可荧光示踪的氨基酸衍生物及其制备方法和应用与流程
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及可荧光示踪的氨基酸衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
近些年来，人们在与癌症的斗争中取得了显著的进步，但它仍然是人们目前面临的极其严峻的公共卫生挑战。
组蛋白的翻译后修饰(ptm)是表观遗传调控的标志。研究表明，表观遗传修饰剂对肿瘤抑制基因的沉默，是肿瘤发生过程中的早期事件。在过去的几十年间，针对组蛋白脱乙酰基酶和dna甲基转移酶的抗癌药物的批准，突出了表观遗传学在人类疾病中的重要作用，并表明控制基因表达的因素可作为新型药物靶标。肽基精氨酸脱亚氨酶4(pad4)就是这样一种靶标，因为它对基因表达的作用与组蛋白脱乙酰基酶类似。pad4作为一种转录共调节剂，可催化蛋白质中特定精氨酸残基向瓜氨酸的钙依赖性转化。在癌症中，pad4不仅是抑癌蛋白p53的转录共抑制因子，还参与介导恶性肿瘤的形成。由于其在细胞信号传导途径和疾病发病机理中的调控作用，pad4已成为多种疾病的潜在治疗靶标。基于pad4的小分子底物n-苯甲酰-l-精氨酰胺(baa)，研究者们已经开发出多种有效且不可逆的卤乙脒类pad4抑制剂，但仍存在生物利用度差、活性不理想等问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供可荧光示踪的氨基酸衍生物及其制备方法和应用，本发明提供的可荧光示踪的氨基酸衍生物生物活性好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种可荧光示踪的氨基酸衍生物，具有式i所示结构：
式i中，r为式1～10所示基团中的任一种：
本发明提供了上述技术方案所述可荧光示踪的氨基酸衍生物的制备方法，其中，
(i)当r为式1、式2或式3所示基团时，可荧光示踪的氨基酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑、甲醇和第一反应原料混合，采用n,n-二异丙基乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，避光条件下进行取代反应，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物；所述第一反应原料为tos·arg(no2)-obzl、hcl·lv-obzl或n-(2-氨基乙基)甲磺酰胺；
(ii)当r为式4所示基团时，可荧光示踪的氨基酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑、甲醇和第二反应原料混合，采用n,n-二异丙基乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，避光条件下进行取代反应，得到第一中间产物；
将所述第一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与hcl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行水解反应，得到第二中间产物；
将所述第二中间产物溶解于甲醇中，采用三乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，避光条件下进行氨取代反应，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物；
所述第二反应原料、第一中间产物和第二中间产物的结构式依次如下：
(iii)当r为式5或式7所示基团时，可荧光示踪的氨基酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
将第三反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用n-甲基吗啡啉将所得混合液的ph值调节至8～9，进行缩合反应，得到第三中间产物；
将所述第三中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行氢解反应，得到第四中间产物；
将所述第四中间产物和4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑溶解于甲醇中，采用n,n-二异丙基乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，进行取代反应，得到第五中间产物；
将所述第五中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与hcl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行水解反应，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物；
所述第三反应原料、第三中间产物、第四中间产物和第五中间产物的结构式依次如下：
(iv)当r为式6、式8、式9或式10所示基团时，可荧光示踪的氨基酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
将第四反应原料、第五反应原料和甲醇混合，采用n,n-二异丙基乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，进行取代反应，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物；
所述第五反应原料为2-氯乙酰亚氨酸乙酯或2-氟乙酰亚氨酸乙酯，所述第四反应原料的结构式如下：
其中，所述第三反应原料、第三中间产物、第四中间产物、第五中间产物和第四反应原料的结构式中，n＝3或4。
优选地，所述(i)中取代反应的温度为15～35℃。
优选地，所述(ii)中取代反应的温度为15～35℃，水解反应在冰浴条件下进行，氨取代反应在冰浴条件下进行。
优选地，所述(iii)中缩合反应、氢解反应和取代反应的温度独立为15～35℃，水解反应在冰浴条件下进行。
优选地，所述(iv)中取代反应的温度为15～35℃。
本发明提供了上述技术方案所述可荧光示踪的氨基酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括肺癌、结肠癌、骨肉瘤或乳腺癌。
本发明提供了一种具有式i所示结构的可荧光示踪的氨基酸衍生物，本发明提供的氨基酸衍生物主要采用一种可荧光示踪的官能团对氨基酸骨架进行修饰，nbd-cl(4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑)具有低极性、强荧光的特点，以其修饰氨基酸骨架的n端，可用于亚细胞成像，且其相对体积较小，缺乏反应正交性，对生物体自身生化反应干扰小。实施例的结果显示，本发明提供的可荧光示踪的氨基酸衍生物生物活性好，可在体内外进行荧光示踪。
附图说明
图1为化合物zd-b和zd-e-1的tem图、sem图、水合粒径变化曲线以及zeta电位变化曲线；
