EB病毒阴性的NK-92细胞及其制备方法与流程

本发明涉及技术生物医药技术领域，尤其是一种eb病毒阴性的nk-92细胞及其制备方法。

背景技术：

自然杀伤(nk)细胞是先天性免疫系统的重要组成部分,具有抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节作用。nk细胞一直被认为是杀死癌细胞和治疗感染的绝佳武器。与t淋巴细胞不同，nk细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞,是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。人类nk细胞约占全血淋巴细胞的10％～15％。目前研究认为nk细胞特异性表达cd56，而缺乏t细胞抗原cd3。由于nk细胞纯化和体外大量扩增存在一定的技术难度。因此科学家试图建立细胞系，用同种异体nk细胞进行肿瘤生物治疗，目前国内外科学家在nk抗肿瘤研究中已先后建立hank、khyg-1、nk-92、nkl、plt、motn、imc-1、nk-ys、kai3、snk-1、snk6以及yt、nk3.3等，还有通过稳定转染il-2获得的nk-92mi、il-2/nkl、il-2/nk3.3等转基因nk细胞系。而nk-92细胞是1992年建立的来自非何杰金淋巴瘤患者的nk细胞系，由于其免疫表型为cd56brightcd16-，无adcc效应，类似于外周血cd56brightnk细胞。目前nk-92是进入临床研究的重要细胞系之一，它对不同来源肿瘤的细胞系，如白血病、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等都表现出高效的杀伤活性。研究发现nk-92表达大量的活化受体，如：nkp30、nkp46、2b4、nkg2d、cd28等，而抑制受体的表达却极少，只有nkga/b和低水平的kir2dl4与ilt-2等，几乎完全缺乏大多数正常nk细胞克隆表达的kirs，如p58复合体(p58复合体通过结合靶细胞上的hla抗原而抑制nk细胞的杀伤)，却保留有穿孔素和颗粒酶b介导的细胞毒作用。它的建立，促进了其在肿瘤过继免疫治疗中的应用，并为深入开展研究nk细胞的特征、功能、进一步揭示它在免疫系统中的确切作用，提供了有力的研究材料。

epstein-barrvirus(简称为ebv或eb病毒)为疱疹病毒科嗜淋巴细胞属的成员，在人群中广泛感染，根据血清学调查，我国3～5岁儿童eb病毒vca-lgg抗体阳性率达90％以上，幼儿感染后多数无明显症状，或引起轻症咽炎和上呼吸道感染。青年期发生原发感染，约有50％出现传染性单核细胞增多症。主要通过唾液传播，也可经输血传染。eb病毒在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染b淋巴细胞，被病毒感染的细胞具有eb病毒的基因组，以环状dna形式游离在胞浆或整合于染色体内，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染。目前eb病毒临床检测的主流方法为血清学检测，主要检测患者血清中的vca、ea或ebna1等抗原，同时也可以结合荧光定量pcr的方法对eb病毒潜伏期表达基因ebna进行检测，从而确定患者eb病毒感染情况。eb病毒可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的eb病毒活化形成得复发感染。研究表明eb病毒主要导致原发性疾病为传染性单核细胞增多症，此外还与多种人类恶性肿瘤如burkitt淋巴瘤、鼻咽癌及免疫缺陷患者的b淋巴细胞瘤等多种癌症的发生密切相关。

大量研究表明，nk-92细胞为eb病毒阳性细胞(drexlerhg,dirksw,macleodraf,steubekg,uphoffcc.catalogueofhumanandanimalcelllines.8^thed.dsmz:braunschweig,2001.)，在基于nk-92为基础的细胞免疫治疗中，病人存在潜在性致病风险。国内临床相关法规已明确规定用于异体细胞治疗的产品要进行内外源病毒因子检测，且不得检出包含hiv、hbv、hcv、ebv、htlv、cmv等在内的外源性病毒(《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》，临床研究用人外周血来源nk细胞制剂规范》)。

目前国内外尚无eb病毒阴性nk-92细胞株构建报道，为了进一步增加nk-92细胞在细胞免疫治疗领域的应用，去除eb病毒可能带来的潜在致病性，成为一种必然趋势。

技术实现要素：

针对上述目的，本发明的目的是提供一种eb病毒阴性的nk-92细胞及其制备方法，从而得到一种安全的nk-92细胞，为后续以nk-92为基础的免疫细胞药物治疗奠定基础。

