一种人A组轮状病毒的RPA-LFD检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种人a组轮状病毒的rpa-lfd检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用。

背景技术：

轮状病毒是引起婴儿与幼儿腹泻的主要病原体之一，主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪-口途径，临床表为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，严重出现脱水和电解质紊乱症状，如不及时纠正，可导致死亡。根据1986-2000年轮状病毒性腹泻病例统计，全世界每年因轮状病毒感染导致的5岁以下低龄儿童腹泻病例约有1.11亿，约2500万例患儿需要寻医就诊，200万人需要住院治疗，其中死亡人数高达352,000-592,000人，且病患人数逐年增加。在我国轮状病毒感染的发病率高达30％-40％，这种现状不仅对我国婴幼儿的生活质量构成了严重的威胁，而且也对我们国家的医疗资源造成了巨大的损失。因此，对轮状病毒进行及时、准确的检测，对其预防控制和临床诊治至关重要。

轮状病毒(rotavirus，简称rv)是一种双链rna病毒，属于呼肠孤病毒科，含有11个分阶段的基因片断，每个rna片段各编码1种蛋白，包括6种结构蛋白(vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7)和5种非结构蛋白(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5)。根据其内层衣壳蛋白(viralprotein，vp)-6的组特异性抗原表位，轮状病毒可分为a～g共7组，其中a组最为常见，是造成婴幼儿急性重症性腹泻的主要病原，且感染超过90％的病例是由该组毒株引起。目前对人a组轮状病毒的快速诊断技术包括直接血凝技术、基因检测技术、酶联免疫技术等，但这些检测方法耗时并且准确性不高。如直接血凝技术主要从唾液、粪便等分泌物中检测轮状病毒，其结果不易重复，需要有经验的技术人员。基于抗原-抗体的酶联免疫吸附试验技术，是从识别病原相关蛋白对病原体进行免疫学检测的方法，可根据不同检测目的设计特异的包被抗体和标记抗体，但由于免疫学的方法灵敏度低，不能在发病早期就检测出轮状病毒，因此可能会导致误诊，增加病人的负担。pcr技术灵敏度高，可从痕量样品中检测出目标分子，这对医院和社区环境中的感染控制、预防、治疗很有意义；但其开展条件要求严格，需要精密昂贵的检测仪器、实验室环境及专业操作人员，并且耗时长，需要电泳判定结果，很难推广于基层卫生部门，尤其在农村及部队野外训练等条件艰苦地区，不利于轮状病毒的现场快速检测。因此，要实现人a组轮状病毒的感染监控，亟待建立一种特异性好，灵敏度高，方法简单，耗时短，能快速检测人a组轮状病毒的新检测技术。

重组酶聚合酶扩增技术是一种新型恒温核酸扩增技术，其扩增原理是，重组酶与引物结合形成复合物后，寻找匹配的dna同源序列，紧密结合发生重组，在单链dna结合蛋白的作用下，模板dna开始解链，引物与模板dna配对，在bsudna聚合酶的作用下复制延伸，对目的片段进行指数级扩增(forgetetal.,2012)。rpa整个过程仅需要在37-42℃等温条件下反应15-20分钟即可得到扩增产物，不需要高温变性和退火的过程，整个反应简单、快速、高效。rpa与侧流层析技术相结合(rpa-lfd)，可以在水浴锅或者直接用人体温进行加热，将温度控制在37-42℃之间，随后可直接通过侧向流动层析试纸条读取实验结果。在整个反应体系中，需要生物素标记的反向引物和羧基荧光素(fam)标记的特异探针，该探针在距羧基荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dspacer)，该位点可被大肠杆菌核酸外切酶nfo进行识别并切割，产生自由的羟基末端，然后便在dna聚合酶的作用下延伸，形成具有生物素和羧基荧光基团双标记的rpa产物。将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记的抗fam的抗体结合，形成三元复合物，通过层析膜扩散，被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线。rpa-lfd检测体系操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强，可在常温下反应，可用肉眼直接观察结果，能脱离对电力、仪器及专业实验人员的依赖，非常适于基层卫生部门应用，尤其是现场及野外环境。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人a组轮状病毒的rpa-lfd检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本发明提供的用于检测人a组轮状病毒的rpa核酸试纸条试剂盒，具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作方法简单等优点。

本发明是这样实现的，一种人a组轮状病毒的rpa-lfd检测引物和探针，所述引物的序列见seqidno.7和seqidno.11所示，所述探针的序列见seqidno.14所示。