图2为不同受试化合物在小鼠s180肉瘤模型中的抗肿瘤活性图；
图3为优势受试化合物在小鼠s180肉瘤模型中的抗肿瘤活性图；
图4为注射化合物zd-e-1和zd-f-1的小鼠肿瘤生长趋势图；
图5为注射化合物zd-e-1和zd-f-1的小鼠脏体比统计图；
图6为化合物zd-b和zd-e-1在u2os细胞内的荧光共定位图。
具体实施方式
本发明提供了一种可荧光示踪的氨基酸衍生物，具有式i所示结构：
式i中，r为式i中，r为式1～10所示基团中的任一种：
在本发明中，所述可荧光示踪的氨基酸衍生物具体为式i-1～i-10所示化合物中的任一种：
本发明提供了所述可荧光示踪的氨基酸衍生物的制备方法，本发明优选根据可荧光示踪的氨基酸衍生物中r的种类采用不同的制备方法，下面详细说明。
在本发明中，若无特殊说明，所用原料为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，当r为式1、式2或式3所示基团时，可荧光示踪的氨基酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑、甲醇和第一反应原料混合，采用n,n-二异丙基乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，避光条件下进行取代反应，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物；所述第一反应原料为tos·arg(no2)-obzl、hcl·lv-obzl或n-(2-氨基乙基)甲磺酰胺；
反应路线如下所示：
在本发明中，所述4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑(nbd-cl)和第一反应原料的摩尔比优选为5：6；所述nbd-cl与甲醇的用量比优选为5mmol：90～110ml，更优选为5mmol：100ml。本发明优选将nbd-cl溶解于甲醇中，在冰浴(0℃)搅拌条件下，向所得nbd-cl甲醇溶液中加入第一反应原料，然后采用n,n-二异丙基乙胺(dipea)将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5(优选为10)，撤去冰浴，避光条件下进行取代反应。
在本发明中，所述取代反应的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃；本发明优选在室温条件下进行取代反应，即不需要额外的加热或降温；在本发明的实施例中，具体是在25℃条件下进行取代反应。本发明优选采用tlc监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全；其中，按体积比计，tlc监测用展开剂优选为石油醚(pe)：乙酸乙酯(ea)＝(1～2)：1。
所述取代反应结束后，本发明优选将所得体系经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为35～50％)，并用甲醇溶解后超声，静置析出固体，经减压过滤，所得固体物料即为可荧光示踪的氨基酸衍生物。
本发明对所述第一反应原料的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售商品或熟知的方法制备得到均可。在本发明中，所述tos·arg(no2)-obzl和n-(2-氨基乙基)甲磺酰胺具体采用市售商品，所述hcl·lv-obzl优选按照本领域技术人员熟知的方法制备得到，反应路线如下(具体制备方法在本发明实施例2中详细说明)：
在本发明中，当r为式4所示基团时，可荧光示踪的氨基酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑、甲醇和第二反应原料混合，采用n,n-二异丙基乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，避光条件下进行取代反应，得到第一中间产物；
将所述第一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与hcl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行水解反应，得到第二中间产物；
将所述第二中间产物溶解于甲醇中，采用三乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，避光条件下进行氨取代反应，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物；
所述第二反应原料、第一中间产物和第二中间产物的结构式依次如下：
反应路线如下所示：
本发明将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑、甲醇和第二反应原料混合，采用n,n-二异丙基乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，避光条件下进行取代反应，得到第一中间产物。在本发明中，所述nbd-cl与第二反应原料(hcl·orn(boc)-obzl)的摩尔比优选为5：6，所述nbd-cl与甲醇的用量比优选为5mmol：90～110ml，更优选为5mmol：100ml。本发明优选将nbd-cl溶解于甲醇中，在冰浴搅拌条件下，向所得nbd-cl甲醇溶液中加入第二反应原料，然后采用dipea将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5(优选为10)，撤去冰浴，避光条件下进行取代反应。
在本发明中，所述取代反应的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃；本发明优选在室温条件下进行取代反应。本发明优选采用tlc监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全；其中，按体积比计，tlc监测用展开剂优选为pe：ea＝2：1。
所述取代反应结束后，本发明优选将所得体系经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为35％)，得到第一中间产物(nbd-orn(boc)-obzl)。
得到第一中间产物后，本发明将所述第一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与hcl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行水解反应，得到第二中间产物。在本发明中，所述第一中间产物溶于乙酸乙酯后，所得混合液中第一中间产物的浓度优选为0.35～0.45mol/l，更优选为0.4mol/l；所述hcl的乙酸乙酯溶液中hcl的浓度优选为3.5～4.5mol/l，更优选为4mol/l；所述混合液与hcl的乙酸乙酯溶液(记为hcl/ea溶液)的体积比优选为1：2。