本发明一方面提供一种用于eb病毒敲除的sgrna，包括与cas9配合使用的至少一个sgrna，所述sgrna用于敲除eb中的ebna1(ebvnuclearantigen1)、orip(originofreplication)、epha2(ephrinreceptora2)、balf4或lmp等其它重要区域。

在本发明的优选实施例中，当所述sgrna为两个sgrna时，所述两个sgrna分别为sgrna1或sgrna2，所述sgrna1的序列如seqidno:1所示或其同源序列；所述sgrna2的序列如seqidno:2所示或其同源序列。

优选地，所述sgrna1或sgrna2的同源序列与原序列的同源性均为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。

本发明的另一方面提供一种用于eb病毒敲除的系统，包括上述的sgrna及与其配合使用的cas9，所述cas9与sgrna相配合，构成用于阻断eb病毒复制的复合物。

在本发明的优选实施例中，所述系统还包括质粒载体，所述cas9设在所述载体上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述cas9的氨基酸序列如seqidno:3所示或其同源序列。

优选地，所述同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。

优选地，所述系统为crispr-cas9系统。

本发明的又一方面提供一种eb病毒阴性的nk-92细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)设计用于eb病毒敲除的至少一个sgrna，再将其扩增得到用于eb病毒敲的sgrna，所述sgrna用于敲除eb病毒中的ebna1(ebvnuclearantigen1)、orip(originofreplication)、epha2(ephrinreceptora2)、balf4或lmp等其它重要区域；

2)将所述用于eb病毒敲的sgrna和cas9配合使用，形成用于阻断eb病毒复制的rnp复合物，即用于eb病毒敲除的系统；

3)再将所述rnp复合物转入nk-92细胞中，再通过流式分选筛获得eb病毒阴性的nk-92细胞。

在本发明的优选实施例中，在步骤1)中，当所述sgrna为两个sgrna时，所述两个sgrna分别为sgrna1或sgrna2；所述sgrna1的序列如seqidno:1所示或其同源序列，所述sgrna2的序列如seqidno:2所示或其同源序列。

优选地，所述sgrna1或sgrna2的同源序列与原序列的同源性均为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。

在本发明的优选实施例中，在步骤2)中，所述系统还包括质粒载体或蛋白，所述cas9设在所述载体上。

在本发明的一个具体实施方式中，在步骤2)中，所述cas9的氨基酸序列如seqidno:3所示或其同源序列，所述同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。

优选地，所述系统为crispr-cas9系统。

本发明的又一方面提供一种上述制备方法得到的eb病毒阴性的nk-92细胞。

本发明的有益效果是利用crispr/cas9基因编辑技术成功去除了nk-92细胞中携带的eb病毒，获得了eb病毒阴性的nk-92细胞株；提高了nk-92细胞的安全性，为后续以nk-92为基础的免疫细胞药物治疗奠定基础，并通过实验表明，其性能和杀伤性能未变。

附图说明

构成说明书的一部分的附图描述了本发明的实施例，并且连同描述一起用于解释本发明的原理。

参照附图，根据下面的详细描述，可以更加清楚地理解本发明，其中：

图1为本发明实施例3中构建的crispr-orip-sgrna载体的结构示意图；

图2为本发明实施例4中制得的eb病毒阴性nk-92细胞的多克隆细胞流式分选结果，其中，nk-92-nc为nk-92阳性对照，orip-ko-plasmid为去除eb病毒的nk-92；

图3a为本发明实施例4中制得的含有clone8的eb病毒阴性nk-92细胞的电泳结果图，其中，pc表示eb病毒正对照，nc表示eb病毒负对照，clone8表示筛选得到的eb病毒阴性的nk-92细胞-nk-92-c8；

图3b为本发明实施例4中制得的含有clone39的eb病毒阴性nk-92细胞的电泳结果图，其中，pc表示eb病毒正对照，nc表示eb病毒负对照，clone39表示筛选得到的eb病毒阴性的nk-92细胞-nk-92-c39；

