检测外泌体miR-6879-5p的试剂在制备甲状腺癌转移检测试剂盒中的用途

no.2和seq id no.3所示。
14.一种甲状腺癌淋巴结转移检测试剂盒，所述试剂盒包括检测外泌体mir-6879-5p的试剂。
15.如前述的试剂盒，所述外泌体为血浆中的外泌体。
16.如前述的试剂盒，所述甲状腺癌为甲状腺乳头状癌。
17.如前述的试剂盒，所述检测外泌体mir-6879-5p的试剂为：基因芯片试剂、northern blot检测试剂、原位杂交试剂或pcr检测试剂。
18.如前述的试剂盒，所述检测外泌体mir-6879-5p的试剂为pcr检测试剂，包括逆转录引物和定量pcr引物；
19.所述逆转录引物的序列如seq id no.1所示；所述定量pcr引物的序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
20.发明人通过研究发现，在甲状腺乳头状癌淋巴结转移的患者血浆外泌体中，mir-6879-5p的水平极显著地高于非淋巴结转移的患者。通过检测血浆外泌体mir-6879-5p水平，可有效区分淋巴结转移和肺转移的甲状腺乳头状癌患者，可同时使灵敏度和特异度之和达到170％以上，这在单一标记物用于疾病诊断的实践中，是很高的水平。
21.根据该发现，将检测外泌体mir-6879-5p的试剂用于制备甲状腺癌淋巴结转移检测试剂盒，具有良好的应用前景。
22.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
23.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
24.图1：mir-6879-5p与甲状腺乳头状癌关系的roc曲线。
具体实施方式
25.实施例1:本发明的试剂盒
26.本实施例以pcr检测试剂盒为例进行介绍。
27.1.试剂盒的组成
28.1.1逆转录试剂
29.(1)microrna stem-loop逆转录引物
30.序列(seq id no.1)为：
[0031]5’-
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctctcc-3’。
[0032]
(2)逆转录所需其他常规试剂
[0033]
包括dntp、5
×
buffer、m-mlv逆转录酶；可以是本领域常规逆转录试剂。
[0034]
1.2实时荧光定量pcr试剂
[0035]
(1)定量pcr引物
[0036]
序列分别为：
6879-5p水平显著更高，则表明被检对象出现甲状腺乳头状癌淋巴结转移的风险高。
[0057]
2.5进一步判断
[0058]
(1)相对拷贝数计算
[0059]
实时荧光定量结束后，采用外参cel-mir-39对目标(包括实验组和对照组)mirnas进行定量，根据检测的ct值使用定量公式2-δδct
计算相对表达水平(相对拷贝数)。
[0060]
外参cel-mir-39通用序列：5
’-
ucaccggguguaaaucagcuug-3’(seq id no.4)；引物由qiagen公司合成(mircury lna mirna pcr starter kit，货号339320)，序列如下：
[0061]
fp(seq id no.5)：5
’-
gcgctcaccgggtgtaaa-3’；
[0062]
rp(seq id no.6)：5
’-
gtgcagggtccgaggt-3’。
[0063]
计算公式：
[0064]
2-δδct
＝2-(δct实验组-δct对照组)
＝2-[(实验组基因ct-实验组外参基因ct)-(对照组基因ct-对照组外参基因ct)]
。
[0065]
(2)判读
[0066]
当被检对象相对于已知未出现淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者的外泌体mir-6879-5p相对拷贝数大于2.74时，则表明病人出现甲状腺乳头状癌的淋巴结转移；反之，病人未出现甲状腺乳头状癌的淋巴结转移。
[0067]
mirna的检测试剂还有很多，例如：基因芯片试剂、northern blot检测试剂、原位杂交试剂等，均为本发明试剂盒的常规替代形式。
[0068]
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明还提供如下实验例。
[0069]
实验例1:临床验证
[0070]
1.方法
[0071]
随机选取120例甲状腺乳头状癌血浆样本，其中60例发生淋巴结转移(转移组)，60例未发生淋巴结转移(对照组)，提取外泌体rna，用实施例1的试剂盒和方法检测血浆外泌体mir-6879-5p水平，并将实施例1中的引物换成mir-4707-3p、mir-4749-5p和mir-8058的引物，检测血浆外泌体中mir-4707-3p、mir-4749-5p和mir-8058的水平。再采用外参cel-mir-39对前述mirnas进行定量。
[0072]
所述mir-4707-3p、mir-4749-5p和mir-8058的引物序列如表3所示。
[0073]
表3 mir-4707-3p、mir-4749-5p和mir-8058的引物序列
[0074][0075]
采用roc曲线和auc计算外泌体mir-6879-5p对预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的灵敏度和特异度，并算出最佳阈值。
[0076]
2.结果
[0077]
如表4所示，mir-6879-5p在转移组和对照组中的相对拷贝数有极显著性差别(p《0.001)，而mir-4707-3p、mir-4749-5p和mir-8058在两组中无显著性差别。
[0078]
表4实时荧光定量pcr显示外泌体mirnas的相对拷贝数
[0079][0080]
roc曲线显示，auc值高达0.941；当选择相对拷贝数阈值为2.74时，预测淋巴结转移的灵敏度为93.3％，特异度为83.3％(图1)。
[0081]
综上，外泌体mir-6879-5p与甲状腺乳头状癌淋巴结转移高度相关，检测血浆中外泌体mir-6879-5p水平的试剂可用于制备检测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的试剂盒。


技术特征：
1.检测外泌体mir-6879-5p的试剂在制备甲状腺癌淋巴结转移检测试剂盒中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述外泌体为血浆中的外泌体。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述甲状腺癌为甲状腺乳头状癌。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测外泌体mir-6879-5p的试剂为：基因芯片试剂、northern blot检测试剂、原位杂交试剂或pcr检测试剂。5.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测外泌体mir-6879-5p的试剂为pcr检测试剂，包括逆转录引物和定量pcr引物；所述逆转录引物的序列如seq id no.1所示；所述定量pcr引物的序列如seq id no.2和seq id no.3所示。6.一种甲状腺癌淋巴结转移检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测外泌体mir-6879-5p的试剂。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述外泌体为血浆中的外泌体。8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述甲状腺癌为甲状腺乳头状癌。9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述检测外泌体mir-6879-5p的试剂为：基因芯片试剂、northern blot检测试剂、原位杂交试剂或pcr检测试剂。10.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述检测外泌体mir-6879-5p的试剂为pcr检测试剂，包括逆转录引物和定量pcr引物；所述逆转录引物的序列如seq id no.1所示；所述定量pcr引物的序列如seq id no.2和seq id no.3所示。

技术总结
本发明公开了检测外泌体miR-6879-5p的试剂在制备甲状腺癌淋巴结转移检测试剂盒中的用途，属于癌症诊断领域。在甲状腺乳头状癌淋巴结转移的患者血浆外泌体中，miR-6879-5p的水平显著高于非淋巴结转移的患者。根据该发现，将检测外泌体miR-6879-5p的试剂用于制备甲状腺癌淋巴结转移检测试剂盒，可准确判断甲状腺乳头状癌患者是否出现淋巴结转移，具有良好的应用前景。好的应用前景。好的应用前景。


技术研发人员：陈文杰
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2020.07.29
技术公布日：2022/2/18