本发明优选将第一中间产物溶解于乙酸乙酯中，之后在通风橱中，冰浴搅拌条件下，向所得混合液中加入hcl/ea溶液，冰浴搅拌条件下进行水解反应。本发明优选采用tlc监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全；其中，按体积比计，tlc监测用展开剂优选为ea：h2o：冰醋酸(hac)＝6：1：1。
所述水解反应结束后，本发明优选在37℃温水浴搅拌条件下，将所得体系减压抽干，残留物用干燥ea复溶后再次抽干，继续重复该操作3次，至无明显酸气残留，得到第二中间产物。
得到第二中间产物后，本发明将所述第二中间产物溶解于甲醇中，采用三乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，避光条件下进行氨取代反应，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物。本发明优选将所述第二中间产物溶解于甲醇中，在冰浴搅拌条件下，用三乙胺调节ph值至9.5～10.5(优选为10)，避光条件下进行氨取代反应。本发明优选采用tlc监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全；其中，按体积比计，tlc监测用展开剂优选为pe：ea＝2：1。
所述氨取代反应结束后，本发明优选将所得体系经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为32％)，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物。
在本发明中，当r为式5或式7所示基团时，可荧光示踪的氨基酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
将第三反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用n-甲基吗啡啉将所得混合液的ph值调节至8～9，进行缩合反应，得到第三中间产物；
将所述第三中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行氢解反应，得到第四中间产物；
将所述第四中间产物和4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑溶解于甲醇中，采用n,n-二异丙基乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，进行取代反应，得到第五中间产物；
将所述第五中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与hcl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行水解反应，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物；
所述第三反应原料、第三中间产物、第四中间产物和第五中间产物的结构式依次如下：
其中，所述第三反应原料、第三中间产物、第四中间产物和第五中间产物的结构式中，n＝3或4；
反应路线如下所示(产物以盐酸盐形式体现)：
本发明将第三反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用n-甲基吗啡啉将所得混合液的ph值调节至8～9，进行缩合反应，得到第三中间产物。在本发明中，所述第三反应原料与四氢呋喃(thf)的用量比优选为1mmol：(9～11)ml，更优选为1mmol：10ml；所述第三反应原料与1-羟基苯并三唑(hobt)、二环己基碳二亚胺(dcc)的摩尔比优选为10：(11～13)：(11～13)，更优选为10：12：12；所述第三反应原料与苄胺的用量比优选为10mmol：(1.6～5.6)ml。
本发明优选将第三反应原料溶解于四氢呋喃中，在冰浴搅拌条件下，向所得混合液中加入1-羟基苯并三唑和二环己基碳二亚胺，活化8～12min(优选为10min)，有白色固体析出，之后向所得活化体系中加入苄胺，采用n-甲基吗啡啉(nmm)将所得混合液的ph值调节至8～9，撤去冰浴，进行缩合反应。在本发明中，所述缩合反应的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃；本发明优选在室温条件下进行缩合反应。本发明优选采用tlc监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全；其中，按体积比计，tlc监测用展开剂优选为二氯甲烷：甲醇＝30：1。
所述缩合反应结束后，本发明优选将所得体系进行减压过滤，去除滤液中thf，残余物加入乙酸乙酯，之后依次采用饱和nahco3溶液、饱和nacl溶液、5wt％khso4溶液、饱和nacl溶液、5wt％nahco3溶液、饱和nacl溶液洗涤，洗涤后加入无水na2so4干燥；干燥后常压过滤除去na2so4，滤液减压浓缩得无色油状物；经中压制备柱分离纯化(按体积比计，收集产物所用试剂为二氯甲烷：甲醇＝95：5)，得到第三中间产物。
得到第三中间产物后，本发明将所述第三中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行氢解反应，得到第四中间产物。在本发明中，所述第三中间产物与甲醇的用量比优选为(5～10)mmol：(40～50)ml；所述钯碳作为催化剂，其用量保证氢解反应顺利进行即可。在本发明中，所述氢解反应的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃；本发明优选在室温条件下进行氢解反应。本发明优选采用tlc监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全；其中，按体积比计，tlc监测用展开剂优选为二氯甲烷：甲醇＝10：1。
所述氢解反应结束后，本发明优选将所得体系进行常压过滤，将钯碳除去，去除滤液中溶剂，得到第四中间产物。
得到第四中间产物后，本发明将所述第四中间产物和4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑溶解于甲醇中，采用n,n-二异丙基乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，进行取代反应，得到第五中间产物。在本发明中，所述nbd-cl和第四中间产物的摩尔比优选为5：6；所述nbd-cl和甲醇的用量比优选为5mmol：(40～100)ml。
本发明优选将nbd-cl和第四中间产物溶解于甲醇中，在冰浴搅拌条件下，采用dipea调节体系ph值至9.5～10.5(优选为10)；撤去冰浴，进行取代反应。在本发明中，所述取代反应的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃；本发明优选在室温条件下进行取代反应。本发明优选采用tlc监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全；其中，按体积比计，tlc监测用展开剂优选为石油醚：乙酸乙酯＝2：1。
