新冠状病毒检测用多位点重组抗原及其制备方法与流程

文档序号：24619899发布日期：2021-04-09 20:24阅读：96来源：国知局

本发明属于抗原制备领域，具体涉及一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原及其制备方法。

背景技术：

新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，单链正义rna病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，其基因特征与sarsr-cov和mersr-cov有一定的区别，表现出了一定的独特性，目前研究显示与蝙蝠sars样冠状病毒同源性达85％以上。因此其具有超高致病率和传播性，已经引起了世界卫生组织的高度重视，并成为全球公共卫生的重大威胁。

冠状病毒的独特外表主要体现在病毒包膜外，有类似的棒状的子粒结构，类似于欧洲中世纪的国王王冠的造型，因此得名冠状病毒。其中主要包括刺突糖蛋白(s蛋白)，核衣壳蛋白(n蛋白)，包膜糖蛋白(e蛋白)，膜蛋白(m蛋白)以及核糖核酸组成。s蛋白是病毒表面包膜的棒-球形糖基化蛋白，形成了特有的冠状形态，也是冠状病毒侵袭宿主细胞的主要媒介，通过与人类细胞表面aec2蛋白相结合，协助新冠病毒入侵到细胞并造成破坏。np蛋白病毒核内唯一的蛋白，是病毒表达量最多的蛋白，可以与病毒rna相结合，识别基因组的包膜信号将包膜蛋白打包成病毒颗粒，也是冠状病毒最重要的抗原之一。

但是目前尚未有适合检测新冠病毒抗体的候选抗原。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其特征在于，所述新冠状病毒检测用多位点重组抗原的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其制备方法如下：

(1)：通过蛋白序列比对的方法挑选出s，n，e，m四种蛋白的具有极强的抗原决定基并采用基因克隆技术合成新冠状病毒检测用多位点基因片段；

(2)：将合成的新冠状病毒检测用多位点基因片段转入pgex-4t-2质粒载体中再导入bl21(d3)菌株中；

(3)：利用iptg为诱导剂，促使细菌大量表达目标蛋白，再经过gsh树脂进行纯化即得所述新冠状病毒检测用多位点重组抗原。

在上述任一方案中优选的是，所述新冠状病毒检测用多位点基因片段的氨基酸序列如seqidno.2所示。

在上述任一方案中优选的是，所述pgex-4t-2质粒载体的氨基酸序列如seqidno.3所示。

在上述任一方案中优选的是，四中蛋白提取位置分别为：蛋白1-260：mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssg；e蛋白1-47mysfvseetgtlivnsvllflafvvfllvtlailtalrlcayccniv；n蛋白291-359：lirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytgaiklddkdpnfkdqvillnkhida；m蛋白20-157：wnlvigflfltwicllqfayanrnrflyiikliflwllwpvtlacfvlaavyrinwitggiaiamaclvglmwlsyfiasfrlfartrsmwsfnpetnillnvplhgtiltrplleselvigavilrghlriaghhlg。

本项发明通过蛋白序列比对的方法挑选出s，n，e，m4种蛋白的具有极强的抗原决定基，是重要的免疫激活感染体产生抗体的重要蛋白片段，感染体会优先释放相应的抗体，同时利用gsssg链接肽链形成了拥有多位点的具有免疫原性特异性强的抗原蛋白，该重组蛋白区别于其他单一蛋白序列，融合了新冠状病毒的4种基础蛋白的的片段，串联在了一起，该重组抗原可以特异性的识别只有新冠病毒感染的血清种的抗体，同时由于拥有4个不同蛋白的片段，极大的提高其灵敏度和特异性，是检测新冠病毒抗体的最佳候选抗原。

具体实施方式

为了更进一步了解本发明的发明内容，下面将结合具体实施例详细阐述本发明。

本发明提供一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其特征在于，所述新冠状病毒检测用多位点重组抗原的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其制备方法如下：

(1)：通过蛋白序列比对的方法挑选出s，n，e，m四种蛋白的具有极强的抗原决定基并采用基因克隆技术合成新冠状病毒检测用多位点基因片段；

(2)：将合成的新冠状病毒检测用多位点基因片段转入pgex-4t-2质粒载体中再导入bl21(d3)菌株中；

(3)：蛋白制备方法：

大肠杆菌培养，1(甘油菌)：100体积加lb培养基接种，37℃摇床(200pm)过夜培养；1：10体积加lb培养基继续扩增，37℃摇床(200pm)培养1h；加入1mm的iptg诱导2h，30℃，然后回收细菌并裂解，离心去除上清，收集沉淀；加入washbuffer，利用微量移液器混匀，离心10000转，10分钟，清洗两次；离心沉淀中加入(20菌液：1)平衡液，摇床反应4℃过夜(或者室温1h)，让沉淀充分溶解(透清)；离心10000转，10分钟，取上清；用平衡液平衡含有gst亲和的树脂柱子，反复冲洗2次；将含有样品的缓冲液加入到已经平衡好的树脂柱子中；上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线；再用10倍柱床体积prescissionprotease的酶切缓冲液平衡柱子。prescissionprotease的酶切缓冲液的组分为50mmtris-hcl，150mmnacl，1mmedta，1mmdtt，ph7.5；准备prescissionprotease：约每毫克gst标签蛋白使用20uprescissionprotease。对于8mggst标签蛋白需使用160uprescissionprotease，用prescission酶切缓冲液稀释至与凝胶柱相同的体积，即1ml；将稀释好的1mlprescissionprotease导入到纯化柱中，4℃保持4-8h(为确保酶切完全，可以4℃酶切过夜)；用1倍柱床体积的prescissionprotease酶切缓冲液洗涤，重复三次，收集每次的洗涤液。洗脱液中含有切除了gst标签的目的新冠病毒重组蛋白，而gst标签和带有gst标签的prescissionprotease则仍然结合在凝胶柱上。

