一种人源溶菌酶蛋白纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及一种纯化人源溶菌酶蛋白的方 法。本发明还涉及该生产方法的应用。
【背景技术】
[0002] 随着生物技术的发展，获得蛋白的方法越来越多，经典的蛋白质分离纯化过程通 常包括W下步骤；（1)破碎生物组织，用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；(2)用离必法将 细胞的亚细胞颗粒（如细胞核、线粒体、微粒体或核糖体等及细胞碎片去除；（3)应用盐析 法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；(4)进一步应用层析法或电泳使各种蛋白质 分开；（5)如果用可能的话，将蛋白质结晶或制成冻干粉。
[0003] 用该方法获得人源蛋白需考虑W下问题；第一，人组织来源少，而目的蛋白含量 高、活性高可溶性稳定性好的组织来源就更少了；第二，每个分离纯化的步骤都会损失一定 量的蛋白及蛋白活性，但是分离步骤太少又不能达到一定的纯度；第H，每个分离纯化的步 骤中所用的试剂及相关参数对不同的蛋白的适用范围都是不同的；第四，不同蛋白的精确 定性定量通常需要特定的方法。
[0004] 随着生物化学的发展，肤的人工合成已成为可能，然而送种方法只适合于合成含 有十几个氨基酸残基的小蛋白，况且化学仪器中合成的蛋白是否与天然存在的蛋白具有一 致的构象与功能还有待于进一步研究。
[0005] 目前，运用基因工程技术也可W在大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物等多种表达体 系中高效表达，但是送种生产蛋白的方法同样涉及到分离纯化的问题。
[0006] 溶菌酶是分解粘多糖的多肤类免疫抗菌分子。它具有耐热、耐酸的理化特性，可溶 于水、己醇、油脂类溶剂，通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。对溶菌酶杀 菌能力研究表明：极微量的溶菌酶即可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、巨大芽抱杆菌、棒状杆 菌、乳酸杆菌、细球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常见细菌。目前市场上的溶菌酶都是来 源于其他种属动物机体，对人体而言是异体蛋白，有很强的抗原性，副作用大。
[0007] 天然人溶菌酶主要存在于人乳汁、唾液、眼泪、胎盘等分泌物和器官中，由于来源 受限且不易提取，所W价格昂贵。目前，科研人员已利用化学合成法或从人类细胞组织中制 备cDNA等途径获得人溶菌酶基因，一些已经在真菌、细菌、动物反应器等体系中得到表达， 但是产量非常有限，不能满足其在食品、医药、畜牧等行业的广泛应用。
[0008] 目前，分离纯化工艺的建立一般都经过实验室研究、中间试验生产到工业规模生 产线的放大过程。毕赤酵母在表达重组人溶菌酶的过程中会产生色素物质，使发酵液呈黄 绿色，同时还会产生杂蛋白、核酸等杂质，因此需要对发酵液进行纯化处理，才能用于后续 研究。目前关于溶菌酶的分离纯化方法，主要有结晶法、离子交换法和亲和色谱法。结晶法 是最传统的制备溶菌酶的方法，主要是根据溶液条件，使溶菌酶W结晶态析出，该方法操作 简便，成本很低，但是产率偏低，很难获得高纯度产品；W亲和为基础的分离技术存在处理 量比较小，亲和介质价格昂贵的弊端；离子交换法是最常用的提纯方法，该方法是利用溶液 中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异从而分离出目的蛋白，简便、高效、可自动 化连续操作，但现存的问题是，发酵液为无机盐培养基，离子浓度很高，上样前需对发酵液 进行稀释W降低离子强度，否则色谱柱填料刚性小，及易被堵塞，造成再生使用的麻烦，造 成了分离速度和效率低下。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、成本低廉、产品纯度高的人溶菌 酶纯化方法，W达到工艺周期短、收率高，易于线性放大至生产规模的目的。
[0010] 为了解决上述技术问题，本发明建立了复合型阳离子交换介质分离纯化发酵液中 人源溶菌酶的新工艺；发酵液经离必、过滤处理后无需稀释可直接上柱纯化，经一步纯化目 的蛋白即达到电泳纯。首先采用复合型阳离子交换柱Bestarose MMC Diamond捕获蛋白，然 后用凝胶过滤柱Bestdex G-25进行缓冲液置换，最后用阳离子交换柱SP Bestarose FF浓 缩目的蛋白，最终蛋白浓度可达27mg/mL ;每一步收率分别为92. 67%、91. 9%和94. 68%， 总蛋白收率为80. 63%，纯化倍数约15倍；HPLC检测终产品为单一峰，纯度大于99%。
[0011] 本发明的人源溶菌酶蛋白纯化方法包括W下步骤：
[001引发酵液的前处理；
[0013] Bestarose MMC Diamond 捕获；
[0014] Bestdex G-25 缓冲液置换；
[001引浓缩目的蛋白。
[0016] 发酵液的前处理主要包括去除含有人溶菌酶溶液中的固体杂质、调整酸碱度等。
[0017] 本发明中，将含有人溶菌酶溶液的抑调至中性偏酸，与后续层析柱缓冲液的抑值 相匹配。同时，利用滤膜去除溶液中的小颗粒杂质。