所述取代反应结束后，本发明优选将所得体系进行减压旋干，所得残余物经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为35％)，得到第五中间产物。
得到第五中间产物后，本发明将所述第五中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与hcl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行水解反应，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物。在本发明中，所述第五中间产物溶于乙酸乙酯后，所得混合液中第五中间产物的浓度优选为0.5～0.6mol/l；所述hcl的乙酸乙酯溶液中hcl的浓度优选为2～4mol/l；所述混合液与hcl的乙酸乙酯溶液(记为hcl/ea溶液)的体积比优选为1：(2～3)。
本发明优选将第五中间产物溶解于乙酸乙酯中，之后在通风橱中，冰浴搅拌条件下，向所得混合液中加入hcl/ea溶液，冰浴搅拌条件下进行水解反应。本发明优选采用tlc监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全；其中，按体积比计，tlc监测用展开剂优选为ea：h2o：hac＝6：1：1。
所述水解反应结束后，本发明优选将所得体系进行抽滤去除溶剂，依次采用乙酸乙酯和乙醚对所得剩余物进行抽滤洗涤，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物(盐酸盐形式)。
在本发明中，当r为式6、式8、式9或式10所示基团时，可荧光示踪的氨基酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
将第四反应原料、第五反应原料和甲醇混合，采用n,n-二异丙基乙胺将所得混合液的ph值调节至9.5～10.5，进行取代反应，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物；
所述第五反应原料为2-氯乙酰亚氨酸乙酯或2-氟乙酰亚氨酸乙酯，所述第四反应原料的结构式如下：
其中，所述第四反应原料的结构式中，n＝3或4；
反应路线如下所示：
在本发明中，具体的，当r为式6或式8所示基团时，所述第五反应原料为2-氯乙酰亚氨酸乙酯；当r为式9或式10所示基团时，所述第五反应原料为2-氟乙酰亚氨酸乙酯。
在本发明中，所述第四反应原料和第五反应原料的摩尔比优选为1：(1～2)，所述第四反应原料与甲醇的用量比优选为(1～3)mmol：(40～50)ml。本发明优选将第四反应原料溶解于甲醇中，在冰浴搅拌条件下向所得混合液中加入第五反应原料，采用dipea调节体系的ph值至9.5～10.5(优选为10)，撤去冰浴，进行取代反应。
在本发明中，所述取代反应的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃；本发明优选在室温条件下进行取代反应。本发明优选采用tlc监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全；其中，按体积比计，tlc监测用展开剂优选为ea：h2o：hac＝6：1：1。
所述取代反应结束后，本发明优选将所得体系旋干溶剂，残余物用体积分数为5％的甲醇水溶液复溶，用c18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为40～60％的甲醇水溶液)，旋除甲醇后冻干去除水分，得到可荧光示踪的氨基酸衍生物。
本发明提供了上述技术方案所述可荧光示踪的氨基酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述肿瘤优选包括肺癌、结肠癌、骨肉瘤或乳腺癌。在本发明中，所述抗肿瘤药物包括所述可荧光示踪的氨基酸衍生物和药学上可接受的辅料；所述抗肿瘤药物中可荧光示踪的氨基酸衍生物的含量优选为20～80wt.％，所述药学上可接受的辅料优选包括环糊精、β-羟基环糊精和甘露醇中的一种或几种；所述抗肿瘤药物的剂型优选包括冻干粉、纳米乳或脂质体。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
nbd-arg(no2)-obzl(zd-a)的合成
减重法称取0.998g(5mmol)4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑(nbd-cl)于茄瓶中，用100ml无水甲醇溶解，得到黄色澄清透明溶液，加入搅拌子；冰浴搅拌条件下，加入1.85g(6mmol)tos·arg(no2)-obzl，并用2.6mln,n-二异丙基乙胺(dipea)调节ph值至10；撤冰浴，室温(25℃)条件下避光反应8h，观察到反应液颜色逐渐加深至墨绿色，伴有绿色荧光产生，tlc(按体积比计，展开剂为pe：ea＝1：1，rf＝0.25)监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为50％)，并用2ml甲醇溶解后超声，静置析出固体，减压过滤，得到610mg(26.8％)目标产物zd-a，为黄色固体粉末，有机溶剂中具有明亮的绿色荧光。m.p.:166.0～168.8℃；
实施例2
boc-lv-obzl的合成
减重法称取2.31g(10mmol)boc-leu(叔丁氧羰基亮氨酸)于茄瓶中，用150ml无水四氢呋喃(thf)溶解，得到无色澄清透明溶液，加入搅拌子；冰浴搅拌条件下，依次加入1.62g(12mmol)1-羟基苯并三唑(hobt)和2.47g(12mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)，活化30min后，有白色固体析出；向茄瓶中加入2.92g(11mmol)hcl·val-obzl，并用n-甲基吗啡啉(nmm)调节ph值至8；撤冰浴，室温条件下搅拌反应8h，用tlc(按体积比计，展开剂为ch2cl2：ch3oh＝30：1，rf＝0.38)监测反应进程，观察到原料点消失，判断反应完全。反应结束后用真空循环水泵减压过滤，并用ea润洗滤饼，滤液减压浓缩至干，除去thf，残留物用150mlea溶解，再次抽滤除去固体物料，并将滤液转移至250ml分液漏斗中，依次用饱和nahco3溶液萃洗3次(30ml/次)、饱和nacl溶液萃洗3次(30ml/次)、5wt％khso4溶液萃洗3次(30ml/次)、饱和nacl溶液萃洗3次(30ml/次)、饱和nahco3溶液萃洗3次(30ml/次)、饱和nacl溶液萃洗3次(30ml/次)，观察到ea层在萃洗过程中颜色变淡至无色；将ea层用无水na2so4干燥2h后，过滤除去na2so4，滤液减压浓缩得无色油状物，经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为5％)，得到3.68g(87.6％)目标产物boc-lv-obzl，为白色固体粉末。esi-ms(m/z):421[m+h]+。
hcl·lv-obzl的合成