在上述任一方案中优选的是，所述新冠状病毒检测用多位点基因片段的氨基酸序列如seqidno.2所示。

在上述任一方案中优选的是，所述pgex-4t-2质粒载体的氨基酸序列如seqidno.3所示。

使用方案：

案例：

纯化后的新冠状病毒多位点重组蛋白，准备等体积pbs含25～100μg抗原和弗氏完全佐剂的乳化液(200～400μl/鼠)，用22g的针给小鼠腹腔注射；1周后，用等体积的含10～50μg抗原的pbs和不完全弗氏佐剂配制成(200～400μl)的乳化液再次腹腔注射；1周后，通过尾部，收集100-200ul小鼠血液；将收集的血液，提取其中的血清装入另一微量离心管。经elisa确定血清抗体滴度。

一般情况下注射后的小鼠可形成抗新冠病毒抗原特异性抗体，经检测抗体滴度可达到≥1/1000，该抗原可作为体外检测抗体原料用，同时可提取小鼠体内抗体用于新冠病毒体外抗原诊断用。

新冠状病毒多位点重组蛋白，包含了大部分新冠病毒的的抗原决定基，因此可以有效的的激活机体并释放相应的抗体，因此可以作为检测血液中的形成的新冠病毒抗体的原料，可用在elisa，胶体金，免疫荧光等方面检测用抗原，专门检测新冠状病毒抗体用，同时可作为制备相关抗体(小鼠，兔子等)的原料使用。

本领域技术人员不难理解，本发明的新冠状病毒检测用多位点重组抗原及其制备方法方法包括上述本发明说明书的发明内容，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>苏州诺威百奥生物科技有限公司

<120>新冠状病毒检测用多位点重组抗原及其制备方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>6533

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acgttatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtg60

gtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgt120

tctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagc180

tgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttca240

cacaggaaacagtattcatgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgc300

aacccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagc360

gcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatc420

ttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttata480

tagctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgc540

ttgaaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagact600

ttgaaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaag660

atcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgt720

tgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaa780

aattagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaat840

ccagcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgacc900

atcctccaaaatcggatctggttccgcgtggatccaatgttcgtttttctggttctgctg960

ccattagtttcctctcagtgcgttaatctgaccactcgtactcaactgccgccggcatat1020

accaatagttttacccgcggcgtctattatccggataaagtctttcgcagcagcgttctg1080

catagcacccaggacctgtttctgccgtttttcagcaacgtcacctggtttcacgcgatt1140

cacgttagcggtaccaacggtaccaaacgtttcgataacccggttctgccgtttaacgac1200

ggggtttacttcgcgagcaccgagaaaagcaacatcattcgcggttggatttttggtacc1260

accctggatagcaaaacccagagcctgctgattgtcaacaacgcgaccaacgtcgtcatc1320

aaagtctgcgagttccagttctgcaacgatccgtttctgggcgtctactaccacaaaaac1380

aacaaatcctggatggagagcgaatttcgcgtttatagcagcgcaaacaactgcaccttc1440

gaatacgtcagccaaccgtttctgatggatctggaaggcaaacagggcaacttcaaaaac1500

ctgcgcgagttcgtcttcaaaaacatcgacggctacttcaaaatctacagcaaacacacc1560

ccgatcaatctggttcgcgatctgccgcaaggtttttctgcactggaaccgctggtagat1620

ctgccgattggcatcaacatcacccgctttcagaccctgctggcactgcatcgtagttat1680

ctgaccccgggcgattcttcctctggtatgtatagtttcgttagcgaagaaaccggcacc1740

ctgattgttaattctgtcttgctgtttctggcgtttgtcgtttttctgctggttaccctg1800

gcgattctgaccgctctgcgtctgtgcgcgtactgttgtaatatagtcggttccagttca1860

ggtctgattcgtcagggtaccgactacaaacactggccgcaaatcgcacaatttgcaccg1920

tctgcatctgccttctttggcatgtctcgtattggcatggaagttaccccgtctggtacc1980

tggctgacctataccggcgcaattaaactggacgacaaagacccgaacttcaaagaccag2040

gtcatcctgctgaacaaacatatcgacgcgggtagtagcagcggttggaatctggttatc2100

ggctttctgttcctgacctggatctgtctgctgcaatttgcgtacgcgaatcgtaaccgc2160

tttctgtacatcatcaaactgatcttcctgtggctgctgtggccagtaactctggcttgt2220

tttgttctggcggcggtttatcgtatcaactggattaccggcggtattgccattgcaatg2280

gcatgtctggtcggtctgatgtggctgagctatttcattgcgagctttcgtctgtttgct2340

cgtacccgtagtatgtggagctttaacccggaaaccaacattctgctgaacgttccgctg2400

cacggtaccattctgacccgtccgctgctggaatctgaactggttattggcgcagttatt2460

ttgcgtggtcatcttcgcattgctggtcatcatctgggttaagaattcccgggtcgactc2520

gagcggccgcatcgtgactgactgacgatctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaa2580

aacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccggg2640

agcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatg2700

acccagtcacgtagcgatagcggagtgtataattcttgaagacgaaagggcctcgtgata2760

cgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcact2820

tttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatg2880

tatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagt2940

atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcct3000

gtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca3060

cgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcccc3120

gaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcc3180

cgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttg3240

gttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatta3300

tgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatc3360

ggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgcctt3420

gatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg3480

cctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagct3540

tcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgc3600

tcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtct3660

cgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctac3720

acgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcc3780

tcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgat3840

ttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatg3900

accaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatc3960

aaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaa4020

ccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaag4080

gtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagtta4140

ggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgtta4200

ccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatag4260

ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttg4320

gagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacg4380

cttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagag4440

cgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgc4500

cacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaa4560

aacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatg4620

ttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagct4680

gataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaa4740

gagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcataaat4800

tccgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagag4860

agtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgcc4920

ggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaa4980

acgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggca5040

caacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctg5100

cacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagc5160

gtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaat5220

cttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgcc5280

attgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccag5340

acacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcat5400

ctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcg5460

gcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgata5520

gcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctg5580

aatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgca5640

atgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatac5700

gacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggatttt5760

cgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtg5820

aagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaat5880

acgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtt5940

tcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcatta6000

ggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcgg6060

ataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggccgtcgttt6120

tacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatc6180

cccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagt6240

tgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccgg6300

aaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggc6360

agatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattacggtcaatc6420

cgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatg6480

aaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttggaatt6533

<210>2

<211>1563

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgttcgtttttctggttctgctgccattagtttcctctcagtgcgttaatctgaccact60

cgtactcaactgccgccggcatataccaatagttttacccgcggcgtctattatccggat120

aaagtctttcgcagcagcgttctgcatagcacccaggacctgtttctgccgtttttcagc180

aacgtcacctggtttcacgcgattcacgttagcggtaccaacggtaccaaacgtttcgat240

aacccggttctgccgtttaacgacggggtttacttcgcgagcaccgagaaaagcaacatc300

attcgcggttggatttttggtaccaccctggatagcaaaacccagagcctgctgattgtc360

aacaacgcgaccaacgtcgtcatcaaagtctgcgagttccagttctgcaacgatccgttt420

ctgggcgtctactaccacaaaaacaacaaatcctggatggagagcgaatttcgcgtttat480

agcagcgcaaacaactgcaccttcgaatacgtcagccaaccgtttctgatggatctggaa540

ggcaaacagggcaacttcaaaaacctgcgcgagttcgtcttcaaaaacatcgacggctac600

ttcaaaatctacagcaaacacaccccgatcaatctggttcgcgatctgccgcaaggtttt660

tctgcactggaaccgctggtagatctgccgattggcatcaacatcacccgctttcagacc720

ctgctggcactgcatcgtagttatctgaccccgggcgattcttcctctggtatgtatagt780

ttcgttagcgaagaaaccggcaccctgattgttaattctgtcttgctgtttctggcgttt840

gtcgtttttctgctggttaccctggcgattctgaccgctctgcgtctgtgcgcgtactgt900

tgtaatatagtcggttccagttcaggtctgattcgtcagggtaccgactacaaacactgg960

ccgcaaatcgcacaatttgcaccgtctgcatctgccttctttggcatgtctcgtattggc1020

atggaagttaccccgtctggtacctggctgacctataccggcgcaattaaactggacgac1080

aaagacccgaacttcaaagaccaggtcatcctgctgaacaaacatatcgacgcgggtagt1140

agcagcggttggaatctggttatcggctttctgttcctgacctggatctgtctgctgcaa1200

tttgcgtacgcgaatcgtaaccgctttctgtacatcatcaaactgatcttcctgtggctg1260

ctgtggccagtaactctggcttgttttgttctggcggcggtttatcgtatcaactggatt1320

accggcggtattgccattgcaatggcatgtctggtcggtctgatgtggctgagctatttc1380

attgcgagctttcgtctgtttgctcgtacccgtagtatgtggagctttaacccggaaacc1440

aacattctgctgaacgttccgctgcacggtaccattctgacccgtccgctgctggaatct1500

gaactggttattggcgcagttattttgcgtggtcatcttcgcattgctggtcatcatctg1560

ggt1563

<210>3

<211>4970

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3