[0001]
本发明涉及一种生物发酵产品的制备方法，尤其是涉及一种纳豆激酶粉的制备方法。
背景技术：
[0002]
纳豆产自日本，传统上是利用稻草上的纳豆菌接种于煮熟的大豆发酵而成。
[0003]
1980年日本心脑血管专家须见洋行博士发现纳豆中的纳豆激酶具有很强的溶解血栓能力。自此，纳豆激酶的研究开发进入了一个全新的时代。人们分别在菌种选育、培养物选择及处理、发酵方式、纳豆激酶提取等方面进行了大量的研究。
[0004]
cn201910588314.0公开了一种纳豆激酶的生产菌株及其生产方法，其采用的菌种为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的枯草芽孢杆菌( bacillus subtils natto )st-1086，cgmcc编号 no.17895。培养基碳源选择为葡萄糖、蔗糖，氮源选择为酵母粉、蛋白胨、大豆粉、鹰嘴豆粉等，37℃～40℃液体发酵12～24小时，陶瓷膜过滤后超滤膜过滤，喷雾干燥（或冷冻干燥、真空干燥）制备。
[0005]
cn201910170277.1公开了一种纳豆激酶液态发酵培养基及生产纳豆激酶的发酵方法，其用黄豆粉、蔗糖、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、纯水配制生产纳豆激酶的液态发酵培养基（ph=7 .2～7 .6）。
[0006]
cn201610562331.3公开了一种固态发酵制备纳豆激酶的方法，用发酵花生粕生产纳豆激酶的方法。
[0007]
cn201310149128.x公开了一种纳豆激酶的提纯及制备方法，用柱层析提取纳豆激酶的方法。
[0008]
所有这些方法，均存在发酵周期较长，易感染杂菌，效率较低，制备成本较高，产品活性欠佳的缺陷。
技术实现要素：
[0009]
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种发酵周期短，不易感染杂菌，效率高，制备成本较低，产品活性好的高活性纳豆激酶的制备方法。
[0010]
本发明解决其技术问题差一点技术方案是，一种高活性纳豆激酶的制备方法，包括以下步骤：发酵种子液制备；大豆浸泡磨浆及蒸煮；加蛋白酶酶解；加葡萄糖、无机盐、灭菌，配制成发酵培养基；接种及通气发酵，添加保护剂，干燥。
[0011]
具体操作步骤如下：（1）发酵种子液制备：在无菌环境下，将枯草芽孢杆菌用接种环挑出1～2环接种到灭菌后的新鲜斜面培养基上，在37℃培养箱中培养20～24h，得到活化后的枯草芽孢杆菌；将活化后的枯草芽孢杆菌在无菌条件下挑取1～2环到已灭菌的种子液培养基中，在37℃、100～150r/min条件下振荡培养15～20h，得发酵种子液，备用；（2）熟豆浆制备：将大豆浸泡6～8小时，沥水、清洗干净，按浸泡前大豆:水=1:3～3.5的
质量比进行磨浆，过滤，得除渣后的生豆浆；生豆浆通入蒸汽在0.10～012mpa压力下进行加热，沸腾后3~5分钟停止加热，得熟豆浆；（3）熟豆浆酶解：在熟豆浆中加入相当于熟豆浆重量0.1～0.3%的复合蛋白水解酶，调ph为7.0～7.2，在酶解罐中55～60℃恒温酶解80～120分钟，得酶解好的豆浆；（4）发酵培养基配制：将酶解好的豆浆按体积比5～8倍水量进行加水稀释，在稀释后酶解豆浆中按每升液体分别加入8～12克的葡萄糖，0.1～0.5克的氯化钙、0.2～08克的硫酸镁、0.8～1.5克的磷酸二氢钾、0.8～1.5克的磷酸氢二钾，充分溶解，121℃灭菌15分钟，冷却至35～37℃，得发酵培养基；（5）接种、发酵：按发酵培养基体积的6～10%接种步骤（1）制得的发酵种子液，恒温36～37℃，搅拌，保持发酵罐内气压为0.04~0.05mpa，通气发酵16～20小时；（6）保护剂添加：发酵结束后，在发酵液中加入麦芽糊精作为干燥保护剂，并搅拌均匀；（7）干燥。
[0012]
进一步，步骤（1）中，振荡培养的时间为16～18h进一步，步骤（3）中，在熟豆浆中加入相当于熟豆浆重量0.2%的复合蛋白水解酶；恒温酶解的时间为90～110分钟，进一步，步骤（5）中，发酵时间为17～19小时，通气量为，每1升发酵液每分钟通入0.9升空气，发酵罐内气压维持为0.04mpa。
[0013]
进一步，步骤（6）中，所述麦芽糊精添加量为，麦芽糊精添加后，麦芽糊精占总发酵液的重量为15～25%。
[0014]
进一步，步骤（7）中，所述干燥为喷雾干燥。
[0015]
进一步，所述喷雾干燥的工艺参数为：热风进风温度135～140℃，出风温度控制在84～86℃，雾化频率250~260赫兹。
[0016]
步骤（2）中，豆浆加热煮熟过程中，应当注意尽量撇除豆浆液面产生的泡沫；撇除泡沫有利于后面的发酵操作，因为发酵时，会产生气体，泡沫过多，会造成“跑液”损失。
[0017]
关于步骤（3），酶解步骤是本发明创造性设置的特别步骤。研究表明，酶解步骤可将豆浆中的蛋白质分解成小分子的多肽和氨基酸，有利于枯草芽孢杆菌对氮源的利用，产酶效率高，产酶多。