将1.26g(3mmol)boc-lv-obzl置于茄瓶中，加入5ml干燥ea使其溶解。在通风橱中，冰浴搅拌条件下，继续向溶液中滴加10mlhcl的乙酸乙酯溶液(记为hcl/ea溶液，hcl的浓度为4mo/l)，瓶口接上干燥管，冰浴搅拌条件下反应3h，观察到有橙红色固体逐渐沿瓶壁析出，tlc(按体积比计，展开剂为ch2cl2：ch3oh＝10：1，rf＝0.30)监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后，在37℃温水浴搅拌体积下，茄瓶接具塞单通，用真空循环水泵将反应液减压抽干，残留物用20ml干燥ea复溶后再次抽干，重复该操作3次，至无明显酸气残留，最后加入无水乙醚磨洗抽干，得到990mg(92.5％)目标产物hcl·lv-obzl，为白色固体粉末。esi-ms(m/z):3201[m+h]+。
nbd-lv-obzl(zd-b)的合成
减重法称取0.998g(5mmol)4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑(nbd-cl)于茄瓶中，用100ml无水甲醇溶解，得到黄色澄清透明溶液，加入搅拌子；冰浴搅拌条件下，加入2.14g(6mmol)hcl·lv-obzl，并用2.6mldipea调节ph值至10；撤冰浴，室温条件下避光反应8h，观察到反应液颜色逐渐加深至墨绿色，伴有绿色荧光产生，tlc(按体积比计，展开剂为pe：ea＝1：1，rf＝0.28)监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为50％)，并用2ml甲醇溶解后超声，静置析出固体，减压过滤，得到750mg(32.1％)目标产物zd-b，为黄色固体粉末，有机溶剂中具有明亮的绿色荧光。m.p.:147.4～149.1℃；
实施例3
nbd-n-(2-aminoethyl)methanesulfonamide(zd-c)的合成
减重法称取0.998g(5mmol)nbd-cl于茄瓶中，用100ml无水甲醇溶解，得到黄色澄清透明溶液，加入搅拌子；冰浴搅拌条件下，加入834mg(6mmol)n-(2-氨基乙基)甲磺酰胺(n-(2-aminoethyl)methanesulfonamide)，并用2.6mldipea调节ph值至10；撤冰浴，室温条件下避光反应8h，观察到反应液颜色逐渐加深至墨绿色，伴有绿色荧光产生，tlc(按体积比计，展开剂为pe：ea＝2：1，rf＝0.30)监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为35％)，并用2ml甲醇溶解后超声，静置析出固体，减压过滤，得到697mg(46.3％)目标产物zd-c，为橙红色固体粉末，有机溶剂中具有明亮的绿色荧光。m.p.:198.8～203.5℃；
实施例4
nbd-orn(boc)-obzl的合成
减重法称取0.998g(5mmol)nbd-cl于茄瓶中，用100ml无水甲醇溶解，得到黄色澄清透明溶液，加入搅拌子；冰浴搅拌条件下，加入2.15g(6mmol)hcl·orn(boc)-obzl，并用2.6mldipea调节ph值至10；撤冰浴，室温条件下避光反应8h，观察到反应液颜色逐渐加深至墨绿色，伴有绿色荧光产生，tlc(按体积比计，展开剂为pe：ea＝2：1，rf＝0.30)监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为35％)，得到990mg(41.2％)目标产物nbd-orn(boc)-obzl，为橙红色固体，有机溶剂中具有明亮的绿色荧光。esi-ms(m/z):484.5[m-h]-；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)＝9.51(s,1h),8.52(d,j＝8.9hz,1h),7.32(s,5h),6.84(s,1h),6.41(s,1h),5.17(s,2h),3.34(s,1h),2.94(q,j＝6.1hz,2h),1.99(m,2h),1.54(m,2h),1.34(s,9h)。
nbd-orn(cycto)(zd-d)的合成
将970mg(2mmol)nbd-orn(boc)-obzl置于茄瓶中，加入5ml干燥ea使其溶解，在通风橱中，冰浴搅拌条件下，继续向溶液中滴加10mlhcl/ea溶液(hcl的浓度为4mo/l)，瓶口接上干燥管，冰浴搅拌条件下反应3h，观察到有橙红色固体逐渐沿瓶壁析出，tlc(按体积比计，展开剂为ea：h2o：乙酸(hac)＝6：1：1，rf＝0.35)监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后，在37℃温水浴搅拌条件下，茄瓶接具塞单通，用真空循环水泵将反应液减压抽干，残留物用20ml干燥ea复溶后再次抽干，重复该操作3次，至无明显酸气残留，将残留物用20ml甲醇溶解，冰浴搅拌条件下，用三乙胺调节ph值至10，避光反应6h，tlc(按体积比计，展开剂为pe：ea＝2：1，rf＝0.35)监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后，所得体系经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为32％)，得到560mg(76.3％)目标产物zd-d，为橙红色固体粉末。m.p.:218.1～220.7℃；
实施例5
n-苄氧羰基-n-ε-叔丁氧羰基-l-鸟氨酰苄胺(z-orn(boc)-nbzl)的合成
准确称取3.660g(10mmol)n-苄氧羰基-n-ε-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸于茄瓶中，用100ml无水thf溶解，得到无色澄清透明溶液，并加入搅拌子；在冰浴搅拌条件下，加入1.620g(12mmol)hobt和2.472g(12mmol)dcc，活化10min，有白色固体析出；向反应体系中加入1.6ml苄胺，并用nmm调节反应液ph值至8；撤去冰浴，室温条件下反应12h，用tlc监测反应进程，按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝30：1，原料点消失后，判断反应完全。反应结束后减压过滤，旋蒸旋干thf，得到黄色油状物质；加入60ml乙酸乙酯，之后依次采用饱和nahco3溶液(25ml×3)、饱和nacl溶液(25ml×3)、5wt％khso4溶液(25ml×3)、饱和nacl溶液(25ml×3)、5wt％nahco3溶液(25ml×3)、饱和nacl溶液(25ml×3)洗涤，洗涤过程中溶液逐渐变浅至无色，洗涤后加入无水na2so4干燥2h；常压过滤除去na2so4，滤液减压浓缩得无色油状物；经中压制备柱分离纯化(按体积比计，收集产物所用纯化试剂为二氯甲烷：甲醇＝95：5)，得到4.490g(98.7％)目标产物z-orn(boc)-nbzl，为白色固体。esi-ms(m/e):455[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)＝8.39(m,1h),7.42(d,j＝8.0hz,1h),7.34(m,5h),7.27(m,5h),6.79(m,1h),5.03(s,2h),4.28(d,j＝5.3hz,2h),3.99(m,1h),2.89(t,j＝5.8hz,2h),1.60(m,2h),1.51(m,2h),1.37(s,9h)。