本发明还披露了一种人a组轮状病毒的rpa核酸试纸条检测试剂盒，包括如上述的引物和探针序列，还包括通用型核酸检测试纸条，下游引物seqidno.11的3’端修饰生物素基团biotin；探针seqidno.14的5’端修饰5-羧基荧光素基团fam，中间修饰四氢呋喃thf，3’端修饰c3spacer。

进一步地，还包括重组酶等温扩增试剂盒，所述重组酶等温扩增试剂盒包括重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液rehydrationbuffer、280mm醋酸镁溶液和去离子水。

本发明还披露了如上述的人a组轮状病毒的rpa-lfd检测引物和探针在非诊断目的的人a组轮状病毒检测中的应用。

本发明还披露了如上述的人a组轮状病毒的rpa核酸试纸条检测试剂盒在非诊断目的的a组轮状病毒检测中的应用。

进一步地，所述应用的方法包括以下步骤：(1)配置rpa反应体系，在装有rpa冻干酶粉的twistampnfokit反应管中加入29.5μlrehydrationbuffer，2.1μl10μm上游引物，2.1μl10μm下游引物，0.6μl10μm探针，9.2μl双蒸水，4μl病毒dna模板，在反应管盖上加280mm醋酸镁溶液2.5μl，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心；37-42℃恒温反应8-25min；

(2)检测：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，2-5min观察结果；

(3)结果判读：

①阴性：仅在质控区一条蓝色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所检测的样本没有a组轮状病毒感染；

②阳性：出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明所检测的样本为a组轮状病毒病毒感染；

③无效：质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

进一步地，步骤(1)中恒温反应条件为37℃反应10min。结束后通过侧向流动层析试纸条对结果进行检测。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明针对人a组轮状病毒的vp6基因，建立并评估了基于rpa核酸试纸条检测试剂盒。rpa所需的引物长度为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp。

(1)本发明采用rpa核酸检测试纸条建立可视化检测人a组轮状病毒的试剂盒，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为人a组轮状病毒的非诊断目的的现场检测提供了一种灵敏、可靠的新方法。

(2)采用本发明的引物和探针组合，通过rpa核酸试纸条技术对人a组轮状病毒进行检测的方法，具有较高的灵敏度、特异性和重复性。本发明选用的人a组轮状病毒vp6基因引物是经过大量试验筛选获得的，特异性好，与其他病毒包括柯萨奇a16等无交叉反应。rpa能够将痕量的核酸模板扩增到可以检测的水平；本发明所建立的检测方法可检测到的100拷贝数/反应的人a组轮状病毒。

(3)本发明所述的rpa核酸试纸条技术检测人a组轮状病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和现场的人a组轮状病毒的检测。

(4)本发明所述的rpa核酸试纸条技术与常规pcr技术相比，不用经过变性、退火、延伸三个步骤，在常温(最适温度在37～42℃之间)下10min左右即可完成反应，检测速度快。

(5)本发明所建立的检测方法可以在常温等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不需要复杂的样品处理，且不需要复杂的仪器设备(如pcr仪、荧光定量pcr仪、电泳仪、电泳槽等)，适用于现场检测。

附图说明

图1是人a组轮状病毒rpa扩增引物筛选；

图2是rpa核酸试纸条检测体系特异性分析；1，gi型诺如病毒；2，肠道病毒71型；3、柯萨奇a16；4，柯萨奇a6；5，人a组轮状病毒；

图3是rpa核酸试纸条检测体系灵敏度分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明披露了一种人a组轮状病毒的rpa-lfd检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用，具体如下实施例所示。

本发明中涉及的twistampnfokits购自twistdx公司；通用型核酸检测试纸条(杭州优思达生物技术有限公司)；核酸提取试剂盒(德国qiagen公司)；引物及探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；m-mlv反转录酶；rna酶抑制剂；dntp(2.5mm)；琼脂糖购自takara公司。

除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克(sambrook)、弗里奇(fritsch)和马尼亚蒂斯(maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(molecularcloning:alaboratorymanual)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.奥苏贝尔(f.m.ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(methodsinenzymology)系列(学术出版公司)：《pcr2:实用方法》(pcr2:apracticalapproach)(m.j.麦克弗森(m.j.macpherson)、b.d.黑姆斯(b.d.hames)和g.r.泰勒(g.r.taylor)编辑(1995))、哈洛(harlow)和拉内(lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(antibodies：alaboratorymanual)，以及《动物细胞培养》(animalcellculture)(r.i.弗雷谢尼(r.i.freshney)编辑(1987))。