图4为本发明实施例4中筛得的nk-92-c8和nk-92-c39的表型图；

图5为本发明实施例4中通过试剂盒检测nk-92-c8和nk-92-c39细胞中的eb病毒的pcr结果，其中的ebv-ko-clone8和ebv-ko-clone39分别表示敲除ebv后的nk-92细胞(clone8和clone39)，nc为负对照，其他为标准品；

图6为本发明实施例5中的nk-92-c8和nk-92-c39细胞中crispr-orip-sgrna质粒残留检测结果，其中，1为负对照，2为正对照，3为nk92细胞，4为nk-92-c8细胞，5为nk-92-c39细胞，6为marker；

图7为本发明实施例5中的nk-92-c8和nk-92-c39的倍增时间结果；

图8为本发明实施例6中的nk-92-c8和nk-92-c39的表面marker检测结果图；

图9为本发明实施例6中的nk-92-c8和nk-92-c39的杀伤能力检测结果图。

具体实施方式

现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。

以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。

除非特别指明，本文中的“nk-92-c8”、“nk92-c8”以及“eb病毒-ko-c8”均指“从59个克隆中筛选得到的eb病毒阴性的nk92细胞克隆8”。

除非特别指明，本文中的“nk-92-c39”、“nk92-c39”以及“eb病毒-ko-c39”均指“从59个克隆中筛选得到的eb病毒阴性的nk92细胞克隆39”。

除非特别指明，本文中的“nc”均指“负对照”，“pc”均指“正对照”。

实施例1：sgrna的设计

使用crisprgold网站(https://crisprgold.mdc-berlin.de/index.php)设计用于orip敲除的sgrna，选取2条sgrna，分别命名为sgrna1(seqidno:1：tgggaggtggcggcatatgc)和sgrna2(seqidno:2：atggcaacattagcccaccg)，然后将其合成，用于后续实验。

实施例2：px330a-sgrna1和px330s-sgrna2载体的构建

将sgrna1和sgrna2，分别与px330a和px330s酶切连接，即将sgrna1和sgrna2分别构建至px330a和px330s载体中，得到含有sgrna1或sgrna2重组载体，分别命名为px330a-sgrna1及px330s-sgrna2，再将得到的重组载体转化dh5a中，将其培养，再将培养后的菌液抽质粒测序，证明sgrna1和sgrna2分别插入px330a-sgrna1及px330s-sgrna2中，构建正确。

实施例3：crispr-orip-sgrna载体的构建

将实施例2得到的重组载体px330a-sgrna1和px330s-sgrna2进行酶切连接，得到crispr-orip-sgrna载体(如图1所示)，所述crispr-orip-sgrna载体中连接有cas9,所述cas9的氨基酸序列如seqidno:3(mdkkysigldigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd)所示；再将得到的crispr-orip-sgrna载体转化至dh5a中，将其培养，再将培养后的菌液抽质粒测序，证明sgrna1和sgrna2均插入crispr-orip-sgrna载体中，构建正确。

实施例4：eb病毒阴性nk-92细胞的制得

1.crispr-orip-sgrna质粒电转nk-92细胞

1.1预先在t25培养瓶中加入10mlα-mem-full培养基，co2恒温培养箱中预热，从4℃冰箱中取出电转缓冲液至室温；

1.2取适量nk-92细胞至50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；

1.3加入20mlpbs重悬细胞沉淀，1000rpm离心5min，弃上清；

1.4加入适量pbs重悬细胞沉淀，吹打均匀后细胞计数；

1.5取2.0×10⁶细胞至1.5ml离心管中，1500rpm离心5min，弃尽上清，加入20μl电转液重悬细胞沉淀；

1.6取3.0μgcrispr-orip质粒加入到细胞悬液中，轻柔混匀后转移至电极管中，按340v/20ms，300v/70ms的电转条件进行电转(celetrix电转仪：ctx-1500a-le)；