n-ε-叔丁氧羰基-l-鸟氨酰苄胺(orn(boc)-nbzl)的合成
将4.490g(9.9mmol)z-orn(boc)-nbzl置于茄瓶中，加入40ml甲醇溶解，得到澄清透明溶液；称取0.449g钯碳(pd/c)于茄瓶中，装好三通，同时开启搅拌；将三通竖直一侧接氢气袋，侧面通口接水泵，将茄瓶中空气抽尽，换成氢气，反复换气三次后，将反应装置移到氢解反应通风橱中，室温条件下进行反应2h，用tlc监测反应进度，按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝10：1，原料点消失后，判断反应完全。反应结束后常压过滤，将钯碳除去，滤液旋干得到3.988g(88.8％)目标产物orn(boc)-nbzl，为白色固体粉末。esi-ms(m/e):321[m+h]+。
n-(7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑-4-基)-n-ε-叔丁氧羰基-l-鸟氨酰苄胺(nbd-orn(boc)-nbzl)的合成
准确称取0.998g(5mmol)4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑(nbd-cl)和1.942g(6mmol)orn(boc)-nbzl于茄瓶中，用40ml无水甲醇溶解，得到无色澄清透明溶液，并加入搅拌子；冰浴搅拌条件下，用2.6mldipea调节体系ph值至10；撤去冰浴，室温条件下反应5h，用tlc监测反应进度，按体积比计，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2：1，原料点消失后，判断反应完全。反应结束后减压旋干，所得残余物经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为35％)，得到2.028g(83.8％)目标产物nbd-orn(boc)-nbzl，为橙红色固体，有机溶剂中具有明亮的绿色荧光。esi-ms(m/e):483.4[m-h]-。
(s)-5氨基-n-苄基-2-((7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑-4-基)氨基)戊烷酰胺(nbd-orn(hcl)-nbzl，zd-e)的合成
将2.028g(5.5mmol)nbd-orn(boc)-nbzl置于茄瓶中，用10ml干燥乙酸乙酯溶解，得到无色澄清透明溶液，并加入搅拌子；冰浴搅拌条件下，于通风橱中，加入20mlhcl/ea溶液(hcl的浓度为2mo/l)，瓶口接上干燥管；冰浴搅拌反应2h，用tlc监测反应进度，按体积比计，展开体系为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝6：1：1，原料点消失后，判断反应完全。反应结束后抽滤去除溶剂，向剩余物中加入干燥乙酸乙酯15ml×3次，乙醚15ml×1次，抽滤去除溶剂，得到1.762g(96.1％)目标产物(盐酸盐形式)，即(s)-5-氨基-n-苄基-2-((7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑-4-基)氨基)戊烷酰胺盐酸盐，为红色固体。esi-ms(m/e):384[m+h]+。
实施例6
(s)-n-苄基-5-(2-氯乙酰亚胺基)-2-((7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑-4-基)氨基)戊烷酰胺(nbd-orn(cl)-nbzl，zd-e-1)的合成
准确称取420mg(1mmol)(s)-5-氨基-n-苄基-2-((7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑-4-基)氨基)戊烷酰胺盐酸盐置于茄瓶中，用40ml无水甲醇溶解，得到澄清透明溶液，加入搅拌子；冰浴搅拌条件下，加入187mg(1.2mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯盐酸盐，并用dipea调节体系的ph值至10；撤去冰浴，室温条件下反应6h，用tlc监测反应进度，按体积比计，展开剂为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝6：1：1，原料点消失后，判断反应完全。反应结束后旋干溶剂，残余物用体积分数为5％的甲醇水溶液复溶，用c18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为60％的甲醇水溶液)，旋除甲醇后冻干去除水分，得到210mg(50.0％)目标产物zd-e-1，为橙红色固体粉末。纯度：97.34％；m.p.:88.2～90.0℃；
实施例7
z-lys(boc)-nbzl的合成
减重法准确称取3.8g(10mmol)z-lys(boc)-oh于茄瓶中，用100ml无水thf溶解，得到无色澄清透明溶液，加入搅拌子；冰浴搅拌下，依次加入1.62g(12mmol)hobt和2.47g(12mmol)dcc，活化10min后，有白色固体析出；向茄瓶中滴加入5.6ml苄胺，并用nmm调节ph至8；撤冰浴，室温条件下搅拌反应8h，用tlc(按体积比计，展开剂为ch2cl2：ch3oh＝30：1，rf＝0.38)监测反应进程，观察到原料点消失，判断反应完全。反应结束后用真空循环水泵减压过滤，并用ea润洗滤饼；滤液减压浓缩至干，除去thf，残留物用150mlea溶解，再次抽滤除去固体物料，并将滤液转移至250ml分液漏斗中，依次用饱和nahco3溶液萃洗3次(30ml/次)、饱和nacl溶液萃洗3次(30ml/次)、5wt％khso4溶液萃洗3次(30ml/次)、饱和nacl溶液萃洗3次(30ml/次)、饱和nahco3溶液萃洗3次(30ml/次)、饱和nacl溶液萃洗3次(30ml/次)，观察到ea层在萃洗过程中颜色变淡至无色；将ea层用无水na2so4干燥2h后，过滤除去na2so4，滤液减压浓缩得无色油状物，经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为5％)，得到3.85g(82.3％)目标产物z-lys(boc)-nbzl，为白色固体粉末。esi-ms(m/z):469[m+h]+。
lys(boc)-nbzl的合成
将2.34g(5mmol)z-lys(boc)-nbzl置于茄瓶中，用50ml甲醇溶解，得到无色澄清透明溶液；搅拌条件下，向茄瓶中加入234mgpd/c，接上三通和氢气袋，用真空循环水泵抽尽反应瓶内空气，通入氢气，重复操作3次，保持茄瓶与氢气袋相通，于通风橱中室温搅拌反应3h，tlc(按体积比计，展开剂为ch2cl2：ch3oh＝10：1，rf＝0.25)监测反应进程，原料点消失后，判断反应完全。反应结束后常压过滤除去pd/c，滤液减压浓缩至干，得到1.59g(95.2％)目标产物lys(boc)-nbzl，为白色固体粉末。esi-ms(m/z):335[m+h]+。