实施例1rpa核酸试纸条试剂盒及检测方法的建立

1、a组轮状病毒rpa引物与探针序列的设计与优选

本发明本实施例根据ncbi(美国国立生物技术信息中心)genbank数据库查询人a组轮状病毒vp6基因同源序列并进行比对分析，选取人a组轮状病毒vp6基因的多个保守区域，根据rpa引物设计原则，针对所选取的保守区域设计引物和探针，以期能够检测到较多的人a组轮状病毒。

本发明所选保守区域序列来自于genbank中的kf371941.1,kf371888.1,kf372007.1,mf580849.1,kf371952.1,kf371855.1,mn106125.1,lc172693.1,lc172827.1,mf469445.1,mf469325.1,mn551991.1等人a组轮状病毒vp6基因，经过同源序列比对分析，确立了以seqidno.1-3所示区域序列为基于rpa核酸试纸条检测系统的人a组轮状病毒核酸检测位点。

本发明依据rpa扩增技术要求，即引物长度30～35bp、扩增产物100～500bp，具有较高扩增效率，选取了rpa扩增产物大小在200～300bp之内作为检测位点序列。

本发明根据rpa引物及探针设计原则，应用引物设计软件primepremier5.0针对上述选取a组轮状病毒vp6基因不同保守区域进行引物及探针设计，设计的引物及探针由上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成与标记，具体序列如下表所示：

表1rpa所用的引物与探针

2、a组轮状病毒rpa凝胶检测体系的建立：

本发明以提取纯化的病毒dna为模板，针对上述选取人a组轮状病毒vp6基因不同保守区域，设计引物及探针，再根据rpa凝胶检测的结果，从中选择最佳检测位点及引物。实验步骤如：

(1)配置rpa初始反应体系：

(2)rpa凝胶检测反应步骤：将上述47.5μl缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2ml的twistampnfokit反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μl的280mm的醋酸镁溶液，混匀后反应即刻发生；

(4)将反应管放入37℃的金属恒温箱中，处理5min；

(5)反应5min后，取出反应管，再次混匀后继续放入37℃的金属恒温箱中反应20min；

(6)反应结束后，用2％的琼脂糖电泳鉴定，得出最佳检测位点及引物。

3、a组轮状病毒rpa核酸试纸条检测体系的建立

①rpa探针设计：探针5’端标记fam基团，中间thf替代g或c(dspacer)，且dspacer两侧尽量避免g、c，dspacer与5’端至少30碱基，与3’端至少15碱基，3’端c3-spacer修饰。

②根据rpa引物设计原则，针对人a组轮状病毒保守区段设计的4对引物，并分别以a组轮状病毒基因组dna为模板进行rpa扩增，经琼脂糖凝胶电泳进行检测如图1，引物对rpa-rvf4及rpa-rvr4的rpa扩增产物在154bp位置得到一条清晰、单一的条带，而其他引物扩增得到的电泳条带模糊且特异性差，由此确定引物对rpa-rvf4及rpa-rvr4为最佳。

在筛选出的检测位点及引物中，将探针相对应的引物的5’标记生物素(biotin)。rpa-lfd反应体系引物与探针序列如下所示：

上游引物：5’-acttgaatttctgatccagcattaagccac-3’，seqidno.7；

下游引物：5’-biotin-ggaatttacaaaatagaagacaacgtactgga-3’，seqidno.11；

探针：

5’-fam-gttcccattaaattatcatgcattggttgagat/thf/tatttaaagtaaatg-c3spacer-3’，seqidno.14；

③具体实现步骤如下所示：

(1)以病毒cdna为模板作为阳性对照，以ddh2o为阴性对照，以阴性细胞液或阴性血液组织提取的基因组为控制对照，分别加入下列组分：

(2)rpa核酸试纸条检测反应步骤：将上述47.5μl缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2ml的twistampnfokit反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μl的280mm的醋酸镁溶液，混匀后反应即刻发生；

(4)将反应管放入37℃的金属恒温箱中，反应8-15min；

(5)反应结束后，吸取5μl加入到含95μl的试纸条缓冲液(杭州优思达生物技术有限公司)中，将试纸条插入到混合液中，等待3～5min，通过试纸条的显色进行判读。通过对检测样品是否出现假阳性及阳性样品检测出条带的深浅来判定所用的探针。

