一种可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及生物发酵和蛋白分离工程领域，尤其涉及一种可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法。【
背景技术：
】[0002]血栓病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，据估计，全世界有血栓病患者约1500万人，其中每年死于心脑血栓疾病的就高达1200万人，纳豆激酶是一种相较传统的溶栓药物尿激酶(Urokinase;UK)、链激酶(Streptokinase;SK)等具有更强的溶栓性并不引起体内出血反应的丝氨酸蛋白酶[Sumi,Hamada,H.Hamada,H.Tsushima,H.Mihara,andH.Murak1.〃Anovelfibrinolyticenzyme(nattokinase)inthevegetablecheeseNatto;atypicalandpopularsoybeanfoodintheJapanesediet,Experientia43，n0.10(1987):1110-1111中有报道]。在体外实验中表现出了强烈的降低红细胞聚合物，降低血液粘度切应力的作用[Pais,Eszter,TamasAlexy,RalphE.HolsworthJr,andHerbertJ.Meiselman.,,Effectsofnattokinase,apro-fibrinolyticenzyme,onredbloodcellaggregat1nandwholebloodviscosity/.Clinicalhemorheologyandmicrocirculat1n35，n0.1-2(2005):139-142中有报道]。能够明显缩短优球蛋白的溶解时间并激活静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂来溶解血栓，纤溶活性可在血液中保持3小时以上[Sumi，Hiroyuki，HirokiHamada,KoichiroNakanishi,andHajimeHiratan1."Enhancementofthefibrinolyticactivityinplasmabyoraladministrat1nofnattokinases.〃Actahaematologica84,n0.3(1990):139-143中有报道]。纳豆激酶由于来源广泛、价格低廉、溶栓活性高、特异性强、副作用低而被认为是很有前途的新一代抗栓药，成为溶栓酶的研究热点，日本已有10余家公司生产出多种以纳豆激酶为主要成分或添加剂的产品。美国国际医卫生技术制药公司纳豆激酶胶囊也已面市，并注巨资研发相关产品。韩国和朝鲜也相继有类似产品问世。在我国，纳豆激酶类产品有黑龙江微生物研究所研制的纳豆激酶制剂一恩开胶囊，燕京啤酒公司的纳豆胶囊，湖南贵生坊的纳豆素胶囊，北京龙兴的纳豆激酶胶囊等。但真正用于急救的纳豆激酶注射针剂的生产情况目前还鲜有报道。[0003]随着纳豆激酶的发现，许多与纳豆激酶具有类似氨基酸序列，但产自其他微生物的纤溶酶被陆续报道，其来源尤以芽孢杆菌属的细菌为多，如SubtilisinDFE,SubtilisinQK2，以及ChoggokkinaselI^iEPeng,Yong,XiaojuanYang,andYizhengZhang."Microbialfibrinolyticenzymes:anoverviewofsource,product1n,properties,andthrombolyticactivityinviv0.Appliedmicrob1logyandb1technology69.2(2005):126-13中有记载3等。因此芽孢杆菌也被认为能够产生种类繁多的纤溶酶，这些酶都具有强纤溶活性，高同源性等特点，其中许多都具有被开发为食品被充剂，药剂等的潜能，而大部分这些酶由于纯化手段的限制而缺乏足够的数量对其进行深入研究。[0004]纳豆激酶是胞外酶，可以利用纳豆菌的发酵液提取，传统的分离纯化技术有[Fujita,Mitsugu,KeiichiNomura,KyongsuHong,YaeIto,AkiAsada,andSatoshiNishimur0."Purificat1nandcharacterizat1nofastrongfibrinolyticenzyme(nattokinase)inthevegetablecheesenatto,apopularsoybeanfermentedfoodinJapan,B1chemicalandb1physicalresearchcommunicat1ns197,n0.3(1993):1340-1347]所采用的多层次盐析法，但酶回收入率偏低(18%-50%)。