nbd-lys(boc)-nbzl的合成
减重法准确称取0.998g(5mmol)4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑(nbd-cl)置于茄瓶中，用100ml无水甲醇溶解，得到黄色澄清透明溶液，加入搅拌子；冰浴搅拌条件下，加入2.0g(6mmol)lys(boc)-nbzl，并用2.6mldipea调节ph值至10；撤冰浴，室温条件下避光反应8h，观察到反应液颜色逐渐加深至墨绿色，伴有绿色荧光产生，tlc(按体积比计，展开剂为pe：ea＝2：1，rf＝0.30)监测反应进程，原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为ea和pe的混合物，ea的体积分数为35％)，得到900g(36.2％)目标产物nbd-lys(boc)-nbzl，为橙红色固体，有机溶剂中具有明亮的绿色荧光。esi-ms(m/z):497.5[m-h]-；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)＝9.36(s,1h),8.73(s,1h),8.53(d,j＝8.8hz,1h),7.28(m,5h),6.77(t,j＝5.1hz,1h),6.34(s,1h),4.36(m,1h),4.30(s,2h),2.89(s,2h),1.95(s,2h),1.40(m,4h),1.33(m,9h)。
nbd-lys(hcl)-nbzl(zd-f)的合成
将1.49g(3mmol)nbd-lys(boc)-nbzl置于茄瓶中，加入5ml干燥的乙酸乙酯使其溶解，在通风橱中，冰浴搅拌条件下，继续向溶液中滴加15mlhcl/ea溶液(hcl的浓度为4mo/l)，瓶口接上干燥管，冰浴搅拌条件下反应3h，观察到有橙红色固体逐渐沿瓶壁析出，tlc(按体积比计，展开剂为ea：h2o：hac＝6：1：1，rf＝0.35)监测反应进程，原料点消失后，判断反应完全。反应结束后再37℃温水浴搅拌条件下，茄瓶接具塞单通，用真空循环水泵将反应液减压抽干，残留物用20ml干燥ea复溶后再次抽干，重复该操作3次，至无明显酸气残留，最后加入无水乙醚磨洗抽干，得到1.24g(95.4％)目标产物zd-f(具体为盐酸盐形式)，为橙红色固体粉末。m.p.:120.2～123.5℃；
实施例8
nbd-lys(cl)-nbzl(zd-f-1)的合成
将1.3g(3mmol)nbd-lys(hcl)-nbzl置于茄瓶中，用50ml无水甲醇溶解，得到橙红色澄清透明溶液，加入搅拌子；冰浴搅拌条件下，加入0.499g(3.2mmol)2-氯乙酰亚氨酸乙酯盐酸盐，并用3.6mldipea调节ph值至10；撤冰浴，室温条件下避光反应8h，tlc(按体积比计，展开剂为ea：h2o：hac＝6：1：1，rf＝0.38)监测反应进程，并用茚三酮显色，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后旋干溶剂，残余物用体积分数为5％的甲醇水溶液复溶，所得体系经c18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为40％的甲醇水溶液)，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥机冻干除水，得到520g(36.9％)目标产物zd-f-1，为橙红色固体粉末。m.p.:118.1～120.4℃；
测试例1纳米形貌表征及稳定性研究
利用透射电子显微镜和扫描电子显微镜研究了化合物zd-b和zd-e-1的纳米形态，并用纳米粒度仪研究了二者在溶液中的水合粒径和zeta电位，结果如图1所示，图1中，a为化合物zd-b的tem图，b为化合物zd-e-1的tem图，c为化合物zd-b的sem图，d为化合物zd-e-1的sem图，e为化合物zd-b在不同ph值溶液中72h内(测试时间分别为0.5h、24h、48h和72h)的水合粒径变化曲线，f为化合物zd-e-1在不同ph值溶液中72h内的水合粒径变化曲线，g为化合物zd-b在不同ph值溶液中72h内的zeta电位变化曲线，h为化合物zd-e-1在不同ph值溶液中72h内的zeta电位变化曲线。由图1可知，zd-b呈长条状，zd-e-1呈球状。在纳米粒度仪连续72h测定的粒径变化曲线中，ph＝7.0时，zd-b和zd-e-1都处于粒径最小；zd-b在ph＝2.0和5.5情况下，粒径大小有很大变化；zd-e-1在ph＝2.0时，粒径几乎没有变化，ph＝5.5时，粒径先增大后减小。在连续72h测定的zeta电位变化曲线中，zd-b和zd-e-1都未出现较大的变化。
测试例2评价可荧光示踪的氨基酸衍生物的体外抗肿瘤细胞增殖活性(mtt法)
受试细胞株s180(小鼠腹水瘤细胞)、llc(小鼠肺癌细胞)、a549(人非小细胞肺癌细胞)、hct116(人结肠癌细胞)、u2os(人骨肉瘤细胞)和mcf-7(人乳腺癌细胞)均购自南京凯基公司。
制备受试样品时，将受试化合物用含0.5％dmso的pbs缓冲液配成浓度为500μm(终浓度100μm)的样品溶液，用于体外抗细胞增殖实验的初筛。对于对受试细胞株的半数抑制浓度，即ic50值低于100μm的化合物，将样品溶液逐级稀释为50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm后，再次用mtt法检测其对受试细胞株的ic50值，并在相同的实验条件下重复测定至少三次以上，直至所得ic50值稳定可靠。
阳性对照组：阿霉素，用含0.5％dmso的pbs缓冲液配制成所需浓度；阴性对照组：为含0.5％dmso的pbs缓冲液；blank组：为含0.01％dmso的pbs缓冲液。
具体方法为：
1)接种细胞：将生长状况良好，处于对数生长期的细胞用培养基稀释至3～5×104个/ml的细胞浓度，均匀接种于96孔板中，每孔100μl(外围各孔用100μlpbs缓冲液液封)，将接种后的96孔板置于37℃、5％co2的细胞培养箱中孵育8h。
2)给药：观察细胞生长及贴壁情况，当贴壁率达50％以上时，按照预设复孔给25μl不同化合物或不同浓度的受试样品溶液，每板均设置阴性和阳性对照组以及blank组；轻轻拍打使其样品液分散均匀，置于细胞培养箱中孵育48h。
3)后处理：每孔加入事先配制好的mtt溶液25μl，继续孵育4h后取出；弃去上清液(悬浮细胞需离心3000rpm，10min)后，每孔加入150μldmso，于细胞摇床上震荡15min，使甲臜充分溶解后，酶标仪测定各孔在570nm波长下的od值(理想范围在0.3～1.4之间)。
按照式a计算受试化合物的抗细胞增殖活性的抑制率，每个实验至少重复三次，在prism中计算受试化合物的ic50值，结果如表1所示。
抑制率＝[(阴性对照组的平均od值-受试化合物组的平均od值)/阴性对照组的平均od值-blank组的平均od值]×100％式a。