4、a组轮状病毒rpa核酸试纸条检测条件的优化

①首先，本发明分别试验了15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃不同反应温度，并且将孵育时间设定为30min。rpa核酸试纸条方法的最佳反应温度为35℃-45℃，并选择37℃作为该方法的反应温度。

②其次，在37℃作为最佳反应温度条件下，本发明分别试验了0min、1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min不同孵育时间对于扩增结果的影响，rpa核酸试纸条方法的最佳孵育时间为10min，并作为该该方法的反应时间。

③最后，在37℃恒温扩增10min的条件下，本发明分别试验了引物在反应体系中的终浓度为420nm、150nm、120nm、90nm、60nm、30nm、15nm、3nm，探针在反应体系中的终浓度为120nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、1nm。rpa核酸试纸条方法的引物最佳反应浓度为15nm-420nm，探针最佳反应浓度为5nm-120nm。

④本发明提供的rpa核酸试纸条试剂盒检测人a组轮状病毒的结果判定：样品在特定的条件下(37℃，10min)试纸条上质控线和检测线都出现条带的为阳性样品；仅在质控线上出现条带，为阴性样品。

实施例2人a组轮状病毒rpa核酸试纸条检测体系特异性分析

为了检验人a组轮状病毒rpa核酸试纸条检测方法的特异性，本发明使用了人a组轮状病毒、gi型诺如病毒、肠道病毒71型、柯萨奇a16、柯萨奇a6等的基因组作为特异性对照组，用rpa-lfd方法进行检测分析。反应体系如具体步骤所示，反应条件为确定的优化条件，反应结束后滴加到试纸条检测。得到的结果为：以人a组轮状病毒基因组为模板的人a组轮状病毒rpa核酸试纸条，出现两条红色条带，一条位于检测区(t)内，另一条位于质控区(c)内；以gi型诺如病毒、肠道病毒71型、柯萨奇a16、柯萨奇a6等的基因组分别为模板的人a组轮状病毒rpa核酸试纸条，仅在质控区(c)出现了一条蓝色条带，在检测区(t)内无红色条带出现。实验结果如图2所示。结果显示检测体系特异性良好，可特异的检测到猪瘟病毒，且用核酸检测试纸条检测，操作更方便、省时。

实施例3a组轮状病毒rpa核酸试纸条方法的灵敏度分析

1、标准样品制备

选取genbank登录号为kf37194.1的人a组轮状病毒vp6基因作为检测靶标，其序列由上海生工生物工程技术有限公司合成，并插入puc57载体得到重组质粒。按照omega质粒抽提试剂盒提取重组质粒，通过紫外分光光度计测定浓度计算出拷贝数，实验中的用以制备标准质粒的a260/a280的od值需在1.8～2.0。将合格的标准质粒原品进行10×稀释，依次获得10⁹copies/μl、10⁸copies/μl、10⁷copies/μl、……直到10⁰copies/μl的标准品。

2、灵敏度分析

吸取上述标准质粒各稀释度1μl为模板，按照扩增反应温度为37℃的水浴锅中进行，时间设定为10min，通过核酸检测试纸条检测扩增结果。从图3结果可以看出，该方法的敏感性为10²拷贝/反应。并且具有较广的检测范围，至少在10⁹-10³拷贝/反应范围内的样品均能被检测出来。

相比于传统的pcr及荧光定量pcr，本发明操作更为简单，所需时间更短，对操作人员的技术要求不高；同时本发明的检测条件更适用于现场及院内人a组轮状病毒快速筛查，能够方便、准确地对人a组轮状病毒进行检测。

实施例4临床样本检测应用

选取96例临床粪便样本，用荧光定量pcr仪与本方法同时进行检测，发现荧光定量方法的检测结果与本发明所述方法的检测结果一致，检出阳性标本92例，阴性4例。具体过程如下：

1、标本处理

采用柱式病毒rna提取试剂盒(北京百奥雷博公司，btn71001)进行标本rna快速提取：

(1)向0.3mg粪便中加入0.3ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀；

(2)将上一步样本经5000rpm离心1min，取0.2ml上清加入到装有0.6mlrna病毒裂解液的离心管中，涡旋15秒，混匀；

(3)室温静置10min后，在样品中加入0.8ml上柱结合液，颠倒混匀后转移一半的混合液(0.8ml)到离心吸附柱中，室温放置2分钟；

(4)12000rpm室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中；

(5)将剩余的另一半裂解液(0.8ml)转移到离心吸附柱中，室温放置2分钟；

(6)重复(4)；

(7)加入0.7ml通用洗柱液到离心吸附柱，12000室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中；