另外还有层析柱层析法，但这些方法基本上都存在酶活力低，生产率低，生产成本高等问题。为此很多学者尝试了很多不同的分离纯化技术，如金属螯合双水相亲合分离、反胶团相转移分离、磁性高分子微球分离、泡沫分离以及扩张床吸附分离等，均取得不同程度进展。纳豆激酶制剂通常会带有一种独特的气味，这种气味令很多非日本裔人群感到厌恶，而纯的纳豆激酶为无臭、无味的白色或淡黄色粉末，产品的纯度级别问题是限制纳豆激酶发展瓶颈〖如郭希娟，张丽萍."纳豆激酶的保健功能及分离提取技术研究.〃农产品加工学刊(2006):31-33和史丰坤，刘建军，赵祥颖.“纳豆激酶分离纯化技术的研究山东轻工业学院学报(自然科学版)(2008):24-27中的记载3。因此，越来越多的学者都致力于高效、简便并且成本低廉的纳豆激酶纯化方法的开发。【
发明内容】[0005]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，旨在提供一种简单有效，产率高，试剂消耗少，酶纯度高，操作单元可灵活放大缩小，适用于不同数量级酶制备，耗时少，成本低的可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法。[0006]本发明所述方法所采用的技术方案是，该方法包括以下步骤:(1)配置固体培养基，灭菌，冷却；(2)固体发酵:往冷却后的固体培养基内接入纳豆枯草芽孢杆菌进行发酵产生纳豆激酶；(3)粗酶液收集:发酵完成后，用无菌水洗涤固体培养基，洗液经过滤去除不可溶杂质，再加入硫酸铵沉淀得到粗酶，通过冷冻复溶去糖类得到粗酶液；(4)缓冲液置换:粗酶液用超滤法去除残留的硫酸铵，然后进行缓冲液置换；(5)酶纯化:利用强阴离子柱进行初步提纯，经初步提纯后收集到的酶液用超滤法进行精细提纯，得到纯化纳豆激酶。[0007]进一步地，所述步骤(I)和步骤(2)所述的固体培养基是将黄豆、MgCl2和双蒸水的混合物加入5?10倍体积的容器中，温度为30?36°C，时间为48?80h进行培养得到，灭菌，冷却待用，其中黄豆、MgCh和双蒸水的质量/质量/体积比为w/w/v=10:1:5。[0008]进一步地，所述步骤(3)中，所述无菌水的体积为固体培养基体积的1倍，在每毫升洗液中添加的硫酸铵为0.56g。[0009]进一步地，所述步骤(4)中的超滤法使用的超滤膜孔径为5?8kDa，采用的缓冲液为30mMpH9.1?9.5的Na2CO3SNaHCO3o[0010]进一步地，所述步骤(5)所述的强阴离子柱填料为QHP，其流动相A为30mMpH9.1?9.5的Na2CO3或NaHCO3,流动相B为含IMNaCl的流动相A;先用17?20倍柱体积流动相A冲洗柱子使柱子达到平衡，然后上样，使用5?8倍柱体积的流动相A冲洗，在3?5个柱体积内线性增加流动相B至100%，收集洗脱液为第2个柱体积至流动相B之前的部分。[0011]进一步地，所述步骤(5)中的超滤法使用的超滤膜孔径为20kDa，收集穿透部分，经冷冻干燥，得纯度大于90%的纳豆激酶。[0012]更进一步地，所述步骤(3)中，无菌水洗涤固体培养基后得到的洗液用纱布过滤除去菌体及不溶性杂质，其余杂质使用11500rpm,20min离心除去。[0013]本发明的有益效果是:本发明采用固体发酵法生产纳豆激酶，然后用硫酸铵盐析完全沉淀酶，超滤置换缓冲液后用QHP强阴离子柱对酶进行粗分，最后用20kDa超滤膜进行粗细分离，得到纳豆激酶;本发明仅涉及到盐析，超滤、柱层析、超滤四步，操作单元极少，操作方法简单，耗时短，成本低;本发明所涉及到的柱层析为阴离子交换柱，离子交换柱填料成本远低于一般纯化所用的亲和柱，并且易于放大，可实现工业化生产，本发明试验了5ml,20ml,300ml不同体积的离子交换柱，结果证明放大后纯化结果类似，纯化倍数与回收率几乎不变;故本发明的纯化制备方法简单有效，回收高，试剂消耗少。制得的纳豆激酶纯度高，操作单元简单，耗时短，在纳豆激酶的研究与工业化应用方面有良好的前景。【附图说明】[0014]图1是用5ml离子交换柱进行纯化所得的洗脱图，目标酶产生在第1.8至4.9倍柱体积洗脱液;图中的线I表示280nm处的紫外吸收值，线2表示冲洗过程中的电导值。[0015]图2是用20ml离子交换柱进行纯化所得的洗脱图，目标酶产生在第1.8至4.9倍柱体积洗脱液;图中的线I表示280nm处的紫外吸收值，线2表示冲洗过程中的电导值。[0016]图3是用300ml离子交换柱进行纯化所得的洗脱图，目标酶产生在第1.8至4.8倍柱体积洗脱液;图中的线I表示280nm处的紫外吸收值，线2表示冲洗过程中的电导值。【具体实施方式】[0017]下面，以具体实施例对本发明方法作详细的说明。本发明采用的原材料可在市场购得。[0018]实施例一:称取10克大豆及IgMgCl2,添加双蒸水10ml，置于100ml烧杯中，121°C，20min灭菌，待冷却后，接种一环纳豆枯草芽孢杆菌。3当前第1页1 2