1.7电转结束后，转移所有样品至含预热培养基的t25培养瓶中，co2恒温培养箱中培养。

2.单克隆细胞流式分选

2.1pbs+0.2％fbs分选液配制：取10mlpbs至15ml离心管中，加入20μlfbs后混匀；

2.2转移待分选细胞至50ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清；

2.3加入适量pbs清洗细胞沉淀并细胞计数，1500rpm离心5min，弃上清；

2.4加入适量pbs+0.2％fbs分选液重悬细胞沉淀，用40um滤网过滤细胞悬液，转移至15ml离心管中，冰上放置待分选；

2.5选取fitc通道进行多克隆细胞分选，分选结束后，转移细胞至t25培养瓶中，co2恒温培养箱中培养，多克隆细胞流式分选结果如图2所示。

2.6再参照前述步骤进行单克隆细胞流式分选，共分选10块96孔培养皿，得到59株单克隆nk-92细胞。

3.pcr方法dna水平检测单克隆细胞，初步筛选eb病毒阴性的nk-92细胞，具体如下：

取适量培养的59株单克隆nk-92细胞，参照细胞基因组抽提试剂盒说明书提取细胞基因组，再将提取的基因组dna通过pcr扩增，所用的引物：bclf1-f-700：cggcaggttacccaccattag(seqidno:4)和bclf1-r-700：ggactcaccggaaaaagccg(seqidno:5)所示，取得到eb病毒阴性的nk-92细胞的电泳结果进行展示，扩增的pcr结果的电泳结果如图3a-b所示，从中筛选得到两个eb病毒阴性的nk-92细胞，分别为图中的clone8和clone39，分别命名为nk-92-c8和nk-92-c39，然后通过显微镜，于10×40倍下观察其表型，并以nk-92作为对照，结果如图4所示。

4.通过试剂盒检测nk-92-c8和nk-92-c39细胞中的eb病毒

eb病毒检测试剂盒(广州华银医药，货号hy01159)

4.1取适量nk-92-c8和nk-92-c39细胞，提取细胞基因组，提取方法参考“细胞基因组抽提试剂盒说明书dp304；

4.2提前30min取出eb病毒核酸检测试剂盒(qpcr)中试剂室温融化，混匀后离心；

4.3确定实验反应数n＝9(n＝阴性对照(1)+定量标准品(5个，分别为ri-ko-plasmid、s1-5*10e7、s2-5*10e6、s3-5*10e5和s4-5*10e4)+待检样品数+2)，将配制好的qpcr反应液混匀后离心，设置qpcr仪eb病毒检测通道为fam(465nm-510nm)，内参检测通道为cy5(610nm-670nm)，进行pcr反应，结果如图5及下述表1所示。

表1

从上述图5和表1可以看出：nk-92-c8和nk-92-c39检测获得的ebvcp值均大于35，根据试剂盒说明，判定nk-92-c8和nk-92-c39为eb病毒阴性的细胞，说明本发明制得的nk-92-c8和nk-92-c39细胞确实为eb病毒阴性的nk-92。

实施例5：nk-92-c8和nk-92-c39细胞中crispr-orip-sgrna质粒残留检测

取适量培养的nk-92、nk-92-c8和nk-92-c39，参照细胞基因组抽提试剂盒说明书提取细胞基因组，再将提取的基因组dna及crispr-orip-sgrna质粒通过pcr扩增，所用的引物：crispr-test-f：gaaaacggccggaagagaatg(seqidno:6)和crispr-test-r：gtctgtcgggatcgactgtg(seqidno:7)所示，检测结果如图6，不同引物在nk-92-c8和nk-92-c39均为扩增到目的片段，表明nk-92-c8和nk-92-c39细胞中不存在crispr-orip-sgrna质粒残留，crispr-orip-sgrna没有整合到nk-92-c8和nk-92-c39基因组dna中。

实施例6：eb病毒阴性nk-92细胞倍增时间的检测

1.取nk-92-c8和nk-92-c39，1500rpm离心5min，弃上清；

2.加入适量α-mem-full培养基重悬细胞沉淀，细胞计数；按1.0×10⁵/ml，30ml的细胞量接种至t75培养瓶，co2恒温培养箱中培养。

3.细胞每培养2-3天后，重复3.12.1和3.12.2操作，继续培养；

4.重复3.12.1和3.12.2操作5次以上；

5.计算细胞倍增时间，计算公式：dt＝t*[lg2/(lgnt-lgno)]，t为培养时间(天)，no为首次记下的细胞数，nt为t时间后的细胞数，检测结果如图7所示，从图中可以看出，与nk-92细胞相比，nk-92-c8和nk-92-c39细胞倍增时间均有所延长，但彼此相差不显著，倍增时间分别为nk-92(24.7h)，nk-92-c8(25.5h)，nk-92-c39(25.7h)，说明本发明的敲除eb病毒的nk-92细胞的性能为未改变。