(8)12000室温离心30秒；

(9)在离心吸附柱的滤膜中部分加入30-100μlrna洗脱液，然后将离心吸附柱套入一新的1.5ml离心管中，室温放置2分钟；

(10)12000室温离心1分钟，离心管中收集的样品即为rna。

2、逆转录扩增

将2.5μlrna模板加入到逆转录预混液a后首先在65℃保温5min，随后冰上迅速冷却。将上一步产物5μl全部转移至逆转录预混液b中后缓慢混匀，42℃反应30min后95℃保温5min使酶失活，最后冰上放置备用。

逆转录预混液a：每5μl反应体系的组成如下：随机引物(50μm)0.5μl，dntp混合物(10mm)0.5μl，用于逆转录扩增的水补足至2.5μl；

逆转录预混液b：每10μl反应体系的组成如下：逆转录缓冲液2μl，逆转录酶0.5μl，rpa酶抑制剂0.25μl，用于逆转录扩增的水补足至5μl。

3、rpa扩增

将37.25μlrpa扩增预混液(1管nfo干粉试剂、rpa扩增的缓冲液29.5μl、浓度为10μm的上下引物各2.1μl、浓度为10μm的探针0.6μl、水3.2μl)加入到上一步装有cdna反应管中，再在各反应管中加入280mm乙酸镁2.5μl，混匀后立即进行rpa扩增，37℃反应10min。

4、试纸条检测

取5μlrpa扩增产物，加入100μl试纸条检测缓冲液，混匀后插入试纸条反应5～15min，最后判读结果。

96例标本的检测结果与荧光定量结果完全一致，其中阳性标本92例，阴性标本4例。

从上述实施例检测结果来看，本发明能准确地检测出临床标本中人a组轮状病毒，检测快速、灵敏且特异，整个实验过程可以在1个小时内完成；操作步骤较少，整个过程无需特殊的仪器设备，且结果直接肉眼观察，实验操作简捷。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>上海予泉生物科技有限公司

<120>一种人a组轮状病毒的rpa-lfd检测引物和探针、核酸试纸条检测试剂盒及应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>211

<212>dna

<213>rotavirus

<400>1

cgacatggaggttctgtattcattgtcaaaaactcttaaagatgctagggataagattgt60

tgaaggtacattatattctaatgttagcgatcttattcagcaatttaatcaaatgatagt120

aaccatgaacggaaatgactttcaaactggaggaattggcaatttacccattagaaattg180

gacatttgactttggcctactaggtactacg211

<210>2

<211>266

<212>dna

<213>rotavirus

<400>2

gaggcattgagaaagctagccggtattaaatttaaaagaataaacttcaataattcatca60

gaatatatagaaaattggaatttacaaaatagaagacaacgtactggatttgtttttcat120

aaacctaatatatttccatactcagcatcatttactttaaatagatctcaaccaatgcat180

gataatttaatgggaaccatgtggcttaatgctggatcagaaattcaagtggctggattt240

gactattcgtgtgctctaaatgctcc266

<210>3

<211>225

<212>dna

<213>rotavirus

<400>3

ccagttggaccagtatttccaccaggcatgaattggactgagctgattactaactattca60

ccatctagggaagataatttgcaacgtgtctttacagtagcctctatcagaagcatgtta120

attaagtgaggaccagactaactatctggtatccaatcttagttagcatgtagctatatc180

aagtcattcagactctacaagtaaggacatggctccatgttcgct225

<210>4

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cgacatggaggttctgtattcattgtcaaaaactc35

<210>5

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gaggcattgagaaagctagccggtattaaat31

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ccagttggaccagtatttccaccaggcatg30

<210>7

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

acttgaatttctgatccagcattaagccac30

<210>8

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ccaaagtcaaatgtccaatttctaatgggt30

<210>9

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ggagcatttagagcacacgaatagtcaaatcc32

<210>10

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ctaagattggataccagatggttagtctggtcc33

<210>11

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

ggaatttacaaaatagaagacaacgtactgga32

<210>12

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

tagcgatcttattcagcaatttaatcaaatatagtaaccatgaacgga48

<210>13

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tgcaacgtgtctttacagtagcctctatcaaagcatgttgattaagt47

<210>14

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

gttcccattaaattatcatgcattggttgagattatttaaagtaaatg48