结果是，在进行了连接反应的所有样本中确认到了由10片段全部连接而得到的连接体的条带。由10片段全部连接而得到的连接体的量依赖于uvsy的添加量而变多，由2～9片段连接而得到的连接体的量依赖于uvsy的添加量而变少。由这些结果明确了，通过并用uvsx和uvsy，可促进基于核酸外切酶iii和uvsx的连接反应。

附图标记说明

1a、1b：直链状双链dna片段；h：同源区域；2：3’→5’核酸外切酶、3：reca家族重组酶蛋白质。