[0018]
关于步骤（6），本发明创造性地将麦芽糊精作为干燥保护剂加入发酵液中，使后续将发酵液进行喷雾干燥时，能大幅减少纳豆激酶在高温环境中酶活的损失；研究表明，同等干燥条件下，加干燥保护剂麦芽糊精的，纳豆激酶活性要比没加的平均高20%左右。同时，研究表明，适当提高发酵液中固形物的含量，能提高喷雾干燥的效率，减少喷雾干燥所需能耗。
[0019]
另外，本发明方法采用液态发酵，与传统固态发酵相比，具有发酵周期短，产酶多，产品纯度高的特点；发酵条件容易控制，可自动化控制，特别是避免了固态发酵过程容易染杂菌的缺点。
[0020]
本发明方法制得的高活性纳豆激酶粉，激酶活性达3万～4.5万iu单位（以尿激酶计）。
具体实施方式
[0021]
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
[0022]
各实施例采用的发酵菌种枯草芽孢杆菌是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的枯草芽孢杆菌( bacillus subtils natto )st-1086，cgmcc编号 no.17895。
[0023]
各实施例使用的复合蛋白水解酶购自安琪酵母股份有限公司。
[0024]
实施例1（1）发酵种子液制备：在无菌环境下，将枯草芽孢杆菌用接种环挑出2环接种到灭菌后的新鲜斜面培养基上，在37℃培养箱中培养24h，得到活化后的枯草芽孢杆菌；将活化后的枯草芽孢杆菌在无菌条件下挑取2环到已灭菌的种子液培养基中，在37℃、150r/min条件下振荡培养18h，得发酵种子液，备用；（2）熟豆浆制备：将大豆浸泡7小时，沥水、清洗干净，按浸泡前大豆:水=1:3.2的质量比进行磨浆，过滤，得除渣后的生豆浆；生豆浆通入蒸汽在0.10mpa压力下进行加热，沸腾后3分钟停止加热，得熟豆浆；豆浆加热煮熟过程中，撇除豆浆液面产生的泡沫；（3）熟豆浆酶解：在熟豆浆中加入相当于熟豆浆重量0.2%的复合蛋白水解酶，调ph为7.0，在酶解罐中55℃恒温酶解80分钟，得酶解好的豆浆；（4）发酵培养基配制：将酶解好的豆浆按体积比的6倍水量进行加水稀释，在稀释后酶解豆浆中按每升液体分别加入8克的葡萄糖，0.1克的氯化钙、0.5克的硫酸镁、0.8克的磷酸二氢钾、0.8克的磷酸氢二钾，充分溶解，121℃灭菌15分钟，冷却至35～37℃，得发酵培养基；（5）接种、发酵：按发酵培养基体积的7%接种步骤（1）制得的发酵种子液，恒温36℃，搅拌，通气发酵16小时，罐内气压保持0.05mpa，通气量按每1升发酵液每分钟通入0.8升空气计算；（6）保护剂添加：发酵结束后，在发酵液中加入麦芽糊精作为保护剂，并搅拌均匀，添加后，麦芽糊精占总发酵液的重量为12%；（7）干燥，对添加了保护剂的发酵液进行喷雾干燥，热风进风温度135℃，出风温度控制在84℃，雾化频率250赫兹；所得干燥粉末即为高活性纳豆激酶粉。
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采用琼脂糖—纤维蛋白原平板法检测检测所得高活性纳豆激酶粉的激酶活性，达3.8万iu单位（以尿激酶计）。
[0026]
实施例2（1）发酵种子液制备：在无菌环境下，将枯草芽孢杆菌用接种环挑出1环接种到灭菌后的新鲜斜面培养基上，在37℃培养箱中培养24h，得到活化后的枯草芽孢杆菌；将活化后的枯草芽孢杆菌在无菌条件下挑取1环到已灭菌的种子液培养基中，在37℃、120r/min条件下振荡培养20h，得发酵种子液，备用；（2）熟豆浆制备：将大豆浸泡8小时，沥水、清洗干净，按浸泡前大豆:水=1:3.5的质量比进行磨浆，过滤，得除渣后的生豆浆；生豆浆通入蒸汽在0.12mpa压力下进行加热，沸腾后5分钟停止加热，得熟豆浆；豆浆加热煮熟过程中，撇除豆浆液面产生的泡沫；（3）熟豆浆酶解：在熟豆浆中加入相当于熟豆浆重量0.2%的复合蛋白水解酶，调ph为7.2，在酶解罐中58℃恒温酶解100分钟，得酶解好的豆浆；
（4）发酵培养基配制：将酶解好的豆浆按体积比的6倍水量加水稀释，在稀释后酶解豆浆中按每升液体分别加入11克的葡萄糖，0.2克的氯化钙、0.5克的硫酸镁、1.0克的磷酸二氢钾、1.0克的磷酸氢二钾，充分溶解，121℃灭菌15分钟，冷却至35～37℃，得发酵培养基；（5）接种、发酵：按发酵培养基体积的10%接种步骤（1）制得的发酵种子液，恒温37℃，搅拌，通气发酵20小时，保持罐压0.04mpa，通气量按每1升发酵液每分钟通入1升空气计算；（6）干燥保护剂添加：发酵结束后，在发酵液中加入麦芽糊精作为干燥保护剂，并搅拌均匀，添加后，麦芽糊精占总发酵液的重量为25%；（7）干燥，对添加了干燥保护剂的发酵液进行喷雾干燥，热风进风温度140℃，出风温度控制在86℃，雾化频率260赫兹；所得干燥粉末即为高活性纳豆激酶粉。
[0027]
采用琼脂糖—纤维蛋白原平板法检测所得高活性纳豆激酶粉的激酶活性，达4万iu单位（以尿激酶计）。