表1受试化合物对各细胞株的体外抗细胞增殖活性的ic50值(mean±sdμm)
测试例3评价可荧光示踪的氨基酸衍生物体内抑制肿瘤生长实验(小鼠s180纤维肉瘤模型)
实验所用小鼠为spf级雄性icr小鼠，体重20±2g，购买于北京维通利华动物实验技术有限公司，在首都医科大学实验动物部动物屏障内进行饲养。
具体方法为：按组别对成瘤小鼠进行连续7天的给药，每隔一天测量肿瘤长短并计算肿瘤体积。末次给药24h后，取出称重，并用乙醚麻醉后摘眼球取血，所得全血在1000rpm条件下离心10min，吸取血清备用。将小鼠断颈处死，并剥取瘤块及各脏器称重(应保证尽快操作且剥取完整干净)。按式b计算抑瘤率，结果如表2和图2所示；并通过计算各脏器的脏体比，分析受试化合物对小鼠脏器有无明显的生理影响。
抑瘤率＝(vehicle组平均瘤重-给药组平均瘤重)/vehicle组平均瘤重×100％式b。
1)不同受试化合物之间的比较
表2受试化合物的体内给药分组及结果统计表
注：表2中“yw3-56”化学名称为n-(1-(苄基氨基)-5-(2-氯乙二酰亚胺基)-1-氧戊烷-2-基)-6-(二甲基氨基)-2-萘酰胺，采用us20120108562(gongchen,yanmingwang,pingxinli,jinghu,shuwang,yujiwang.therapeuticcompositionsandmethods)专利公开的方法制备得到；
ip，腹腔注射；n＝10；
经单因素方差分析，*代表与vehicle组相比，p<0.05，有差异；**代表与vehicle组相比，p<0.01，有显著性差异；a代表与yw3-56组相比，p>0.05，无差异(图2)。
以上实验选择同一给药剂量，并采用腹腔注射的方式，以阿霉素为阳性对照组，对先导化合物yw3-56及含不同氨基酸主体化合物进行初步评价。通过单因素方差分析，zd-a和zd-c两组化合物的平均瘤重与vehicle组相比有差异，而zd-b和zd-e-1的平均瘤重与vehicle组相比有显著性差异，且所有受试化合物的平均瘤重与yw3-56组相比，均未表现出差异。表2以及图2中结果表明，这几种受试化合物在10μmol/kg的剂量下，均表现出一定的抗肿瘤生长活性，其中又以zd-b和zd-e-1的活性最为突出。
2)对优势化合物的量效分析
基于以上结果，得到了几个具有体内抗肿瘤生长活性和可修饰位点的化合物结构，对其进行进一步的量效分析。结果见表3和图3。
表3优势氨基酸主体化合物的体内给药分组及结果统计表
注：ip，腹腔注射；iv，尾静脉注射；n＝10。
经单因素方差分析，*代表与vehicle组相比，p<0.05，有差异；**表示与vehicle组相比，p<0.01，有显著性差异；a表示与yw3-56组相比，p>0.05，无差异(图3)。
在对不同氨基酸主体化合物的体内抗肿瘤生长活性有了初步的探讨后，从中筛选出zd-a、zd-b、zd-e-1以及zd-e-1的侧链亚甲基单元增加的结构(zd-f-1)，设置10μmol/kg、5μmol/kg、2μmol/kg三个给药剂量，评价它们对小鼠体内肿瘤生长的抑制能力。由于zd-a和zd-b的水溶性较差，因此只能采用腹腔注射的方式，而zd-e-1和zd-f-1则无此顾虑，可以选择尾静脉注射的方式。经单因素方差分析，发现这四种化合物在2μmol/kg的剂量下，其平均瘤重仍与vehicle组相比有差异。其中又以zd-e-1活性最为显著，在三种剂量下均与vehicle组相比有显著性差异，且与yw3-56组相比无差异。实验结果表明，化合物zd-e-1在三种剂量下，均表现出良好且稳定的抗肿瘤生长活性，优于其类似物zd-f-1。之后对这两种化合物的小鼠肿瘤生长趋势和小鼠脏体比进行分析，比较这两种化合物的抗肿瘤生长能力和毒性强弱。结果见图4和图5，其中，经单因素方差分析，*代表与vehicle组相比，p<0.05，有差异；**代表与vehicle组相比，p<0.01，有显著性差异。
由图4可以看出，化合物zd-e-1和zd-f-1的小鼠肿瘤生长趋势大致相同，但在第3天后，其大小逐渐产生差异，可用以佐证其瘤重结果。由图5可知，通过比较两种化合物的小鼠脏体比，发现zd-e-1在高剂量(10μmol/kg和5μmol/kg)下，对肝脏重量的影响，及在三种剂量下对脑重影响，与vehicle组相比有差异，而zd-f-1对肝重和脑重影响无差异。实验结果表明，尽管zd-e-1对肿瘤生长的抑制能力要优于zd-f-1，但其毒副作用也更明显，可能会引起小鼠肝脏的衰竭和脑部病变。
测试例4评价化合物zd-b和zd-e-1细胞内分布(激光共聚焦)
受试细胞株：u2os(人骨肉瘤细胞)：购自南京凯基公司。
具体方法为：
1)接种细胞：将pbs缓冲液、含10％胎牛血清的mccoy’s5a培养基、胰蛋白酶-edta消化液置于37℃水浴锅中预热15min。选取生长状况良好，处于对数生长期的u2os细胞，弃去瓶内原有培养基后，用1mlpbs缓冲液润洗2次后，加入1ml胰蛋白酶-edta消化液，于细胞培养箱中孵育2min(悬浮细胞无需消化)。镜下观察细胞形态变圆且能从瓶壁上脱落游离，加入1ml培养基终止消化，并用滴管轻轻吹打使细胞完全脱落并分散，转移至15ml离心管中，3000rpm、3min条件下离心弃上清，重新加入3ml培养基，并用吸管轻轻吹打使其分散均匀。于2mlep管中稀释10倍后，吸取10μl细胞悬液于细胞计数板上镜下计数，细胞总数＝(四大格内细胞总数/4)×10000×稀释倍数。最后将细胞悬液用培养基稀释至1×105个/ml的细胞浓度，并均匀接种于共聚焦小皿中，每皿1ml。将接种后的共聚焦小皿置于37℃、5％co2的细胞培养箱中孵育8h。
2)给药：观察细胞生长及贴壁情况，当贴壁率达50％以上时，按照预设组别给予250μl终浓度为10μm和5μm的受试样品溶液。轻轻拍打使其分散均匀，继续置于细胞培养箱中孵育8h和24h。
3)固定：按不同时间点取出共聚焦小皿，小心吸出培养基，用pbs缓冲液润洗3遍，加入1ml4％多聚甲醛固定液，室温下固定30min；
4)染色：将固定液吸出后，用pbs缓冲液润洗3遍，加入1ml现配的0.5μg/ml(1:10000)dapi溶液，染色3～5min，并用pbs缓冲液润洗3遍；
5)观察：加入含有抗荧光淬灭剂的pbs缓冲液(5μl+995μlpbs)，荧光显微镜或者激光共聚焦下观察。
结果如图6所示(dapi对细胞核进行染色，呈蓝色；化合物荧光为绿色(ex＝480nm；em＝520nm)；merge为二者叠加图)，图6中，a为zd-b，b为zd-e-1。由图6可知，化合物zd-b并没有进入细胞核，而是分散在细胞质中，说明其作用靶点不是核内pad4，其对癌细胞增殖的抑制作用可能涉及其他的作用机制；而zd-e-1则在细胞核和胞质中均有分布，并且随浓度的升高和时间的延长，进入胞内的量也越大。说明了zd-e-1通过作用于pad4通路，来实现对癌细胞增殖的抑制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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