[0018] 去除杂质时，可W先将溶液离必，收集上清，然后使用中空纤维超滤膜处理上清 液，进一步除去样品中的小颗粒物质。
[0019] 调节抑值时，将含重组人源溶菌酶的发酵液调抑至6. 5,然后12000巧m，离必 15min，收集上清液。然后，加入 Bestarose MMC Diamond 缓冲液 B(1.5M 化Cl，20mM ΡΒ,ρΗ 6. 5)调节样品电导使其与缓冲液Α(0.4Μ化Cl，20mM ΡΒ,ρΗ 6. 5)电导一致（约43ms/cm)， 即为Bestarose MMC Diamond柱上样原样。
[0020] 本发明中，含有人溶菌酶溶液可W直接采用人溶菌酶溶液的发酵液。
[0021] Bestarose MMC Diamond捕获需要根据目标产品的理化性质，选择合适的色谱条 件。
[002引人源溶菌酶为碱性蛋白，等电点较高（pi W 10)，其最适抑^6.5,室温下在中性 盐溶液中有较高的天然活性。故纯化过程中选择缓冲液的抑接近中性，W避免样品在分离 纯化过程中发生变性。而在抑中性条件下人源溶菌酶带正电荷，因此传统工艺中一般选用 阳离子交换介质（如SP、CM)作为人溶菌酶的纯化介质。
[0023] 平衡缓冲液平衡5个柱体积，至层析柱流出液的抑、电导与平衡缓冲液一致，将上 述处理后样品W 30mL/min流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗3~5个柱体积直到基 线稳定，即所有未结合的物质都被冲洗出分离柱。然后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，根据 UV280洗脱峰收集样品。
[0024] 本发明的一个实施例中，采用的层析柱和缓冲液的条件如下：
[00巧]层析柱；BXK 50/30, Vt = 300血。
[0026] 平衡缓冲液 A ;0. 4M 化C1，20mM PB，抑 6. 5。
[0027] 洗脱缓冲液 B ;1. 5M 化C1，20mM PB，抑 6. 5。
[0028] 由于Bestarose MMC Diamond柱的洗脱样品体积较大，蛋白质浓度较低，需要对样 品进行浓缩才能达到要求。
[0029] 本发明使用SP Bestarose FF柱进行样品浓缩，故在浓缩之前需对样品进行缓冲 液置换，使其电导小于l〇ms/cm(Besta;rose MMC Diamond柱洗脱样品电导约为135ms/cm)。
[0030] 本发明的一个实施例中，Bestdex G-25缓冲液置换时采用的层析柱和缓冲液的条 件如下：
[0031] 层析柱；BXK 200/500, Vt =化。
[003引 平衡缓冲液；20mM NaAC (醋酸钢，CHsCOONa)，抑4. 75。
[0033] 平衡缓冲液平衡2个柱体积，至层析柱流出液的pH、电导与平衡缓冲液一致，将 Bestarose MMC Diamond洗脱样品W 200血/min流速上样，上样体积应小于1.化。上样结 束后继续用平衡缓冲液清洗，根据UV280峰收集样品。
[0034] 本发明采用SP Bestarose FF浓缩目的蛋白。
[0035] 平衡缓冲液平衡3~5个柱体积，至层析柱流出液的抑、电导与平衡缓冲液一致， 将置换过缓冲液的样品W 20mL/min流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗3~5个柱体 积直到基线稳定，即所有未结合的物质都被冲洗出分离柱。然后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋 白，根据UV280洗脱峰收集样品。
[0036] 本发明的一个优选例中，采用SP Bestarose FF浓缩目的蛋白的层析柱和缓冲液 的条件如下：
[0037] 层析柱；BXK 50/30, Vt = 280ml。
[0038] 平衡缓冲液；20mM NaAC，抑 4. 75。
[0039] 洗脱缓冲液；0. 15M化C1，20mM PB (磯酸盐缓冲液），抑7. 5。
[0040] 本发明的创新如下：
[0041] 1.建立了复合型阳离子交换介质分离纯化发酵液中人源溶菌酶的新工艺：发酵 液经离必、过滤处理后无需稀释可直接上柱纯化，经一步纯化目的蛋白即达到电泳纯。首先 采用复合型阳离子交换柱Bestarose MMC Diamond捕获蛋白，然后用凝胶过滤柱Bestdex G-化进行缓冲液置换，最后用阳离子交换柱SP Bestarose FF浓缩目的蛋白，最终蛋白浓度 可达27mg/mL ;每一步收率分别为92. 67%、91. 9%和94. 68%，总蛋白收率为80. 63%，纯化 倍数约15倍；HPLC检测终产品为单一峰，纯度大于99%。
[0042] 2.酶学性质研究发现该酶米氏常数Km为0. 0233g/mU最适抑为6. 0,在偏酸性 条件下（pH = 5. 8~6. 4)稳定性较好，37°C赔育比后仍保持80% W上的活力；最适温度 45°C，在不同温度下耐热性有所不同，3(TC~6(TC赔育比后，酶活下降20 %，7(TC赔育比 后，酶活下降70%，但在9(TC高温赔育比后，酶活仍有60%。不同的金属离子和添加剂对 酶活的影响是；rfe\Mn2+Je2\Mg2\r和Ca2+离子不同程度地促进的活性；Zn 2\Ba2\ 化2\ Co2+抑制的活性，除了邸ΤΑ添加剂能够促进活性外，其余添加剂均对其抑制。
[0043] 3.采用牛津杯法检测h-LYZ对九株供试菌的抑菌作用，同时用微量肉汤稀释法检 测