实施例7：eb病毒阴性nk-92细胞表面marker检测

1.取适量nk-92-c8，nk-92-c39和nk-92细胞至1.5ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清；

2.加入500μlpbs清洗细胞沉淀，将细胞转移至1.5ml离心管中，2500rpm离心5min，弃上清；

3.加入100μlpbs重悬细胞沉淀，加入2ul表面marker抗体避光染色20min；

4.加入500μlpbs清洗细胞，2500rpm离心5min，弃上清；

5.加入500μlpbs清洗细胞，2500rpm离心5min，弃上清；

6.加入100ulpbs重悬细胞沉淀，选择合适检测通道流式检测，检测结果如图8所示，从图8可以看出其表面marker的表达情况，说明nk-92-c8可能与nk-92更为接近，检测的部分表面markers无显著差异，nk-92-c39中激活受体nkp44的阳性率略高于nk-92和nk-92-c8细胞，说明本发明的敲除eb病毒后的eb病毒阴性的nk-92细胞，其性能未改变。

实施例8：eb病毒阴性nk-92细胞杀伤能力的检测

1.靶细胞处理

1.1取适量培养的k562细胞至50ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清；

1.2加入1mlpbs重悬细胞，加入适量cfse(20ulcfse/1.0×10⁶cells)混匀后37℃染色20min；

1.3染色结束后，加入20mlpbs清洗细胞，1500rpm离心5min，弃上清；

1.4加入20mlpbs清洗细胞，1500rpm离心5min，弃上清；

1.5加入适量imdm-full培养基重悬细胞，细胞计数后调整靶细胞密度至1.6×10⁵/ml。

2.效应细胞处理

2.1取适量培养的nk-92-c8和nk-92-c39细胞至50ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清；

2.2加入适量α-mem-full培养基重悬细胞，细胞计数后调整效应细胞密度至8.0×10⁵/ml。

3.细胞杀伤与流式检测

3.1按0.5:1，1:1，5:1三种效靶比，取适量效应细胞和靶细胞至24孔培养皿中，反应总体积为1ml，体积不足的用α-mem-full培养基补足，将铺好的细胞置于co2恒温培养箱中反应2h；

3.2反应结束后，取出细胞，6000rpm离心5min，弃上清；

3.3加入1mlpbs，6000rpm离心5min，弃上清；

3.4每管细胞加入5μl7-aad染色30min，流式检测，检测通道为fitc+，percp+；

3.5计算每种细胞杀伤的效率，计算公式：杀伤率(％)＝(杀伤流式值％-对照流式值％)/(1-对照流式值％)，检测结果如图9所示，结果表明获得的eb病毒去除的nk-92-c8和nk-92-c39对k562均有不同程度的杀伤功能，不同效靶比条件下，nk-92-c39对靶细胞的杀伤功能与nk-92基本无差异，nk-92-c8对靶细胞的杀伤功能稍弱于nk-92，说明本发明的敲除eb病毒后的eb病毒阴性的nk-92细胞，其杀伤性能未受影响。

综上，利用crispr/cas9基因编辑技术成功去除了nk-92细胞中携带的eb病毒，获得了eb病毒阴性的nk-92细胞株；提高了nk-92细胞的安全性，为后续以nk-92为基础的免疫细胞药物治疗奠定基础；并通过实验表明，与未进行eb病毒敲除的nk-92细胞相比，该eb病毒阴性的nk-92细胞的性能和杀伤性能未改变。

本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

序列表

<110>阿思科力（苏州）生物科技有限公司

<120>eb病毒阴性的nk-92细胞及其制备方法

<130>1068

<160>7

<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列

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151015

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505560

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115120125

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